L’epoca di origine dei neuroni corticospinali è stata determinata dalla tecnica di doppia marcatura che combinava autoradiografia con timidina triziata e trasporto retrogrado di HRP (HorseRadish Peroxidase) [188, 189]. I neuroni corticospinali sono generati nei giorni embriologici 15-17 (E15-E17), durante lo stesso periodo di formazione degli altri neuroni dello strato V [190]. Il pattern di
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generazione dei neuroni corticospinali segue due gradienti [188]: 1) un gradiente latero-mediale, per cui neuroni corticospinali situati lateralmente sono formati prima di quelli situati medialmente; 2) un gradiente rostro-caudale, per cui neuroni corticospinali situati rostralmente sono prodotti prima di quelli situati causalmente. Questi gradienti sono simili a quelli osservati nella formazione di tutti gli altri neuroni dello strato V [191, 192].
La migrazione dei neuroblasti corticospinali è stata indirettamente studiata da una serie di iniezioni di timidina triziata. La migrazione di un neuroblasto inizia dopo il completamento della sua ultima divisione mitotica. Hicks e D’Amato (1968) [193] conclusero che i neuroni proiezione dello strato V generati ad E16 impiegano 6 giorni ad arrivare allo strato V. L’iniezione di HRP nella corteccia del feto del ratto ad E17 risultava in una marcatura anterograda di fibre corticoefferenti passanti attraverso la porzione rostrale della capsula interna [178]. Queste fibre erano considerate essere le fibre corticotalamiche e/o corticospinali. Perciò è probabile che i neuroni corticospinali possano emettere i loro assoni durante il processo di migrazione.
Nei mammiferi i neuroni corticospinali sono localizzati esclusivamente nello strato V [189, 194]. Comunque, dopo iniezione di traccianti retrogradi nel midollo spinale del topo e del ratto, alcuni neuroni marcati furono osservati nello strato VI in vicinanza del confine con lo strato V. Questi neuroni corticospinali ectopici hanno un soma piriforme ed un dendrite apicale orientato verticalmente. Sebbene non sia stata condotta un’analisi sistematica, neuroni corticospinali ectopici sembrano localizzati in tutta la corteccia senso-motoria. Tale dislocamento di neuroni corticospinali può presumibilmente essere un risultato dell’arresto della loro migrazione verso lo strato V [195]. Tuttavia, a seguito di uno studio sulla dislocazione di neuroni corticospinali indotta da radiazioni ionizzanti, cui erano esposti feti di ratti tra E16 ed E17, Jensen e Killackey (1984) [196] conclusero che la posizione dei neuroni corticospinali non era essenziale perché i loro assoni raggiungessero gli appositi target, in quanto i
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neuroni corticospinali ectopici nelle ectopie periventricolari e negli strati sopragranulari venivano marcati con HRP iniettato a livello del midollo spinale. La via piramidale si sviluppa relativamente tardi rispetto alle altre vie nervose. Lo sviluppo del tratto corticospinale nel ratto fu ampiamente studiato da Gribnau (1986) [197] con la tecnica dell’impregnazione argentica e la tecnica della tracciatura retrograda con WGA-HRP (Wheat Germ Agglutinin-coniugated
HorseRadish Peroxidase, Germoglio di grano agglutinina-coniugato e
Perossidasi di rafano). Nei materiali ottenuti con la tecnica dell’impregnazione argentica, si scoprì che le fibre corticospinali si estendevano nel peduncolo cerebrale ad E17, nel tetto pontino ad E18, nella decussazione delle piramidi ad E21 ed al livello del midollo cervicale superiore a P0. Nei materiali WGA-HRP, si osservò che le fibre marcate si estendevano causalmente nel terzo segmento midollare toracico a P1, nell’ottavo segmento midollare toracico a P3, nel primo o secondo segmento midollare lombare a P7 e nel secondo-terzo segmento midollare sacrale a P9. Nel ratto lo sviluppo del tratto corticospinale viene completato a P14 [198].
Lo sviluppo precoce degli assoni corticali efferenti fu studiato in cervelli fissati in aldeide di embrioni di ratto usando il DiI colorante carbocianina fluorescente come tracciante anterogrado e retrogrado [199]. Gli assoni della lamina corticale prima entrano nella capsula interna ad E16, poi nel ponte ad E19. Gli assoni di neuroni sottolaminari entrano nella nascente capsula interna ad E14, nel punto medio della capsula interna ad E15 e raggiungono il talamo ad E16. I neuroni sottolaminari sono i primi neuroni corticali che inviano i loro assoni nella capsula interna primordiale [200]. Si presume che gli assoni sottolaminari guidino la crescita delle fibre corticofughe derivanti dagli strati V e VI attraverso la capsula interna, così come degli assoni-guida corticotalamici [201, 202]. Ad ogni modo, poiché nessun assone sottolaminare si estende oltre la capsula interna, gli assoni-guida dei neuroni dello strato V non sono guidati oltre la capsula interna [179].
