Le piante a Strategia II: aspetti molecolari

La Strategia II attuata dalle graminacee (Poaceae) prevede che la mobilizzazione del Fe avvenga mediante secrezione nella rizosfera dei fitosiderofori (PS). Come già riportato, questo gruppo di molecole, è caratterizzato da un’alta affinità verso il Fe³⁺ con il quale formano complessi estremamente stabili (Ksp≈10³³), che sono assorbiti all’interno delle cellule rizodermiche per mezzo di un trasportatore specifico. Questa strategia si è rivelata più efficiente della Strategia I poiché il rilascio dei PS e il successivo assorbimento del complesso Fe^(III)-PS risultano meno sensibili ad incrementi di pH dell’ambiente rizosferico e alla presenza di bicarbonato nel terreno.

Sintesi dei fitosiderofori

Al gruppo dei PS appartiene la famiglia degli acidi mugineici (MAs) che include l’acido mugineico (MA, Fig. 2.29), l’acido 2’-deossimugineico (DMA), l’acido 3-epi-idrossimugineico (epi-HMA) e l’acido 3-epi-idrossi 2’-deossimugineico (epi-HDMA). E’ stata osservata grande variabilità per quanto riguarda tipo e dinamica di rilascio di queste molecole. Infatti, ciascuna specie produce un suo specifico pool di MAs, i cui livelli di produzione e secrezione, in risposta alla Fe-carenza, aumentano notevolmente. Pertanto, la tolleranza di una determinata specie a condizioni di Fe-carenza va correlata ai livelli di produzione (quantità) e al tipo di MAs estrusi (qualità) (Marschner, 1995). Per esempio il riso e il frumento rilasciano nella rizosfera basse concentrazioni di un solo tipo di MAs, il DMA; pertanto tali specie sono più suscettibili a condizioni di Fe-carenza. Al contrario negli essudati radicali d’orzo sono state trovate molte molecole diverse di PS (tra cui MA, HMA ed epi-HMA) e queste sono prodotte in grande quantità; perciò l’orzo è una specie molto tollerante a condizioni di bassa biodisponibilità di Fe (Bashir et al., 2006).

Nella biosintesi dei MAs un intermedio di fondamentale importanza è la nicotianammina (NA), la cui sintesi catalizzata dalla nicotianammina sintasi (NAS) avviene per condensazione di 3 molecole di S-adenosil L-metionina. Oltre che nelle graminacee, la NA è stata trovata anche in piante a Strategia I; ciò ha suggerito che il ruolo svolto dalla NA non vada associato direttamente all’acquisizione del Fe dalla

rizosfera ma, come poi dimostrato, al trasporto inter- e intra-cellulare di vari metalli, tra cui il Fe nelle sue forme ferrose e ferriche (Nishizawa et al., 2002). In piante a

Strategia II è stata trovata una NA amminotransferasi specifica per le graminacee

(NAAT) che catalizza la conversione della NA nell’intermedio 3’-keto DMA, dalla cui riduzione si ottiene DMA (Kanazawa et al., 1994). Questo è un precursore comune a tutti gli altri tipi di MAs (Bashir et al., 2006) che vengono sintetizzati mediante idrossilazione del DMA. In orzo sono stati trovati due geni, Ids2 e Ids3, codificanti isoforme di diossigenasi che probabilmente catalizzano la formazione di epi-HMA e

epi-HDMA in radici Fe-carenti (Nakanishi et al., 2000).

In pianta di orzo, la maggior parte dei geni codificanti per gli enzimi coinvolti nella sintesi dei MAs (Fig. 3.30) sono stati clonati, compresi SAMS, NAS, NAAT, IDS2, IDS3, e

DMAS (Higuchi et al., 1999).

Figura 3.30. Rappresentazione schematica del pathway biosintetico dei fitosiderofori (Hiradate et al.,

2007)

Al fine di aumentare la capacità di acquisizione del ferro, due geni di orzo NaatA e

NaatB, codificanti NAAT, sono stati posti sotto controllo dei loro stessi promotori

nativi in piante di riso (Takahashi et al., 2001). Queste piante di riso transgeniche, allevate in suoli alcalini con limitata biodisponibilità di Fe, hanno dato delle rese 4 volte superiori rispetto alle piante di controllo. Pertanto nel riso l’attività di NAAT risulta essere limitante nella biosintesi di MAs.

