Questo tipo di analisi ha permesso di valutare se i composti in esame fossero in grado o meno di rallentare la crescita delle cellule staminali e di indurne il differenziamento. L’analisi morfologica delle neurosfere è stata fatta attraverso la quantificazione della loro area media, del loro numero medio e della lunghezza delle proiezioni cellulari (neuriti). Le proiezioni cellulari sono state misurate considerando il diametro medio delle singole neurosfere nel piano verticale ed orizzontale, e la lunghezza dei neuriti misurata in accordo ai protocolli presenti in letteratura (Fernando P. et al., 2005). Mentre l’analisi della vitalità tramite MTS fornisce un dato quantitativo sulla percentuale di cellule proliferanti rispetto al controllo, l’analisi della morfologia delle neurosfere permette di evidenziare anche l’aspetto qualitativo legato all’abilità del farmaco di ridurre/arrestare la crescita della singola sfera o di ridurre/inibire la formazione di nuove sfere. Inoltre, l’eventuale riduzione del numero delle sfere può dare un indice della capacità del composto di indurre la completa morte delle sfere (sia della componente staminale che della componente differenziata). Infine questo tipo di analisi permette, tramite la quantificazione della lunghezza dei neuriti, di ottenere una stima immediata riguardo la capacità dei composti d’inibire o promuovere il differenziamento neuronale delle CSC.
Esecuzione del saggio:
L’analisi morfologica è stata effettuata in multi-well da 24 pozzetti, nei quali sono state seminate circa 40 sfere/well di U87MG-CSC, trattate con DMSO (controllo); MP7 2,5 μM; Alisertib 1,5 μM, da soli o in combinazione; SA16 1 μM, 10 μM. Dopo 7 giorni, durante i quali la soluzione di mezzo addizionato con il trattamento è stata rinnovata ogni 3 giorni, le cellule sono state analizzate mediante microscopio ottico con ingrandimento 4x (barra = 100 µm) e sono state acquisite le foto di ciascun pozzetto tramite fotocamera. Per ogni concentrazione dei composti sono stati allestiti cinque pozzetti, e sono state prelevate 15 immagini per ciascuno di essi. L’area occupata dalle neurosfere formatesi è stata quantificata utilizzando il programma Image J (figura 2.9).
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RISULTATI
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3.1 Effetto dell’inibizione di PDK1 ed Aur-A sulla proliferazione delle
cellule U87MG
Dato il ruolo centrale esercitato nello sviluppo tumorale dai pathway regolati da Aur-A e PDK1, i quali risultano iperattivati nel GBM, si è voluto studiare l’effetto di una loro inibizione, sia singola che simultanea, sulla proliferazione delle cellule di glioblastoma.
Le cellule U87MG sono state pertanto sottoposte a trattamenti con i composti MP7 ed Alisertib, inibitori rispettivamente di PDK1 e Aur-A, da soli o in associazione, e con SA16, inibitore duale delle due chinasi. Le cellule, seminate in multiwell da 96 contenenti il loro mezzo di coltura, sono state trattate con DMSO (controllo), oppure i composti in esame alle varie concentrazioni. Dopo 72 ore d’incubazione, sono state sottoposte al saggio dell’MTS, per avere una stima quantitativa riguardo la loro capacità proliferativa in seguito ai differenti trattamenti. I composti in esame sono stati testati alla concentrazione pari alla IC50 nei
confronti delle rispettive chinasi, e le concentrazioni 10, 100 e 1000 volte superiori. La procedura utilizzata è quella descritta nel capitolo “Materiali e metodi”.
MP7, quando testato singolarmente (2,5 nM; 25 nM; 250 nM; 2,5μM), non ha dimostrato possedere una significativa capacità d’inibire la proliferazione delle cellule tumorali (figura 3.1). In letteratura sono presenti risultati analoghi, riguardanti l’effetto dell’inibizione della chinasi PDK1 sulla proliferazione di varie linee di cellule tumorali, coltivate in adesione. Questo suggerisce che tale proteina sia maggiormente implicata in processi diversi dalla proliferazione delle cellule di GBM, come la migrazione/invasione cellulare.
