ASSESSMENT ISTOPATOLOGICO
Dei 22 ratti reclutati per lo studio istopatologico soltanto uno è deceduto, verosimilmente a causa della procedura chirurgica. Nei primi 6 animali, di età P21, cui era stata iniettata una dose totale di ET-1 di 30 pmol (4) e soluzione salina (2), non è stata riscontrata nessuna lesione qualitativamente apprezzabile all’esame anatomo-patologico del tessuto cerebrale. I successivi 12 ratti, che erano stati sottoposti al protocollo d’induzione del danno rispettivamente all’età di P21(4), P18 (3) e P34 (3), con un dosaggio complessivo di ET-1 più alto, pari a 60 pmol per 5 di essi (3 animali all’età di P21, 1 all’età di P18, 1 all’età di P34) e ad 80 pmol per i restanti 5 (1 ratto all’età di P21, 2 all’età di P18, 2 all’età di P34) hanno evidenziato un certo grado di lesione all’esame anatomo-patologico. Degli ultimi 4 ratti, di età P21, che avevano ricevuto una dose totale di ET-1 pari a 120 pmol, somministrata in un unico sito in 2 di essi, in due siti nei restanti 2 animali, uno è deceduto dopo la procedura chirurgica; esso apparteneva alla coppia di ratti che avevano subìto l’iniezione in un unico sito. In questo gruppo di ratti è stata evidenziata una lesione di entità apparentemente maggiore rispetto ai precedenti.
Ad una valutazione qualitativa le dimensioni della lesione appaiono direttamente proporzionali alla dose di endotelina-1 utilizzata. Le lesioni si approfondano entro gli strati superficiali della corteccia motoria del ratto determinando una evidente disorganizzazione perilesionale (vedi fig. 24 in allegato).
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ASSESSMENT NEUROCOMPORTAMENTALE
I test comportamentali sono stati effettuati su quattro animali di età P21. Tali ratti erano stati ripartiti in un gruppo di due individui con induzione della lesione con endotelina-1 al dosaggio totale di 240 pmol ed un gruppo dei restanti due trattati con soluzione salina.
Sono stati quindi effettuati i test neurocomportamentali a partire da sette giorni dopo l’induzione della lesione (per i valori delle singole prove vedi tabella 3 in allegato).
Alla prova del cammino i risultati ottenuti sono stati i seguenti:
a) Lunghezza media del passo nei ratti lesionati dal lato controlaterale al sito di iniezione (destro) 4,42 ± 0,25 cm; dal lato ipsilaterale al sito di iniezione (sinistro) 4,91 ± 0,14 cm.
b) Lunghezza media del passo nei ratti di controllo dal lato controlaterale al sito di iniezione (destro) 5,35 ± 0,23 cm; dal lato ipsilaterale al sito di iniezione (sinistro) 4,96 ± 0,23 cm.
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Figura 17. Test del cammino: lunghezza del passo. I risultati sono espressi in valore medio.
Lunghezza del passo
controlaterale al sito di iniezione
0 1 2 3 4 5 6
control ateral e al s i to di i ni ezi one
D is ta n za m e d ia ± E S ( cm ) l es i onati control l i
*
Figura 18. Test del cammino: lunghezza del passo dal lato controlaterale al sito di iniezione.
I risultati sono espressi in valore medio ± ES. *p<0,05 rispetto ai controlli, test t-Student comparato. ES: Errore Standard
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c) Rotazione media dell’arto anteriore nei ratti lesionati dal lato controlaterale al sito di iniezione (destro) 22,15 ± 2,08°; dal lato ipsilaterale al sito di iniezione (sinistro) 18,04 ± 1,91°.
d) Rotazione media dell’arto anteriore nei ratti di controllo dal lato controlaterale al sito di iniezione (destro) 18,80 ± 1,95°; dal lato ipsilaterale al sito di iniezione (sinistro) 18,93 ± 1,93°.
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e) Coordinazione media arto anteriore-arto posteriore nei ratti lesionati dal lato controlaterale al sito di iniezione (destro) 2,14 ± 0,27 cm; dal lato ipsilaterale al sito di iniezione (sinistro)1,35 ± 0,14 cm.
d) Coordinazione media arto anteriore-arto posteriore nei ratti di controllo dal lato controlaterale al sito di iniezione (destro) 1,27 ± 0,11 cm; dal lato
ipsilaterale al sito di iniezione (sinistro) 1,41 ± 0,12 cm.