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Sono state proposte molte ipotesi per spiegare il meccanismo con cui le fibre corticospinali trovano la strada della loro crescita, come quella che sosteneva la presenza di preesistenti canali formati da strutture gliali che guidassero gli assoni corticospinali in crescita [203, 204] o quella che asseriva che la crescita delle fibre corticospinali fosse guidata in modo inibitorio dalla mielina degli attigui fascicoli gracile e cuneato [205, 206], tuttavia smentite da studi successivi [178, 207-210]. Ad ogni modo, la scoperta della via di crescita da parte degli assoni- guida corticospinali non è influenzata dalla posizione intracorticale dei neuroni corticospinali [179]. Allo stato attuale rimane quindi oscuro come le fibre corticospinali in crescita trovino il loro normale tragitto.
La fine struttura del cono di crescita degli assoni corticospinali in via di sviluppo è stata ampiamente studiata [178, 211-215]. I coni di crescita delle fibre corticospinali in via di sviluppo hanno profili di forma irregolare e contengono alcune grandi vescicole a parete liscia, cisterne di reticolo endoplasmatico liscio ed alcuni filamenti [178]. Il fatto che questi coni di crescita vengano reperiti a tutti i livelli del tratto in stadi successivi denota che le fibre corticospinali si estendono in modo scaglionato durante le prime settimane postnatali. Coni di crescita sono molto numerosi durante il periodo in cui il numero degli assoni aumenta rapidamente, nonostante essi possano essere occasionalmente osservati nel tratto corticospinale al livello della piramide bulbare fino a P7 [215]. Comunque, coni di crescita con filopodi multipli irradiantesi dall’espansione terminale, come osservati in assoni in crescita in colture tissutali, non venivano reperiti [213]. Nessun cono di crescita viene rinvenuto nel tratto corticospinale del topo adulto [179].
Nei ratti è stato ripetutamente riportata la presenza di un tempo di latenza tra l’arrivo delle fibre corticospinali a livello dei loro target spinali e la loro successiva crescita entro tali strutture [216, 178, 212, 217]. In particolare c’è un ritardo di 2 giorni tra il primo arrivo di assoni nelle colonne dorsali e la loro successiva crescita nella sostanza grigia adiacente [178]. Questo “periodo
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d’attesa” è ampiamente riconosciuto in vari sistemi di fibre di proiezione nel sistema nervoso centrale dei mammiferi, come le fibre talamo corticali [218, 219] e le fibre callose [220, 221]. L’introduzione del DiI riuscì a dimostrare che i coni di crescita primari degli assoni corticospinali non invadono direttamente i loro bersagli e che rami laterali si sviluppano dagli assoni primari dopo che i coni di crescita si estendono oltre il target [182, 222, 223]. I coni di crescita degli assoni corticospinali non smettono di crescere o di allungarsi in prossimità del target durante il periodo d’attesa, ma continuano ad allungarsi caudalmente. Bisognerebbe inoltre notare che i rami collaterali degli assoni corticospinali sono formati da un “germogliamento” interstiziale ritardato piuttosto che dalla biforcazione di coni di crescita di assoni principali in via di sviluppo [179].
Il meccanismo di ramificazione interstiziale dei collaterali pontini fu largamente studiato tramite marcatura anterograda delle fibre corticospinali con DiI iniettato nella corteccia motoria del ratto [182]. Le fibre corticospinali DiI-marcate giungevano al tetto pontino ad E20 e dopo continuavano a procedere in senso caudale nella piramide bulbare senza alcun segno di ramificazione nei nuclei pontini basilari. In seguito apparivano piccole prominenze sulla superficie ventrale degli assoni corticospinali DiI-marcati al terzo caudale della base del ponte a P0 ed al terzo rostrale a P1 e poi si allungava rapidamente nei terzi caudali e rostrali della parte mediale della base pontina. Allo stesso tempo dalla superficie dorsale degli assoni corticospinali derivavano ramificazioni collaterali, che terminavano nelle isole rostrali e caudali della sostanza grigia basilare del ponte, isolate dalla sostanza grigia principale della base del ponte da fibre del tratto piramidale, pontino longitudinale. Le aree innervate da queste diramazioni collaterali delle fibre corticospinali corrispondono a patch multiple di proiezioni corticopontine derivanti dalla corteccia motoria del ratto adulto [224]. Le estremità dei rami collaterali pontini in via di sviluppo non mostrano alcuna morfologia tipo cono di crescita. In un sistema di co-coltura di espianti di corteccia di ratto a P0/P1 e del ponte accoppiati per età, gli espianti pontini
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inducevano germogliamento interstiziale di assoni corticali, suggerendo che il ponte rilascia una molecola chemiotropica diffusibile che gioca un ruolo cruciale nella crescita ordinata dei rami collaterali pontini delle fibre corticospinali [225, 226].
