I trasportatori di carbossilati: aspetti molecolari

I composti carbossilati hanno un ruolo centrale nel metabolismo e nella fisiologia degli organismi vegetali. L’escrezione degli acidi organici dal citoplasma fa sì che questi prodotti del metabolismo primario vengano a trovarsi nel suolo, nell’apoplasto oppure

nel vacuolo. Il sequenziamento del genoma di numerose piante ha reso possibile l’identificazione e caratterizzazione di numerosi trasportatori specifici per malato e/o citrato. Inoltre, la possibilità di disporre di mutanti knock-out e piante transgeniche per la pianta modello Arabidopsis thaliana ha accelerato la comprensione della funzionalità di numerosi carrier di acidi organici presenti sulle membrane cellulari, con studi focalizzati sulla tolleranza alla tossicità da Al, sulla nutrizione ferrica e quella fosfatica (Meyer et al., 2009). Questi studi hanno inoltre dimostrato la localizzazione ubiquitaria dei trasportatori per i composti carbossilati (Fig.3.9)

Ad oggi sono stati identificati tre classi di carrier per il malato ed il citrato. Il trasporto di malato attraverso la membrana plasmatica avviene per mezzo di canali catalogati come ALMT (Aluminium-activated malate transporter) (Sasaki et al., 2004). La movimentazione del composto carbossilato attraverso il tonoplasto coinvolge, oltre ai canali ALMT, anche i trasportatori tDT (Tonoplast Dicarboxylate Transporter) (Emmerlich et al., 2003). La traslocazione di citrato attraverso il plasmalemma è invece mediata da trasportatori appartenenti alla categoria MATE (Multidrug And Toxic

Figura 3.9. Rappresentazione schematica della distribuzione nei diversi tessuti ed organelli cellulari dei

3.3.5.1 Trasportatori MATE

Le proteine della famiglia MATE (Multidrug And Toxic compound Extrusion protein) sono state caratterizzate per la prima volta in organismi batterici. La loro funzione in questo phyla è il trasporto al di fuori del citosol di numerosi composti antimicrobici, conferendo quindi resistenza agli stessi composti. L’attività di trasporto avviene, negli organismi batterici, con antiporto di Na⁺ o di H⁺. (Kuroda and Tsuchiya, 2009).

Queste proteine sono state in seguito identificate in tutti gli organismi eucarioti, nei quali l’attività di trasporto è stata caratterizzata solo con antiporto di protoni. Come per i batteri, anche negli animali i trasportatori di tipo MATE possono svolgere l’attività di detossificazione. Nei genomi degli organismi batterici possono essere presenti da 9 a 13 geni codificanti proteine di questo tipo, mentre nei mammiferi se ne trovano un numero inferiore (Omote et al., 2006).

Nelle piante i trasportatori MATE sono molto numerosi, in Arabidopsis thaliana si contano 56 sequenze codificanti questi trasportatori. Queste proteine di trasporto possono localizzarsi nella membrana plasmatica, nel tonoplasto o nella membrana del cloroplasto (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). L’alta numerosità è dovuta probabilmente all’ampia gamma di prodotti del metabolismo secondario, che possono avere effetti tossici e quindi devono essere escreti dal citoplasma (nell’apoplasto o nel vacuolo). Le molecole trasportate dai MATE sono molto varie e diverse tra loro (Li et

al., 2002 b).

Due trasportatori MATE in Arabidopsis thaliana, sono coinvolti nell’escrezione del citrato dal citosol, e sono AtMATE (Liu et al., 2009) e AtFRD3 (Durrett et al., 2007). La topologia di questi MATE, e di omologhi identificati in altre piante, presenta un lungo

Figura 3.10. Rappresentazione schematica della topologia di un trasportatore di citrato della famiglia

MATE (Meyer et al., 2009)

3.3.5.2 Trasportatori ALMT

La maggior parte delle piante rilascia composti carbossilati alla rizosfera in risposta alla presenza di Al³⁺. Il primo canale specifico per il malato, identificato in Triticum

aestivum, è stato TaALMT1 (Sasaki et al.,2004). Questo è espresso in maniera

costitutiva negli apici radicali, ma è attivato in presenza di alluminio nell’apoplasto, aumentando la resistenza al metallo tossico delle cultivar di grano che possiedono questo gene. L’espressione eterologa di TaALMT1 in organismi modello rende possibile l’efflusso di malato attivato dalla presenza di Al³⁺, conferendo un’aumentata resistenza al metallo (Delhaize et al., 2004). TaALMT1 codifica per una proteina idrofobica che possiede da 6 a 7 domini transmembrana (Motoda et al., 2007) con N e C-terminale localizzati nel lato extracellulare della membrana plasmatica (figura 3.11). Proteine omologhe sono state identificate in altre specie vegetali e numerosi studi hanno dimostrato che queste hanno funzione simile a TaALMT1. Tuttavia ZmALMT1, espresso in un sistema eterologo quale gli oociti di Xenopus, mostra di avere un ruolo nel trasporto di anioni (es. Cl^-) piuttosto che una funzione specifica nel rilascio di carbossilati in risposta alla tossicità da alluminio (Piñeros et al., 2008).