Alisertib, quando provato da solo (1,5 nM; 15 nM; 150 nM; 1,5 μM), ha lievemente ridotto la proliferazione delle cellule tumorali, con un effetto significativo alla concentrazione 1,5 μM (figura 3.1). I risultati sono in linea con quanto già riportato da Lehman et al. in alcune linee cellulari di GBM in adesione, tra cui U87MG (Lehman N.L. et al., 2012). Vista la maggiore capacità d’inibizione della proliferazione tumorale di Alisertib rispetto a MP7, si può supporre che la chinasi Aur-A, a differenza di PDK1, svolga un ruolo rilevante in questo processo.
Il trattamento simultaneo con MP7 ed Alisertib, ha portato ad una riduzione della proliferazione delle cellule tumorali in misura maggiore rispetto a quello osservato in seguito a trattamenti separati. L’effetto sinergico/additivo è stato evidente con tutte le concentrazioni testate, con una percentuale d’inibizione massimale di 58,5 ± 4,9%, alla massima concentrazione testata (figura 3.1). Ulteriori esperimenti saranno condotti per valutare se tale effetto sia di tipo sinergico oppure additivo. Questo risultato conferma la correttezza di un approccio multi-target nella terapia del GBM, per arginare quei fenomeni di adattamento e farmacoresistenza osservabili in seguito all’inibizione specifica di una delle due proteine. A tali fenomeni è infatti dovuto il fallimento di molte sperimentazioni cliniche e precliniche riguardanti inibitori selettivi di Aur-A e PDK1, nonostante il ruolo conclamato di queste proteine in molti processi tumorali, e l’eccellente affinità e selettività raggiunta dalle molecole testate nei confronti di esse (vedi “Introduzione”).
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Figura 3.1: effetto dell’inibizione di PDK1 ed Aur-A sulla proliferazione delle cellule U87MG. Le cellule sono state poste in incubazione con DMSO (controllo), oppure con le concentrazioni indicate di Alisertib ed MP7, da soli o in combinazione, per 72 ore. La proliferazione cellulare è stata quindi valutata tramite il saggio dell’MTS. I dati sono espressi come percentuale di cellule vitali rispetto alle cellule non trattate (controllo).
In seguito ai risultati ottenuti dall’inibizione contemporanea di PDK1 ed Aur-A, dove è stata evidenziata una significativa diminuzione della proliferazione delle cellule U87MG, si è valutato questo parametro, sulla medesima linea cellulare, anche dopo trattamento con l’inibitore duale SA16. Avere a disposizione una sostanza che al contempo riesca ad agire contemporaneamente su più target terapeutici, anziché somministrare di più farmaci che agiscono sugli stessi bersagli, determina una serie di vantaggi. La somministrazione di un unico principio attivo permette, infatti, una previsione più semplice e maggiormente accurata dei parametri farmacocinetici, facilitando lo sviluppo clinico della terapia; risulta più sicura per il paziente, eliminando la possibilità d’interazione farmaco-farmaco, causa di possibili effetti indesiderati; infine migliora la compliance del paziente, grazie ad un regime terapeutico più semplice.
SA16, testato a varie concentrazioni (1 nM – 10 nM – 100 nM – 10 μM – 100 μM), ha mostrato possedere una lieve capacità antiproliferativa sulle cellule di GBM dopo 24 ore (figura 3.2 A). Dopo 72 ore, invece, il composto ha determinato un’importante inibizione della crescita delle cellule U87MG, con un effetto dose-dipendente (figura 3.2 B). La massima percentuale d’inibizione osservata è stata di 49,4 ± 2,0%, comparabile a quella ottenuta in seguito al trattamento con Alisertib ed MP7 assieme (58,5 ± 4,9%). Ciò conferma quindi la legittimità dell’approccio multitarged per la terapia del GBM, in aggiunta ai vantaggi precedentemente esposti riguardo la somministrazione di un unico principio attivo.
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Figura 3.2: effetto di SA16 sulla proliferazione delle cellule U87MG. Le cellule sono state poste in incubazione con DMSO (controllo), oppure con le concentrazioni indicate di SA16, per 24 ore (A), o 72 ore (B). La proliferazione cellulare è stata quindi valutata tramite il saggio dell’MTS. I dati sono espressi come percentuale di cellule proliferanti rispetto alle cellule non trattate (controllo).