Figura 20. Test del cammino: coordinazione Arto Anteriore-Arto Posteriore.
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Alla prova del grip strenght i risultati ottenuti sono stati: a) Forza media nei ratti lesionati 102,67 ± 9,83 g.
b) Forza media nei ratti di controllo 158,75 ± 11,33 g.
Grip Strenght
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 F o rz a m e d ia ± E S ( g ) Les i onati Control l i *Figura 21. Grip strenght test. I risultati sono espressi in valore medio ± ES.
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Alla prova della scala verticale i risultati ottenuti sono stati: a) Tempo medio di scalata nei ratti lesionati 118,58 ± 18,91 s. b) Tempo medio di scalata nei ratti di controllo 25,50 ± 6,18 s.
Scala verticale
0 20 40 60 80 100 120 140 160 T e m p o m e d io d i sc a la ta ± E S ( s) Lesionati Controlli*
Figura 22. Test della scala verticale. I risultati sono espressi in valore medio ± ES.
*p<0,05 rispetto ai controlli, test t-Student comparato. ES: Errore standard
Test comportamentali: valori medi
TEST Lesionati Controlli
Grip (g) 102,67 ± 9,83 158,75 ± 11,33 Ladder (s) 118,58 ± 18,91 25,5 ± 6,18
Parametri Controlaterale al Ipsilaterale al Controlaterale al Ipsilaterale al G sito di iniezione sito di iniezione sito di iniezione sito di iniezione
a Lunghezza passo (cm) 4,42 ± 0,25 4,91 ± 0,14 5,35 ± 0,23 4,96 ± 0,23 i Rotazione arto (°) 22,15 ± 2,08 18,04 ± 1,9 18,8 ± 1,95 18,93 ± 1,93 t Coordinaz. AA-AP (cm) 2,14 ± 0,27 1,35 ± 0,14 1,27 ± 0,11 1,41 ± 0,12
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ANALISI STATISTICA
Al fine di valutare una possibile correlazione tra la presenza di una lesione cerebrale della regione per il controllo volontario del movimento e un deficit motorio a livello dell’arto anteriore del ratto è stata ricercata una differenza significativa sul piano statistico tra i ratti con lesione indotta mediante endotelina-1 e quelli trattati con salina nei test neurocomportamentali selezionati per l’esperimento.
Alla prova del cammino sono stati analizzati alcuni parametri. In particolare è emersa una differenza statisticamente significativa (p<0,05) nella lunghezza del passo tra i ratti lesionati ed i controlli, in particolare per una minore ampiezza nei primi rispetto ai secondi del passo condotto con il lato controlaterale al sito di iniezione. Non è risultata significativa la differenza nella lunghezza del passo tra il lato controlaterale al sito di iniezione ed il lato ipsilaterale al sito di iniezione nei ratti lesionati; è possibile tuttavia apprezzare un trend di significatività. Per quel che riguarda l’angolo di esorotazione dell’arto controlaterale al sito di iniezione, le differenze rispetto al controllo ed al lato ipsilaterale al sito di iniezione nel ratto lesionato non raggiungono il livello di significatività statistica ma mostrano tuttavia un trend verso un maggior grado d’angolo di esorotazione nel lato controlaterale al sito di iniezione. Infine, nella coordinazione antero-posteriore del cammino, sebbene senza significatività, è presente un trend positivo nella differenza tra la coordinazione del lato controlaterale alla sede di inoculazione nei ratti lesionati, in cui è presente un maggior grado di incooordinazione tra arto anteriore e posteriore (espresso da una maggior distanza tra le impronte delle zampe anteriori e delle corrispondenti zampe posteriori dello stesso lato), rispetto ai controlli ed al lato ipsilaterale al sito di iniezione nei lesionati.
Per quello che riguarda la prova del grip test è emersa una differenza statisticamente significativa (p<0,05) tra il gruppo di ratti lesionati ed i controlli.
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Anche, infine, nella prova di scalata è presente una significativa differenza (p<0,05) tra i ratti lesionati ed i controlli.