Le piante a Strategia I: aspetti molecolari

Come in precedenza illustrato la Strategia I di acquisizione del ferro (e di risposta alla carenza del micronutriente) è riassumibile in tre principali eventi che coinvolgono attività operanti a livello della membrana plasmatica delle cellule radicali:

 Riduzione del Fe³⁺ ad opera di una Fe^(III)-chelato riduttasi (indicata con FRO);

 Assorbimento del Fe²⁺ mediante un trasportatore per metalli divalenti (IRT);

 Acidificazione della rizosfera mediante rilascio di protoni attraverso una H⁺ -ATPasi (HA).

Riduzione del Fe³⁺

Nelle piante a Strategia I, la riduzione dei chelati ferrici a livello della membrana plasmatica è una tappa obbligatoria per consentire la successiva acquisizione del Fe²⁺ (Chaney et al., 1972). Nelle piante che attuano questa strategia, l’attività della Fe^(III) -chelato riduttasi è incrementata in risposta a condizioni di limitata disponibilità di Fe, pertanto la riduzione della forma ferrica è da considerarsi uno step caratterizzante di tale strategia. I geni delle riduttasi ferriche, finora identificati, codificano tutti per peptidi di dimensioni simili: 712-725 amminoacidi con massa molecolare di 80,5-81,5 kDa. Nelle Fe-riduttasi sono stati identificati siti di legame per FAD e NADPH. Tale evidenza è coerente con la funzione svolta dalla riduttasi, che catalizza il trasferimento di elettroni da molecole ad alto potere riducente ai chelati ferrici presenti sul lato extracellulare della membrana plasmatica (Robinson et al., 1999; Waters et al., 2002; Li et al., 2004). In Arabidopsis la famiglia genica delle Fe^(III)-chelato riduttasi è composta da 8 geni. Per quanto riguarda l’espressione del gene AtFRO2 nelle radici è stata osservata la sua induzione in condizioni di Fe-carenza. Tale gene, inoltre, è in

grado di complementare il fenotipo del mutante frd1-1 (ferric-chelate reductase

defective 1-1), nelle cui radici nonostante le condizioni di carenza del micronutriente,

non è stata osservata alcuna induzione di attività chelato riduttasica (Yi e Guerinot, 1996; Robinson et al., 1999). La funzione di alcuni degli geni FRO in Arabidopsis e la localizzazione delle relative proteine che codificano, cominciano ad essere chiarite (Jeong and Connoly, 2009).

Assorbimento del Fe²⁺

Il Fe²⁺ viene acquisito dalle cellule rizodermiche mediante il trasportatore IRT1, proteina integrale di membrana appartenente alla famiglia di trasportatori di metalli chiamata ZIP (ZRT, IRT-like proteins) e identificata per la prima volta in Arabidopsis (Eide et al., 1996). Nel mutante irt1 (knockout del gene IRT1) sono stati osservati sintomi di clorosi simili a quelli indotti da carenza di Fe (ridotto contenuto del metallo nei tessuti e ridotta crescita), che però potevano regredire a seguito del rifornimento del micronutriente per via fogliare (Henriques et al., 2002; Varotto et al., 2002; Vert et

al., 2002). Geni omologhi di IRT1 sono stati clonati da pomodoro (LeIRT1) (Eckhardt et al., 2001) e pisello (PsIRT1) (Cohen et al., 2004). E’ stato rilevato che il trasportatore di

pisello PsRIT1 presenta per il Fe²⁺ una Km compresa tra 54 e 93 nM, valore che è compatibile con la concentrazione del Fe²⁺ riscontrata nel suolo (Cohen et al., 2004). I trasportatori IRT trasportano anche altri ioni metallici bivalenti quali Zn²⁺, Mn²⁺ e Cd²⁺, tuttavia mostrano un’affinità maggiore per il Fe²⁺. Pertanto anche quando la soluzione del suolo presenta basse concentrazioni di ioni metallici, i trasportatori IRT assorbono principalmente Fe²⁺. E’ stato osservato che in cellule radicali l’espressione del gene IRT è indotta da condizioni di Fe-carenza (Vert et al., 2002). In Arabidopsis il gene AtIRT1 è regolato sia a livello trascrizionale che traduzionale. In piante transgeniche che sovra-esprimevano IRT1 il trasportatore era presente solo quando le piante erano sottoposte a Fe-carenza; i trascritti genici (mRNA) di IRT1 erano costitutivamente espressi in entrambe le condizioni (+ o – Fe). E’ stato dimostrato che questa regolazione dipende dalla concentrazione interna di Fe: quando questa è adeguata, la proteina IRT1 può venire ubiquitinizzata e successivamente degradata

