5 RISULTATI
5.1 Analisi molecolari di geni coinvolti nell’acquisizione di Fe in piante di orzo
5.1.1 Espressione genica HvNAS1
Le piante Graminacee, definite a Strategia II, basano il loro meccanismo adattativo di risposta allo stress da Fe-carenza sulla sintesi e il rilascio di fitosiderofori (PS) alla rizosfera. L’identificazione della prima molecola di PS, denominata acido mugineico (MA), risale al 1978 (Takemoto et al.); studi successivi hanno permesso di individuare altre nove molecole analoghe, prodotte da varie specie graminacee (Curie and Briat 2003), e di descriverne il percorso biosintetico (Kobayashi et al., 2006.). Nei tessuti vegetali delle piante a Strategia II la nicotianammina (NA) è il precursore dei fitosiderofori nel pathway biosintetico. Questa molecola riveste un ruolo cruciale in tutte le piante anche nella complessazione e traslocazione del Fe una volta che questo è stato assorbito, permettendone la redistribuzione all’interno delle cellule e dei tessuti vegetali (Inoue et al., 2003).
La sintesi di NA, quale precursore dei PS della famiglia dell’MA, da parte dell’enzima nicotianammina sintasi (NAS) è cruciale per l’acquisizione del Fe nelle graminacee; il gene HvNAS che codifica per l’enzima, presenta numerose isoforme nel genoma dell’orzo (Higuchi et al., 1999), tra queste l’isoforma HvNAS1 si sovraesprime nelle radici delle piante di orzo Fe-carenti, per cui può essere utilizzato come indicatore dello stato di carenza di Fe e dell’instaurarsi della risposta adattativa della pianta alla condizione di stress (Higuchi et al., 2001).
Figura 5.1. Analisi dell’ espressione genica di HvNAS1 nelle radici di piante Fe-carenti e Fe-sufficienti, misurata sia al mattino (dopo le prime 3 ore di luce) che alla sera (al termine del periodo di illuminazione). L’esperimento è stato condotto utilizzando radici di piante di orzo cresciute in soluzione
nutritiva per 11 giorni in presenza (100µM) o in assenza di Fe. I campioni sono stati raccolti in due momenti del fotoperiodo (3h dopo l’inizio dell’illluminazione e al termine della stessa). Dai tessuti è stato estratto l’RNA ed eseguita la reazione di retrotrascrizione tramite RT-PCR. I livelli di espressione del gene in esame sono stati analizzati mediante Real-time PCR. I dati, espressi in termini di variazione di espressione del gene relativamente al gene housekeeping HvUbi3,rappresentano la media ± d.s. di tre repliche biologiche.
A partire da queste premesse è stata misurata l’espressione relativa del gene HvNAS1, (Fig. 5.1) in piante di orzo Fe-carenti e Fe-sufficienti. In entrambi i momenti presi in analisi il livello dei trascritti era maggiore nelle radici delle piante allevate in assenza del micronutriente, rispetto a quelle adeguatamente rifornite con il Fe. In particolare al mattino l’espressione genica in condizioni di Fe-carenza era tre volte superiore rispetto a quella delle piante Fe-sufficienti; mentre alla sera, questa differenza era di due e volte e mezza.
0 20 40 60 80 100 120 140 MATTINO SERA ES PRE SS IO N E R ELA TIV A +Fe -Fe
5.1.2 Espressione genica HvTOM1
I fitosiderofori vengono rilasciati dalle radici delle Graminacee in condizioni di Fe-carenza. Tra queste piante l’orzo è una delle più efficienti nel rilascio di questi ligandi organici. Recentemente è stata identificata una sequenza genica, battezzata HvTOM1 , codificante per una proteina responsabile del rilascio di acido deossimugineico (Nozoye et al., 2011), uno dei fitosiderofori più rappresentativi degli essudati radicali di orzo.
E’ stato quindi analizzato l’effetto della disponibilità di Fe e del fotoperiodo sui livelli della trascrizione genica dell’mRNA codificante per il trasportatore dei fitosiderofori HvTOM1 (Fig. 5.2).
Figura 5.2. Analisi dell’ espressione genica di HvTOM1 nelle radici di piante Fe-carenti e Fe-sufficienti, misurata sia al mattino (dopo le prime 3 ore di luce) che alla sera (al termine del fotoperiodo).