Figura 10. Rappresentazione schematica dello sviluppo embrionale del cervello di ratto.
Da: Kandel and Schwartz, 1985.
Capitolo 14- MODELLI DI INDUZIONE DELLA LESIONE
Un modello ideale d’induzione della lesione dovrebbe possedere contemporaneamente le qualità di una facile accessibilità, sicurezza del metodo,
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riproducibilità della lesione e non invasività. Tuttavia, come vedremo, spesso non tutte queste proprietà riescono ad essere soddisfatte dalle metodiche correnti.
Attualmente, il numero di modelli disponibili per studiare le lesioni cerebrali neonatali è limitato e molti di essi sono tecnicamente difficili da provocare nei roditori neonati. Fino a qualche anno fa i metodi per indurre ischemia focale in modelli neonatali includevano il modello Rice-Vannucci di ipossia-ischemia [227], l’occlusione transitoria dell’arteria cerebrale media (Middle Cerebral
Artery, MCA) [228, 229] e l’occlusione permanente della MCA [230, 231]. Il
modello Rice-Vannucci nel roditore post-natale comporta la legatura unilaterale della carotide seguita da esposizione ad ipossia dell’8% per circa 1 ora e 30 minuti. Un’occlusione transitoria della MCA è prodotta passando un filamento attraverso l’arteria carotide in direzione della MCA con successiva rimozione del filamento e riperfusione. I due modelli di ischemia focale permanente richiedono l’occlusione della MCA tramite elettrocoagulazione [230] o inserimento manuale di un embolo formato su misura [231]. Questi modelli sono tecnicamente difficili da eseguire nei roditori neonati e problemi derivano dalla craniotomia e/o dall’inserimento della sutura arteriosa (ad es. alta mortalità e volume infartuale incoerente tra gli animali). In aggiunta, questi metodi non producono lesioni focali di singole aree anatomiche e funzionali.
Un metodo tecnicamente semplice, altamente riproducibile e relativamente non invasivo per generare una lesione ischemica focale negli animali è la trombosi indotta fotochimicamente, di cui si fece pioniere Watson negli anni ’80 [232]. La procedura comporta l’iniezione intravenosa di un colorante fotochimico come il rosa bengala, derivato dalla fluorescina, con irradiazione simultanea dei vasi superficiali del cervello con un laser di appropriata lunghezza d’onda. Quando il laser eccita le molecole del colorante vengono prodotti radicali liberi dell’ossigeno e si ha perossidazione lipidica a livello della membrana endoteliale. Questa iniziale reazione innesca eventi endogeni come aggregazione
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piastrinica e trombosi, creando così un trombo focale nel circolo vascolare cerebrale. Dal suo sviluppo, la fototrombosi è stata ampiamente caratterizzata nel roditore adulto [233], tuttavia studi più recenti ne hanno verificato l’efficacia anche nei roditori neonati [234, 235]. Nell’esperimento di Maxwell e Dyck (2005) [234] , in cuccioli di topo al 7° giorno post-natale (P7) veniva irradiata la corteccia frontale mediale e la corteccia somatosensoriale primaria, riducendo il flusso sanguigno locale ed inducendo così la lesione ischemica direttamente a livello dei target di interesse. Tuttavia, la stessa tecnica della fototrombosi può essere utilizzata per occludere l’arteria cerebrale media, mimando in tal modo più fedelmente, almeno nei presupposti, la corrispettiva lesione dello stroke perinatale normalmente osservata nella maggior parte delle condizioni cliniche. L’occlusione mediante fototrombosi dell’arteria cerebrale media è stata sperimentata nei ratti adulti [236]; ciononostante non è stato ancora riferito un suo utilizzo nei roditori neonati.