Rilascio dei fitosiderofori nella rizosfera

Come già riportato, la secrezione dei PS è operata dalle cellule del rizoderma, soprattutto agli apici. E’ stata isolata e caratterizzato il fenotipo di una linea di mais mutante denominata ZmYS3, questa non è in grado di rilasciare PS (Römheld et al., 2004) e più recentemente, in orzo, è stato dimostrato che il rilascio coinvolge il gene

HvTOM1. Quando questo gene è stato fatto esprimere in oociti di Xenopus laevis è

stato osservato un aumento del rilascio di acido deossimugineico marcato con ¹⁴C; questo incremento non è stato invece riscontrato nell’efflusso di nicotianammina, che è un analogo strutturale e precursore biosintetico dell’acido deossimugineico; questo indica che la proteina HvTOM1 è un trasportatore specifico per la secrezione dei PS. In piante Fe-carenti il livello d’espressione di HvTOM1 aumenta, permettendo un maggior rilascio di PS. Inoltre, il livello d’espressione del gene segue un andamento circadiano, per cui risulta elevato nelle prime ore del mattino e minore alla sera, coincidendo con i ritmi di rilascio rilascio dei PS (Nozoye et al., 2011).

Assorbimento del complesso Fe^(III)-PS

Analizzando l’assorbimento del complesso Fe^(III)-PS, è stato identificato, a livello del plasmalemma di cellule rizodermiche, un sistema di assorbimento ad alta affinità specifico per il complesso Fe-PS. In condizioni di Fe-carenza è stato identificato un mutante di mais, yellow-stripe 1 (ys1), che mostra i sintomi di clorosi internervale (da cui il nome “yellow-stripe”), poiché non è in grado di assorbire il complesso Fe-PS (Curie et al., 2001). Da tale mutante è stato isolato il gene (YS1) che codifica per il trasportatore del complesso Fe-PS. Tale trasportatore appartiene alla superfamiglia dei trasportatori di oligopeptidi (OPT), costituiti da 12 probabili domini transmembrana. La caratterizzazione del trasportatore è stata effettuata su mutanti di lievito, incapaci di assorbire il Fe, e ha mostrato come YS1 sia in grado di ripristinare la crescita solo quando viene fornito Fe³⁺-DMA e non Fe³⁺-citrato. Successive analisi elettrofisiologiche (Inoue et al., 2008) compiute su oociti di Xenopus hanno dimostrato che YS1 è un co-trasportatore H⁺/metalli chelati da PS o da NA. L’aumento dei trascritti di YS1 in condizioni di Fe-carenza, indicano ulteriormente la sua

importanza nel processo d’assorbimento del Fe. YS1 è espresso anche nella parte aerea, ciò suggerisce che il trasportatore abbia anche un ruolo nella traslocazione dalle radici alla parte epigea della pianta.

Più di recente è stato caratterizzato un gene ortologo in orzo, codificante per HvYS1, che è espresso unicamente in radici e sembra essere specifico per l’acquisizione di

Fe^(III)-PS (Murata et al., 2006).

Il caso del riso

Alcune graminacee (Strategia II) sono in grado di assorbire Fe²⁺ come le piante a

Strategia I.

Il riso, per esempio, in aggiunta al trasporto di Fe^(III)-PS è in grado anche di assorbire Fe²⁺ mediante il trasportatore OsIRT1 (Ishimaru et al., 2006).

Similmente a IRT1 in Arabidopsis, i due geni OsIRT1 e OsIRT2 vengono espressi prevalentemente nelle radici e sono indotti in risposta alla Fe-carenza, ma non è stato riscontrato alcun incremento nell’espressione del gene FRO-like o nell’attività del

Fe^(III)-chelato riduttasi.

Questo comportamento è compatibile con la situazione dei suoli sommersi in cui il riso viene coltivato; tali suoli presentano condizioni riducenti per cui l’equilibrio Fe³⁺/Fe²⁺ è decisamente spostato verso la forma ferrosa (Fe²⁺).

L’adattamento verso una strategia basata sull’acquisizione del Fe²⁺ può risultare particolarmente vantaggioso nel caso del riso, sia per evitare eccessivi accumuli del micronutriente si per garantirne un adeguato accumulo in condizioni di carenza, dal momento che tale specie non è molto efficiente nell’assorbimento del Fe³⁺ attraverso la Strategia II.

3.14 RNA-silencing: un mezzo per lo studio della funzionalità dei geni