Figura 3.11. Rappresentazione schematica della topologia di un trasportatore ALMT (Meyer et al., 2009)

In Arabidopsis la famiglia proteica AtALMT consta di 14 membri che possono essere suddivisi in tre cladi. AtALMT1 appartiene allo stesso clade di TaALMT1, e come questo si localizza sul plasmalemma delle cellule radicali, dove media il rilascio di malato in risposta alla tossicità da alluminio (Hoekenga et al., 2006). La presenza dell’elemento tossico è richiesta non solo per l’attivazione di AtALMT1, ma anche per indurre l’espressione del gene che codifica per la proteina. Questo tipo di meccanismo è descritto anche in Brassica napus per BnALMT1 e BnALMT2 (Ligaba et al., 2006). AtALMT9 è un membro del secondo clade ed è localizzato nel tonoplasto, e il gene che lo codifica è altamente espresso nel mesofillo delle foglie (Kovermann et al., 2007). Piante mutanti per il gene AtALMT9 mostrano una riduzione della densità di corrente misurata nei vacuoli isolati dai protoplasti del mesofillo fogliare, questa è la conseguenza della perdità parziale della funzionalità della proteina nell’attività di traslocazione del malato. Al contrario, cellule di tabacco che sovraesprimono il gene presentano un forte incremento della corrente dipendente dal trasporto di malato, conseguentemente ciò significa che l’attività di trasporto del malato attraverso la membrana del vacuolo viene aumentata dall’alterazione dell’espressione di AtALMT9. Queste evidenze sperimentali dimostrano come AtALMT9 abbia una funzione nell’omeostasi cellulare del malato piuttosto che nella tolleranza alla tossicità da Al³⁺. Altri membri del secondo clade sono localizzati nel tonoplasto (Meyer et al., 2009).

IN

Particolare attenzione è recentemente posta anche ai membri del terzo clade della famiglia ALMT, che possono adempiere funzioni per le quali non sono ancora stati caratterizzati. Con approcci di tipo microarray è stato dimostrato che il livello dei trascritti è abbondante in numerosi tessuti. Il malato ha un ruolo nel regolare l’apertura/chiusura della rima stomatica attraverso il flusso in entrata/uscita dalle cellule di guardia; conseguentemente i canali ALMT possono fungere da regolatori del flusso traspirativo attraverso gli stomi (Roelfsema and Hedrich, 2005). Questa regolazione avviene attraverso il rilascio o l’assorbimento di anioni osmoticamente attivi e metaboliti organici da parte delle cellule di guardia.

3.3.5.3 Tonoplast dicarboxylate transporter

Il trasportatore di malato situato nel tonoplasto AttDTT (Arabidopsis tonoplast dicarboxylate transporter) è stato identificato confrontandolo con l’omologo umano (HsNaDC-1) che ha un’attività Na-dipendente (Emmerlich et al., 2003). Questo trasportatore è un membro della famiglia di carrier di soluti 13A2, che comprende trasportatori di solfato e carbossilati che svolgono un’attività Na-dipendente (Markovich and Murer, 2004). Nell’uomo questi trasportatori sono localizzati nella membrana plasmatica di numerosi organi. Gli elementi di questa famiglia che trasportano composti carbossilati possono essere suddivisi in tre cladi (NaDC 1, NaDC2, NaDC3), che si differenziano per l’ottimo di pH e per l’affinità per il substrato. La loro attività genera una corrente poiché il trasporto di una molecola di anione divalente è accoppiata a quella di tre Na⁺ (Markovich and Murer, 2004).

La pianta modello Arabidopsis contiene nel proprio genoma una sequenza genica che presenta una similarità superiore al 65% con HsDC1. Due membri della stessa famiglia sono stati identificati in riso e Brassica oleracea. AttDt, contrariamente all’omologo umano, non è localizzato nella membrana plasmatica, bensì nel tonoplasto e la sua attività di trasporto non è Na-dipendente (Emmerlich et al., 2003). L’accumulo di malato è energizzato dal gradiente elettrochimico e si pensa che la differenza di potenziale elettrico tra citosol e vacuolo sia la forza motrice. Analisi biochimiche hanno dimostrato che il trasporto di malato da parte di AttDT può essere inibito dal citrato e viceversa (Hurth et al., 2005).

Un omologo di AttDT è stato isolato in Citrus. L’espressione genica di CsCIT1 coincide con la diminuzione della concentrazione vacuolare di citrato e l’aumento del pH (Shimada et al., 2006). L’espressione eterologa in lievito ha dimostrato che CsCIT1 è coinvolto nell’efflusso di citrato dal vacuolo, in maniera H⁺-dipendente.