Le CSC, a causa dell’aumentata attivazione dei checkpoint del ciclo cellulare e dei meccanismi di riparazione del genoma, oltre alla loro natura relativamente quiescente (vedi “Introduzione”), risultano essere particolarmente resistenti all’azione dei chemioterapici maggiormente utilizzati nelle terapie oncologiche, e alla radioterapia. Per tale motivo, un loro differenziamento porterebbe ad una migliore risposta delle cellule tumorali nei confronti di queste cure, con evidente vantaggio per il paziente. Abbiamo perciò valutato l’effetto dell’inibizione di PDK1 ed Aur-A sui processi di differenziamento delle neurosfere, sia tramite un’analisi morfologica su di esse, sia valutando l’espressione genica dei marker di staminalità e differenziamento in seguito ai trattamenti. Tutte le procedure dettagliate delle analisi di seguito riportate sono descritte in “Materiali e metodi”.
3.4.1 Analisi morfologica delle neurosfere
Questo tipo di analisi permette di avere una stima riguardo la capacità dei composti esaminati di indurre differenziamento nelle neurosfere, tramite la quantificazione della lunghezza delle proiezioni cellulari (neuriti). Inoltre, essa permette di evidenziare anche l’aspetto qualitativo legato all’abilità del farmaco di ridurre/arrestare la crescita della singola sfera, oppure di ridurre/inibire la formazione di nuove sfere.
Le neurosfere sono state trattate con DMSO (controllo); MP7 2,5 μM; Alisertib 1,5 μM, da soli o in combinazione; SA16 1 μM, 10 μM. Dopo 7 giorni d’incubazione, le cellule sono state analizzate come descritto in “Materiali e metodi”.
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Le cellule, quando trattate singolarmente con MP7 2,5 μM e Alisertib 1,5 μM, hanno mostrato una riduzione dell’area occupata dalle neurosfere (figura 3.7). La riduzione dell’area occupata risulta evidente in maniera particolare a seguito del trattamento con Alisertib, confermando il maggior effetto antiproliferativo dell’inibizione di Aur-A rispetto a quella di PDK1, già osservato con il saggio dell’MTS. Inoltre, in seguito al trattamento con Alisertib, le neurosfere mostravano la presenza di modeste ma significative fuoriuscite di neuriti, indice di differenziamento cellulare. Questo dimostra un significativo ruolo svolto da Aur-A in questo processo, come già osservato con l’inibitore di Aur-A AKI603, capace di indurre differenziamento nelle cellule di leucemia mieloide cronica (Long Z.J. et al., 2015).
Il co-trattamento con i due composti, alle stesse concentrazioni utilizzate per gli esperimenti in singolo, ha causato un effetto additivo/sinergico nella riduzione dell’area occupata dalle neurosfere, rispetto ai trattamenti separati, ma non nell’indurne il differenziamento, processo evidentemente sotto controllo di Aur-A e non di PDK1 (figura 3.7 B/C). Tali risultati dimostrano il ruolo predominante di Aur-A nel bloccare la proliferazione ed indurre differenziamento delle CSC.
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Figura 3.7: analisi morfologica delle neurosfere, in seguito a trattamento con Alisertib e MP7. Le cellule sono state poste in incubazione con DMSO (controllo), oppure con 1,5 μM Alisertib e 2,5 μM MP7, da soli o in combinazione, per 7 giorni. (A) Sono mostrate delle immagini al microscopio ottico delle neurosfere in seguito a 7 giorni di trattamento. (B) L’area occupata dalle neurosfere e (C) e la lunghezza dei neuriti valutati dopo 7 giorni di trattamento. I dati sono espressi come percentuale rispetto alle cellule non trattate (controllo).
Infine abbiamo valutato l’effetto di SA16, testandolo alla concentrazione di 1 μM e 10 μM, sulla morfologia delle neurosfere. Il composto ha determinato una riduzione pressoché completa dell’area occupata dalle neurosfere (figura 3.8 A/B), ed un’evidente fuoriuscita dei
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neuriti (figura 3.8 C), indice dell’avvenuto differenziamento cellulare. Il composto, alla concentrazione di 10 μM, ha mostrato attività simile nella riduzione dell’area occupata dalle neurosfere, rispetto a quella osservata in seguito al trattamento simultaneo con Alisertib e MP7. La lunghezza dei neuriti, indice di differenziamento cellulare, è risultata invece maggiore in questo caso anziché in seguito al co-trattamento.
Figura 3.8: analisi morfologica delle neurosfere, in seguito a trattamento con SA16. Le cellule sono state poste in incubazione con DMSO (controllo), oppure con SA16 1 μM e 10 μM, per 7 giorni. (A) Sono mostrate delle immagini al microscopio ottico delle neurosfere in seguito a 7 giorni di trattamento. (B) L’area occupata dalle neurosfere e (C) la lunghezza dei neuriti sono stati valutati dopo 7 giorni di trattamento. I dati sono espressi come percentuale rispetto alle cellule non trattate (controllo).
3.4.2 Analisi dell’espressione genica
Per determinare da un punto di vista quantitativo la capacità di SA16 di influire sul grado di differenziamento delle cellule di GBM, abbiamo quantificato l’espressione genica relativa ad un marker di staminalità (Nestin), e di differenziamento cellulare (GFAP; MAP2), tramite real time RT-PCR. Abbiamo inoltre caratterizzato il fenotipo delle cellule differenziate, andando a quantificare l’mRNA codificante per una proteina specifica delle cellule gliali, la proteina fibrillare acida della glia (GFAP), e l’mRNA codificante per una proteina specifica del differenziamento neuronale, la proteina associata ai microtubuli 2 (MAP2). La misurazione è stata condotta sulle CSC (figura 3.9 A), in seguito a 7 giorni di trattamento con l’inibitore duale delle chinasi PDK1 ed Aur-A.
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Sulle CSC, SA16 determina una significativa diminuzione dei livelli dell’espressione di Nestin, marker di staminalità, accompagnato da un aumento dei valori relativi alla quantità dei marker di differenziamento, sia in senso neuronale (MAP2), che gliale (GFAP) (figura 3.9). Questo conferma la capacità del composto di indurre differenziamentoe delle CSC, già evidente in seguito all’analisi morfologica delle neurosfere.
Questi dati indicano che l’inibizione contemporanea di PDK1 ed Aur-A ha l’effetto di ridurre il potenziale staminale delle cellule tumorali di GBM.
Figura 3.9: quantificazione dell’espressione dell’mRNA di marker di staminalità e di differenziamento. Le CSC sono state trattate con SA16 e poste in incubazione per 7 giorni. L’mRNA è stato estratto e retrotrascritto. È stata quindi eseguita un’analisi real time RT-PCR utilizzando primer specifici per Nestin, GFAP e MAP2. I dati sono espressi come numero di variazioni del valore dell’analita rispetto al controllo, preso come riferimento a cui è stato attribuito valore pari a 1.
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