L’occlusione dell’arteria cerebrale media produce una regione ben definita di lesione che include la neocorteccia così come lo striato laterale, risultando in deficit comportamentali sostenibili [237] che sono di capitale importanza clinica. Nonostante l’uso largamente diffuso dei sopracitati modelli di occlusione dell’arteria cerebrale media, essi hanno molti svantaggi quando usati per studiare i deficit sensomotori: l’entità della lesione è variabile, in particolare nei modelli focali transitori; essi spesso non colpiscono la corteccia motoria; bloccando buona parte della lunghezza dell’arteria cerebrale media con una sutura endoluminale, possono essere occluse altre arterie [238, 239] portando a lesioni in regioni cerebrali non tipicamente interessate nello stroke umano dell’arteria cerebrale media; infine, le tecniche chirurgiche sono invasive e spesso risultano in difficoltà dell’alimentazione e deterioramento della salute a lungo termine [238, 240].
Altri modelli murini di lesione ischemica cerebrale utilizzano l’endotelina-1 (ET-1). L’ET-1, un potente vasocostrittore [241], riduce il flusso sanguigno
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locale a livelli che producono una lesione ischemica quando iniettato direttamente nel tessuto cerebrale [242].
L’iniezione stereotassica di ET-1 adiacente all’arteria cerebrale media è una procedura meno invasiva rispetto ai metodi che espongono l’arteria a manipolazioni o introducono una sutura nel lume, eppure determina un pattern di danno ischemico simile ai modelli più tradizionali di occlusione dell’arteria cerebrale media [243]. Nel modello di occlusione della MCA con ET-1, la riduzione del flusso sanguigno è rapida ma non immediata [244] e la riperfusione avviene dopo parecchie ore [244, 245]. Questo profilo può essere più rappresentativo dello stroke umano rispetto all’immediata riduzione e riperfusione viste con i modelli di occlusione della MCA che richiedono una sutura intraluminale o l’apposizione di clip. Inoltre è possibile modificare l’entità della lesione e migliorare la coerenza del metodo aumentando la concentrazione di ET-1 [244].
Ciononostante, a causa della variabilità nella posizione e nel calibro del vaso, l’adeguato posizionamento dell’ET-1 adiacente alla MCA è spesso difficile, risultandone un basso tasso di successo (definito dalla percentuale di roditori iniettati che presenta deficit sensomotori). Altri metodi che usano l’ET-1 per indurre il danno ischemico sono la sua applicazione topica sulla superficie corticale e la sua iniezione intracorticale. L’applicazione topica di ET-1 sulla superficie della corteccia causa una riduzione dose-correlata del flusso sanguigno locale per almeno un’ora, risultando in una lesione ben definita [242]. Questa tecnica fornisce infatti precisione nelle dimensioni e nella localizzazione della lesione, come mostrato dalla bassa variabilità nelle dimensioni della lesione riferita da un recente studio [246]. Inoltre si è rivelato un modello più riproducibile rispetto all’occlusione della MCA con ET-1, in quanto, pur determinando deficit simili, ha mostrato un più alto tasso di successo [246]. Iniezioni intracorticali di ET-1 nella regione della corteccia motoria che controlla l’arto anteriore producono deficit sostenibili nella capacità di reaching
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(letteralmente “raggiungimento”, definisce quella particolare abilità motoria che comporta l’allungamento dell’arto anteriore finalizzato alla prensione) della zampa anteriore, con un profilo di recupero simile a quello di altri modelli di lesione [247]. Questo metodo produce lesioni approssimativamente nella stessa zona dell’applicazione topica, ma ha rivelato dimensioni maggiori è più variabili rispetto a quest’ultima [246]. Anche se questo potenziale svantaggio dell’iniezione intracorticale poteva essere attenuato da una riduzione della dose, che produceva ancora un deficit nel reaching a 12 settimane dall’iniezione [247], tuttavia ciò si traduceva anche in un minor tasso di successo, seppur sempre maggiore rispetto al modello di occlusione della MCA con ET-1 [246]. Il modello di ischemia focale tramite fototrombosi è simile al modello di iniezione corticale di ET-1, in quanto anch’esso non richiede la craniotomia e può essere localizzato con precisione. Ad ogni modo è un modello di ischemia permanente ed i suoi meccanismi di lesione sono complessi [248].
Lo stroke clinico spesso risulta in un danno corticale e/o subcorticale, perciò lesioni puramente corticali nei roditori possono non essere rappresentative [249]. La combinazione di iniezioni intracorticali e striatali produce una lesione che mira alla regione della corteccia motoria che controlla l’arto anteriore ed allo striato dorso-laterale. Recenti report riferiscono come questo metodo produca un deficit significativo e durevole nel reaching e asimmetria dell’arto anteriore. Inoltre riportano, per la più alta dose di ET-1 usata, un tasso di successo globale superiore a quello raggiunto dal modello di occlusione della MCA con ET-1 ed una percentuale di sopravvissuti con deficit a lungo termine del 100% [246].
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