L’esperimento è stato condotto utilizzando radici di piante di orzo cresciute in soluzione nutritiva per 11 giorni in presenza (100µM) o in assenza di Fe. I campioni sono stati raccolti in due momenti del fotoperiodo (3h dopo l’inizio dell’illluminazione e al termine della stessa).Dai tessuti è stato estratto l’RNA ed eseguita la reazione di retrotrascrizione tramite RT-PCR. I livelli di espressione del gene in esame sono stati analizzati mediante Real-time PCR. I dati, espressi in termini di variazione di espressione del gene relativamente al gene housekeeping HvUbi3,rappresentano la media ± d.s. di tre repliche.
L’espressione di HvTOM1 nelle radici di orzo presentava lo stesso trend di HvNAS1, dipendente dal momento del fotoperiodo analizzato e dallo stato nutrizionale della pianta, tuttavia l’espressione relativa misurata era molto più bassa.
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 MATTINO SERA ES PRE SS IO N E R ELA TIV A +Fe -Fe
Il gene HvTOM1 si esprimeva in maniera diversa, in funzione delle condizioni nutrizionali della pianta sia al mattino che alla sera. Nelle piante Fe-carenti il livello dei trascritti, in entrambi i momenti del fotoperiodo presi in analisi, era di circa tre volte superiore rispetto alle piante Fe-sufficienti (Fig. 5.2). Sia nelle radici delle piante sottoposte a stress da carenza di Fe, che in quelle allevate in piena disponibilità nutrizionale, si riscontrava un ritmo circadiano dell’espressione, infatti l’espressione relativa di HvTOM1 si attestava su valori più bassi alla sera, se paragonati con quelli del mattino.
5.1.3 Espressione genica HvYS1
Una volta rilasciati alla rizosfera, i fitosiderofori chelano il ferro formando il complesso Fe-PS; questo, a sua volta, viene assorbito all’interno delle cellule radicali attraverso specifici trasportatori (Curie and Briat, 2003). Le proteine che attuano questo tipo di trasporto sono state denominate YS (Yellow Stripe), in quanto sono state isolate e caratterizzate per la prima volta in un mutante di mais denominato Yellow Stripe 1 (Curie et al., 2001). Il gene codificante per il trasportatore è stato isolato e caratterizzato anche in orzo (Murata et al., 2006).
Con l’obiettivo di determinare la modulazione dell’espressione di alcuni geni codificanti proteine coinvolte nei meccanismi di risposta allo stress da carenza del micronutriente, sono stati determinati anche i livelli dei trascritti del gene HvYS1 in piante di orzo Fe-carenti e Fe-sufficienti; come per i geni precedenti le misure sono state effettuate al mattino (3h dopo l’inizio del periodo di illuminazione) e alla sera (al termine del periodo di illuminazione).
Al mattino i livelli di espressione del gene HvYS1 erano paragonabili tra le piante allevate in assenza di Fe e quelle allevate in piena disponibilità del micronutriente. Alla sera, invece, le piante Fe-carenti presentavano livelli dei trascritti 5 volte superiori rispetto alle piante Fe-sufficienti (Fig. 5.3). L’espressione del gene HvYS1 nelle piante Fe-carenti non presentava differenze significative tra il mattino e la sera, indicando che la sovraespresione di questo gene è determinata dallo stato nutrizionale della
pianta, ma indipendente dal ritmo circadiano riscontrato per i geni HvNAS1 e
HvTOM1.
Figura 5.3. Analisi dell’ espressione genica di HvYS1 nelle radici di piante Fe-carenti e Fe-sufficienti, misurata sia al mattino (dopo le prime 3 ore di luce) che alla sera (al termine del fotoperiodo).
L’esperimento è stato condotto utilizzando radici di piante di orzo cresciute in soluzione nutritiva per 11 giorni, in presenza (100µM) o in assenza di Fe. I campioni sono stati raccolti in due momenti del fotoperiodo (3h dopo l’inizio dell’illluminazione e al termine della stessa). Dai tessuti è stato estratto l’RNA ed eseguita la reazione di retrotrascrizione tramite RT-PCR. I livelli di espressione del gene in esame sono stati analizzati mediante Real-time PCR. I dati, espressi in termini di variazione di espressione del gene relativamente al gene housekeeping HvUbi3,rappresentano la media ± d.s. di tre repliche biologiche.