Capitolo II- SOGGETTI E METODO
C) ANALISI IMMUNOISTOCHIMICA
La visualizzazione immunoistochimica è stata possibile attraverso l’utilizzo del Propidio Ioduro (PI), un reagente nucleare coniugato con un fluoroforo ad emissione nello spettro del rosso (lunghezza d’onda circa 615 nm). Le sezioni sono state immerse per circa 5 minuti nella soluzione di propidio in PBS e successivamente trasferite in PBS per il lavaggio, eseguito almeno 3 volte per 10 minuti ciascuna volta. Il lavaggio favorisce il distacco del Propidio dai siti aspecifici di legame e dunque una maggior nitidezza del segnale. Successivamente, le sezioni sono state trasferite su dei vetrini da microscopio,
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lasciate asciugare e coperte con una soluzione di Vectashield® (montante per fluorescenza) per impedire che il segnale si attenui sotto la sollecitazione della fluorescenza. I campioni così preparati possono essere conservati a 4°C fino al momento dell’uso. La visualizzazione della lesione è stata fatta attraverso l’acquisizione di immagini in formato jpeg al microscopio a fluorescenza (Leica®).
D) VALUTAZIONE NEUROCOMPORTAMENTALE
Per gli studi sul comportamento sono stati scelti i 2 animali che avevano ricevuto la più alta dose di endotelina-1, 120x2 pmol ed i corrispettivi controlli iniettati con soluzione salina sterile.
Tre differenti test comportamentali sono stati utilizzati per valutare eventuali deficit motori a partire da 7 giorni dopo la lesione ischemica. Ogni sessione di esperimento consisteva di almeno 3 prove per animale, condotte a rotazione. I dati sono stati raccolti in almeno 2 sessioni.
- Analisi del cammino (gait analysis)
Il protocollo utilizzato nell’esperimento per effettuare l’analisi del cammino, è stato parzialmente modificato da quello descritto da De Medinaceli (De Medinaceli et al 1982) [250] e per molti aspetti ha ripreso la tecnica utilizzata da Metz e Schwab (2004) [251]. Questo test permette di valutare la coordinazione degli arti ed il sostegno del peso corporeo (rotazione, lunghezza del passo). Gli
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animali sono stati sollecitati a camminare lungo una rampa larga c.ca 10 cm e lunga c.ca 100 cm, con un rifugio (un luogo in ombra) alla fine del percorso che fungeva da target per l’animale. Sulla pista è stata preventivamente posta una striscia di carta bianca e le zampe del ratto sono state colorate differenziando l’arto anteriore dal posteriore, in particolare nero per le anteriori e rosso per le posteriori. Ogni sessione di esperimento consisteva di almeno 3 prove per animale, condotte a rotazione. I dati sono stati raccolti in almeno 2 sessioni. Per ogni prova, le misurazioni sono state raccolte da una serie di almeno 6-8 passi consecutivi per determinare i valori medi di 3 parametri: rotazione, lunghezza del passo dell’arto anteriore e coordinazione tra arto anteriore e posteriore. Ogni parametro è stato misurato da ambo i lati per valutare l’unilateralità della lesione.
La rotazione dell’arto è stata definita dall’angolo formato dall’intersezione della linea passante per l’impronta del terzo dito e la macchia centrale (central pad, impronta che rappresenta l’articolazione metatarsofalangea) e la linea che passa per quest’ultima e per la central pad della successiva impronta ipsilaterale (linea che esprime la direzione di cammino dell’animale).
La lunghezza del passo è stata espressa, come già descritto da De Medinaceli (1982), dalla distanza delle impronte dei 2 piedi opposti (Distance To Opposite
Foot, TOF): la proiezione ortogonale della distanza tra l’estremità delle dita
della zampa sperimentale (nel nostro caso la zampa destra) e l’estremità delle dita della zampa successiva controlaterale è stata chiamata Experimental TOF (ETOF), mentre il Normal TOF (NTOF) è stato definito come distanza tra l’estremità delle dita della zampa non lesionata e l’estremità delle dita della lesionata.
La coordinazione arto anteriore-arto posteriore è stata definita come la distanza tra la central pad dell’arto anteriore e quella dell’arto posteriore che le si sovrappone durante l’esecuzione del passo da ogni lato del corpo.
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A B
Figura 13. Gait analysis; A: lesionato (IS 24); B: controllo (IS 25)
A
B
Figura 14. Scansioni digitali di 2 serie di impronte nella gait analysis; A: lesionato (IS 24); B:
controllo (IS 26). Notare la maggiore distanza tra l’impronta dell’arto anteriore (nera) e quella dell’arto posteriore (rossa) dal lato controlaterale al sito di iniezione (destro) nel lesionato rispetto al controllo, espressione di una minor coordinazione arto anteriore-arto posteriore del lesionato dal lato controlaterale al sito d’iniezione.
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- Test di forza della presa (grip strenght)
Il grip test si basa sul modello descritto in precedenza per valutare deficit motori nel roditore [251]. Esso consiste nell’analisi quantitativa della forza che il ratto è in grado di applicare nella presa utilizzando l’arto anteriore.
L’apparecchiatura per il grip test è costituito da un misuratore di forza connesso ad una barretta di metallo. Il test consiste nel favorire la presa di una barra connessa ad un Newton-metro da parte del ratto e nel rilevamento della forza che l’operatore deve applicare per determinare il rilascio della barra da parte dell’animale tratto per la coda. La forza di trazione a livello della coda deve essere applicata lievemente e ad una velocità costante fino al momento in cui il ratto rilascia la barra.
Il
Newton-metro registra la forza in grammi che il ratto esercita al momento del distacco delle zampe. In particolare è stata posta attenzione affinché il rilascio valido per la determinazione della forza fosse considerato quello in cui entrambi gli arti anteriori venivano allontanati simultaneamente.75
-
Prova della scala verticale (vertical ladder)Il test è tratto dal protocollo descritto in precedenti studi comportamentali sui roditori [251]. Il principio su cui si basa questa prova utilizza la propensione istintiva del ratto ad ascendere un ostacolo verticale. La scala verticale aveva un’altezza di 40 cm per una larghezza di 10 cm; i gradini di metallo erano disposti ad una distanza costante di 2 cm l’uno dall’altro. Il parametro che è stato scelto per quantificare l’abilità nello svolgimento del test è stata la rapidità. Si è inoltre deciso che qualora la salita non fosse completata entro 3 minuti o se fosse avvenuta una caduta, sarebbe stato assegnato un valore per l’esecuzione del test di 180 sec.
Figura 16. Scala verticale: lesionato (IS 23)
Tutti i test comportamentali sono stati registrati e analizzati successivamente con l’uso del software Mediacruise®.
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