(Connolly et al., 2002). La presenza di questo doppio meccanismo regolativo nell’attività di IRT1 consente alla pianta di controllare finemente i livelli di acquisizione del Fe. A conferma di ciò, quando nella rizosfera è presente un’elevata biodisponibilità di Fe, la pianta è in grado di ridurre (o interrompere) rapidamente l’assorbimento del micronutriente, in modo da evitare livelli di potenziale tossicità. Una regolazione simile è stata dimostrata per AtFRO2 indicando quindi che l’attività riduttasica è strettamente accoppiata all’assorbimento del Fe (trasporto), essendo entrambi regolati sia a livello trascrizionale che post-trascrizionale (Connolly et al., 2003).

Rilascio di protoni

Evidenze sperimentali hanno dimostrato che in condizioni di carenza di ferro le radici di piante a Strategia I attivano meccanismi di acidificazione della rizosfera.

Tale attività è stata imputata alle H⁺-ATPasi della membrana plasmatica che sono in grado di estrudere protoni verso la rizosfera. Questo fenomeno è importante poiché consente ai nutrienti in forma cationica presenti nei siti di scambio della parete cellulare e della superficie dei colloidi di passare in soluzione ed essere assorbiti dalle piante attraverso proteine trasportatrici presenti a livello della membrana plasmatica (Varanini e Pinton, 2007).

Grazie a tale meccanismo, che può determinare acidificazione della rizosfera, le piante sono in grado di influenzare notevolmente la solubilità del Fe; infatti, come precedentemente riportato, ad ogni decremento di una unità di pH nella soluzione del suolo si ottiene un corrispondente incremento nella concentrazione del Fe³⁺ pari a circa 1000 volte.

A livello molecolare sono stati identificati geni codificanti H⁺-ATPasi appartenenti alla famiglia delle AHA (Arabidopsis H⁺-ATPasi) (Schmidt et al., 2003). Tale famiglia è composta da 12 isoforme, la cui regolazione, in molti casi, non è ancora stata chiarita. L’espressione del gene AtAHA2 è stata osservata a livello dei peli radicali e può essere coinvolta nei meccanismi di assorbimento dei nutrienti (Sussmann, 1994).

L’isoforma 7 (AHA7), è sovra-espressa in risposta a condizioni di Fe-carenza e regolata da FIT1 (Fe-deficiency Induced Transcription factor 1), indicando quindi questa

isoforma quale componente attivata nella risposta alla Fe-carenza (Colangelo and Guerinot, 2004).

Anche in cetriolo è stata identificata una H⁺-ATPasi regolata dalle condizioni di disponibilità del Fe, chiamata CsHA1, la cui espressione è incrementata in radici Fe-carenti (Santi et al., 2005).

Sebbene la secrezione di composti riducenti o acidificanti generalmente non venga considerata di fondamentale importanza per l’acquisizione del Fe, in molti casi la formazione di cluster radicali e la secrezione di acidi organici, quali il citrato, concorrono ad aumentare notevolmente la biodisponibilità del Fe.

Analizzando una linea cellulare mutante di carota che presenta un’intensificata secrezione di citrato, è stato osservato che limitando l’attività della H⁺-ATPasi mediante costrutti antisenso si ottiene anche un decremento nell’efflusso di citrato, suggerendo quindi un coinvolgimento della H⁺-ATPasi anche in tale processo (Ohno et

al., 2004).

Recentemente è stato isolato e caratterizzato un trasportatore, denominato PEZ1, che media l’efflusso di composti fenolici dalle cellule radicali (Ishimaru et al., 2011). PEZ1 appartiene alla famiglia di trasportatori MATE (Multidrug And Toxic compound

Extrusion protein) i cui membri trasportano piccoli composti organici.

Un importante mediatore che regola la strategia I e gli adattamenti morfologici alla di Fe è la proteina bHLH FER, anche designato come FRU (FER-LIKE REGULATOR OF IRON

UPTAKE) (Jakoby et al., 2004) o FIT (FE-DEFICIENCY INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR)

(Colangelo and Guerinot, 2004). FER è stato inizialmente clonato da pomodoro (Ling et

al. 2002). Il mutante fer è clorotico e non riesce a indurre l’attività delle ferro-chelato

reduttasi o la trascrizione di FRO2 e IRT1 (Brown et al. 1971, Ling et al. 2002). E’ stato proposto che in Arabidopsis FIT interagisca con altri membri della famiglia bHLH (bHLH38 e 39) per regolare l’espressione di FRO2 and IRT1.