Il glioblastoma multiforme (GBM), un tumore estremamente aggressivo del sistema nervoso centrale (SNC) contraddistinto da una pessima prognosi, risulta essere la forma più frequente di neoplasia intracranica. L’attuale standard terapeutico, che si avvale dell’intervento chirurgico associato a radio e chemioterapia, risulta inefficace nel medio e nel lungo periodo, e la comparsa di recidive e fenomeni di farmacoresistenza sono la norma.
Negli ultimi anni la ricerca oncologica ha portato alla luce il ruolo svolto da parte di cellule staminali cancerose (CSC) nella genesi e nella progressione tumorale. Queste cellule sono dotate di caratteristiche staminali, quali la multipotenza e la capacità di self-renewing, ma mancano dei meccanismi di controllo che generalmente regolano i suddetti processi. La tendenza a recidivare, unita alla caratteristica farmacoresistenza del GBM, sono stati collegati alla sua sottopopolazione staminale, la quale è risultata particolarmente resistente agli attuali trattamenti terapeutici, oltre che essere responsabile dell’abbondante angiogenesi che caratterizza questo tipo di tumore. Per la guarigione da questa malattia è necessario, quindi, mettere a punto strategie terapeutiche volte all’eliminazione delle CSC, tramite il loro differenziamento, che le rende maggiormente vulnerabili ai chemioterapici, ed inducendone l’apoptosi, tramite l’inibizione di pathway specificamente alterati nella componente staminale.
A tale scopo sono state individuate due proteine, la “Phosphoinositide dependent kinase 1” (PDK1), e la proteina Aurora-A chinasi (Aur-A), che risultano alterate nel GBM, e la cui attività è collegata alla formazione, alla proliferazione ed al differenziamento delle CSC. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare l’impatto dell’inibizione di PDK1 ed Aur- A su una linea di cellule di GBM, la U87MG, e sulle CSC da esse derivate. Ciò è stato possibile grazie all’impiego di inibitori specifici delle due chinasi: MP7 ed Alisertib, inibitori rispettivamente di PDK1 e di Aur-A. Per arginare i fenomeni di farmacoresistenza riportati in letteratura, osservati in seguito all’inibizione specifica dell’una o dell’altra proteina, si sono inoltre valutate le conseguenze dell’inibizione simultanea dei due pathway. Questo è stato fatto, sia trattando le cellule in esame con i due composti simultaneamente, sia testando l’attività di una nuova molecola sintetizzata nel Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, SA16, la quale possiede affinità verso entrambe le proteine. Avere a disposizione una sostanza che riesca ad avere agire contemporaneamente su più target terapeutici, infatti,
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rispetto a somministrare farmaci diversi che agiscono sugli stessi bersagli, determina una serie di vantaggi. La somministrazione di un unico principio attivo permette una previsione più semplice e maggiormente accurata dei parametri farmacocinetici, facilitando lo sviluppo clinico della terapia; risulta più sicura per il paziente, eliminando la possibilità d’interazione farmaco-farmaco, causa di possibili effetti indesiderati; infine migliora la compliance del paziente, grazie ad un regime terapeutico più semplice.
MATERIALI
E
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2.1 Composti
SA16
SA16, il composto in esame in questo lavoro di tesi, la cui struttura è mostrata in figura 2.1, è stato scelto per la sua capacità di inibire contemporaneamente la proteina Aurora-A chinasi (Aur-A) e la “Phosphoinositide-dependent kinase 1” (PDK1). SA16 è stato selezionato e sintetizzato nel laboratorio della Prof.ssa S. Rapposelli del Dipartimento di Farmacia dell’Università di Pisa, a partire da una libreria di OXID-pyrinodil ibridi che avevano dimostrato possedere attività inibitoria verso PDK1. Quest’attività è dovuta alla combinazione di due farmacofori, capaci di interagire col sito di legame per l’ATP e con la conformazione inattiva della sequenza Asp-Phe-Gly (DFG-out) adiacente ad essa di PDK1. Essi sono la porzione piridonilica, e la porzione OXID (2-osso indolica/imadazolinica), uniti da un ponte fenil-glicinico. Poiché sono presenti vari esempi in letteratura circa la capacità degli inibitori di PDK1, con un certo grado di idrofobicità, di avere azione anche su Aur-A (OSU-03012, BX795), si è deciso d’indagare tale possibilità anche per SA16. Un saggio FRET su questo composto ha dimostrato che oltre al buon potere inibitorio verso PDK1 (IC50
= 416 nM), SA16 possedeva anche una notevole attività inibitoria nei confronti di Aurora- A (IC50 = 35 nM). Studi di docking molecolare hanno provato che SA16 esplica la sua attività
inibitoria verso PDK1 legandosi ad una tasca idrofobica fuori dal dominio catalitico di PDK1, mentre il meccanismo di inibizione di Aurora-A non è stato ancora chiarito, ma si pensa essere simile (Daniele S. et al.,2016). L’inibizione simultanea di PDK1 ed Aur-A, ampiamente coinvolte nella genesi e nella progressione del glioblastoma multiforme, rappresenta la strategia terapeutica indagata in questo lavoro di tesi per la cura di questo tipo di tumore. Per confermare la veridicità di questa ipotesi, SA16 è stato confrontato con due composti, ognuno inibitore selettivo di una sola delle due proteine chinasiche.
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Alisertib (MLN 8237)
Alisertib (MLN 8237), uno dei composti utilizzati come confronto in questo lavoro di tesi, la cui struttura è riportata in figura 2.2, è un ligando reversibile e selettivo della proteina Aurora-A chinasi (Aurora-A IC50=1,2 nM/ Aurora-B IC50=369,5nM) somministrabile
oralmente, dotato di attività inibitoria per competizione (Friedberg J.W. et al., 2014). Alisertib, il cui nome IUPAC è 4-{[9-Chloro-7-(2-fluoro-6-methoxyphenyl)-5H- pyrimido[5,4-d][2]benzazepin-2-yl]amino}-2-methoxybenzoic acid, è stato sintetizzato dalla Millennium Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Attualmente è al centro di vari clinici indirizzati alla scoperta di nuovi approcci terapeutici per la cura di alcuni tipi di tumore.
Figura 2.2: struttura del composto Alisertib, inibitore di Aurora-A.
MP7
MP7, l’altro composto utilizzato come confronto per questa tesi, la cui struttura è riportata in figura 2.3, è un inibitore potente e molto selettivo della “Phosphoinositide-dependent kinase 1” (PDK1 IC50 = 2 nM). Il composto, un derivato piridonilico, esplica la sua attività
inibitoria legandosi alla conformazione inattiva di PDK1 (DFG-out), in una regione adiacente al sito di legame dell’ATP, inducendone un cambiamento di conformazione (Nagashima K. et al., 2011). La molecola, il cui nome IUPAC è 1-[(3,4- difluorophenyl)methyl]-2-oxo-N-[(1R)-2-[(2-oxo-1,3-dihydrobenzimidazol-5-yl)oxy]-1- phenylethyl]pyridine-3-carboxamide, è stata sintetizzata da Sunesis Phamaceuticals (South San Francisco, CA) e da Biogen IDEC (Cambrige, MA).
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