Alla luce del ruolo centrale svolto dalle CSC nel GBM, riguardo la capacità di dar luogo a fenomeni recidivanti, associati alla comparsa di farmacoresistenza, oltre che nella sua formazione e progressione, risulta evidente la necessità di una terapia efficace anche nei confronti di questo tipo di cellule. L’elevata radio e chemioresistenza delle CSC, unita all’alta probabilità che esse sfuggano alla resezione chirurgica, è stata individuata come la principale causa dell’impossibilità attuale di una completa remissione dalla malattia. Il poter disporre di una riserva di CSC rende quindi il GBM difficile da debellare, ed è correlato alla sua pessima prognosi. Infatti, nonostante la terapia attuale sortisca discreti risultati sulle normali cellule tumorali, anche quando queste venissero del tutto eliminate dall’organismo, la patologia riprenderebbe vigore dalla sua componente staminale, insensibile a questo tipo di trattamenti.
La scelta delle proteine chinasiche PDK1 ed Aur-A, come bersaglio dei farmaci utilizzati in questo lavoro di tesi, deriva dal ruolo svolto da esse nella sopravvivenza/differenziazione delle CSC. Studi recenti hanno dimostrato come l’inibizione di PDK1 sia essenziale per indurre l’apoptosi delle CSC (Signore M. et al., 2014), mentre l’inibizione di Aur-A è stata collegata ad un effetto antiproliferativo nei confronti di esse (Hong X. et al., 2014).
Per condurre i nostri esperimenti su questo tipo di cellule, abbiamo realizzato un arricchimento in CSC, a partire dalle cellule U87MG, sotto forma di neurosfere, termine per indicare una particolare tecnica di coltura in vitro di cellule staminali neuronali in sospensione, che assumono una caratteristica forma sferica. La procedura dettagliata è
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descritta nel capitolo “Materiali e metodi”. Di seguito sono riportati gli esperimenti condotti per confermare la composizione delle neurosfere, ipotizzata a prevalenza staminale.
3.2.1 Analisi dell’espressione genica
La formazione di neurosfere di GBM, è stata ottenuta sospendendo le cellule U87MG in un mezzo NSC (Neuronal Stem Cell), come descritto in “Materiali e metodi”. Conformemente con i dati presenti in letteratura, le neurosfere hanno confermato essere composte da una frazione maggiore di CSC, rispetto alle cellule coltivate in adesione (Piccirillo S. et al., 2006). Per questa verifica si è proceduto alla quantificazione dell’mRNA estratto dalle cellule U87MG, e dalle neurosfere da esse derivato, tramite analisi real time RT-PCR, codificante per alcuni marker di staminalità o differenziamento. Abbiamo determinato l’espressione dei geni CD133 e Nestin, associati al grado di staminalità delle cellule, e del gene codificante per la proteina fibrillare acida della glia (GFAP), indicatore di differenziamento astrocitario. L’espressione degli mRNA relativi a CD133 e Nestin, è risultata significativamente aumentata nelle neurosfere, rispetto alle cellule in adesione, al contrario di quella di GFAP, che si è ridotta (figura 3.3). Questi risultati hanno confermato l’avvenuto accrescimento della componente staminale all’interno di questo tipo di colture cellulari, a discapito di quella differenziata.
Figura 3.3: quantificazione dell’mRNA di marker di staminalità e di differenziamento. La formazione delle neurosfere di GBM a partire dalle cellule U87MG è stata ottenuta utilizzando un mezzo NSC (neural stem- cell). L’mRNA è stato estratto e retrotrascritto. È stata quindi eseguita un’analisi real time RT-PCR utilizzando primer specifici per Nestin, CD133 e GFAP. I dati sono espressi come numero di variazioni del valore dell’analita rispetto a quello osservato nelle cellule U87MG, preso come riferimento a cui è stato attribuito valore pari a 1.
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3.2.2 Sensibilità alla Temozolomide
La chemioresistenza è una caratteristica fondamentale e ben documentata delle CSC (vedi “Introduzione”). Essa è dovuta ad alterazioni del DNA di questo tipo di cellule, che si traducono in un’aumentata attivazione dei checkpoint del ciclo cellulare e dei meccanismi di riparazione del genoma. Anche la natura relativamente quiescente delle CSC costituisce una difesa intrinseca verso alcune classi di chemioterapici, come gli agenti alchilanti/intercalanti del DNA, di cui la TMZ fa parte. Questi sfruttano la capacità del DNA di legarsi ad alcuni gruppi funzionali del farmaco, causando un errore durante la replicazione cellulare, che porta alla morte della cellula per apoptosi. È la classe di farmaci più utilizzati nella terapia farmacologica dei tumori, e la TMZ è il farmaco d’elezione per la cura del GBM.
Abbiamo perciò sfruttato tale caratteristica per caratterizzare le neurosfere, il cui maggior contenuto di CSC dovrebbe correlarsi ad una minor suscettibilità di questo tipo di cellule al trattamento con TMZ, rispetto alle cellule adese U87MG. Per verificare questa affermazione, abbiamo trattato le neurosfere e le cellule in adesione con TMZ 50 μM in mezzo completo. Trascorse 72 ore di incubazione, ne abbiamo misurato la proliferazione cellulare utilizzando il saggio dell’MTS, come descritto in “Materiali e metodi”.
Figura 3.4: valutazione della proliferazione cellulare delle U87MG-CSC e delle cellule U87MG, in seguito a trattamento con TMZ. Le cellule sono state poste in incubazione con il DMSO (controllo), oppure con TMZ 50 μM. Dopo 72 ore, si è proceduto alla misurazione della proliferazione, tramite il saggio dell’MTS. I dati sono espressi come percentuale di cellule vitali rispetto alle cellule non trattate (controllo), cui è stato attribuito valore 100%.
I dati hanno evidenziato una significativa minore efficacia del trattamento con il farmaco alchilante TMZ nelle neurosfere rispetto alle cellule in adesione (figura 3.4), attestandone quindi il maggior contenuto di CSC. Questo risultato conferma anche che la
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farmacoresistenza del GBM è dovuta principalmente alla sua componente staminale, giustificando la necessità di mettere a punto un trattamento che dimostri efficacia nell’eliminazione di questo tipo di cellule.