ANALISI STATISTICA

Il disegno sperimentale è stato pianificato in modo che i dati raccolti durante i campionamenti potessero essere analizzati statisticamente, rispettando allo stesso tempo i criteri etici della numerosità del campione. La numerosità campionaria è stata fissata a 54 esemplari/gruppo per stimare la prevalenza degli effetti indotti dall’ingestione di microplastiche con un livello di confidenza del 95% ed una precisione dello 0.1%.

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I dati relativi ad ogni campionamento ed alle rispettive analisi effettuate sono stati inseriti su sistema informatico utilizzando il programma Microsoft Office Excel. E’stato realizzato un database riportante i dati degli esemplari di spigola prelevati ad ogni campionamento. Per ciascun campionamento è stata predisposta una matrice riportante tutte le informazioni ed i dati necessari per le successive elaborazioni. I dati sono stati elaborati attraverso il test non parametrico a permutazioni multiple PERMANOVA (analisi multivariata). Tale test fornisce risultati analoghi alla classica analisi della varianza (ANOVA) ma risulta meno restrittivo per quanto riguarda le assunzioni sull’omogeneità della varianza. I test sono considerati significativi per probabilità p <0.05. Le analisi sono state effettuate utilizzando il software PRIMER6 & PERMANOVA+ (Clarke & Warwick, 2001; Anderson et al., 2008).

Tutti i dati sono stati analizzati con PERMANOVA ad un fattore per rilevare differenze significative tra i 3 livelli (CTRL, MPV, MPI) del fattore trattamento ad ogni tempo di esposizione (T30, T60, T90). I dati sono stati trasformati con radice quadra ed analizzati sulla base della distanza euclidea, utilizzando 4999 permutazioni. L’analisi a coppia (Pair-wise) è stata effettuata quando sono state rilevate differenze significative (p <0.05) tra i livelli dei fattori. Per i dati relativi al punteggio attribuito alle alterazioni istologiche dell’intestino distale, le differenze nei trattamenti (CTRL, MPV, MPI) a differenti tempi di esposizione (T30, T60, T90) sono state analizzate utilizzando PERMANOVA a due fattori “nested” o gerarchizzati, considerando il fattore fisso “trattamento” ed il fattore random “vasca”. I dati sono stati trasformati con radice quadra ed analizzati sulla base della distanza euclidea, utilizzando 4999 permutazioni. L’analisi a coppia (Pair-wise) è stata effettuata quando sono state rilevate differenze significative (p <0.05) tra i livelli dei fattori.

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4.

RISULTATI

4.1. INDICI MORFOMETRICI

Nel corso della sperimentazione non si sono verificati casi di mortalità in nessun trattamento. In totale sono state campionate 162 spigole, 18 individui per trattamento (CTRL, MPV, MPI) ad ogni campionamento stabilito a differenti periodi di esposizione (T30, T60, T90).

4.1.1. Indici biometrici

L’insieme dei dati relativi agli indici biometrici sono riportati nella Tab.8.

Tab.8. Indici biometrici delle spigole esposte a 90 giorni di alimentazione con microplastiche.

CTRL T30 167,3 6,53 25,2 0,35 23,7 0,38 3,72 0,25 18 MPV T30 159,3 7,40 24,5 0,30 23,4 0,28 3,59 0,21 18 MPI T30 170,8 9,93 25,2 0,42 23,9 0,41 3,73 0,38 18 CTRL T60 171,6 7,52 25,4 0,33 22,7 0,41 3,60 0,19 18 MPV T60 178,0 12,22 25,8 0,33 22,7 0,35 3,76 0,21 18 MPI T60 203,2 13,35 26,1 0,54 22,8 0,47 3,85 0,42 18 CTRL T90 190,6 9,01 26,2 0,37 25,1 0,36 3,16 0,16 18 MPV T90 215,0 18,24 27,6 0,65 26,4 0,65 2,68 0,23 18 MPI T90 256,0 13,82 28,7 0,43 27,5 0,40 3,56 0,27 18

Trattamento Tempo di esposizione P (g) e.s. LT (cm) e.s. LF (cm) e.s. P fegato (g) e.s. n

I dati sono espressi come valore medio di tre repliche (N=6 spigole) ed errore standard .

P= peso; LT= lunghezza totale; LF= lunghezza alla forca; e.s. = errore standard; n= numero di esemplari.

I risultati riportati per ciascun trattamento e per singolo tempo di esposizione sono espressi come valore medio ed errore standard su un totale di 18 individui.

Dai dati si evince che l’incremento ponderale di ciascun gruppo di esemplari per trattamento è stato in linea con quanto previsto dai regimi nutrizionali del mangime somministrato (circa 30 g al mese). Di seguito in Figura 10 si riporta l’andamento

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ponderale delle spigole sottoposte ai tre regimi alimentari durante tutto l’arco di tempo della sperimentazione.

Fig.10. Accrescimento di D. labrax appartenenti ai gruppi controllo (CTRL) e sperimentali (MPV, MPI) durante la sperimentazione. I dati sono espressi come valore medio ed errore standard.

4.1.2. Indici somatici

Nei grafici (Fig.11, 12) sono riportati i valori degli indici morfometrici (fattore di condizione CF, indice epatosomatico HSI) espressi come valore medio ± deviazione standard su un totale di 18 individui per ciascun trattamento ad ogni campionamento. Dai risultati del fattore di condizione si evince una riduzione di tale indice nei gruppi sperimentali rispetto ai relativi controlli già dopo 60 giorni di alimentazione.

L’analisi PERMANOVA (ad un fattore) ha evidenziato che gli individui alimentati con microplastiche (MPV, MPI) non hanno mostrato alterazione significativa dell’indice di condizione rispetto agli individui del gruppo controllo dopo 30 giorni di esposizione. Sono state rilevate, invece, differenze significative tra i 3 livelli (CTRL, MPV, MPI) del fattore ”trattamento” per i tempi di esposizione a 60 (F1,53= 4,1204; p<0,05) e 90 giorni

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(F1,53=5,2607; p<0,01). I confronti a coppie (Pair-wise) mostrano, infatti, differenze

significative per CTRL vs MPV(p<0,05) e per CTRL vs MPI(p<0,05) a 60 giorni, e per CTRL vs MPV(p<0,05) e per MPV vs MPI(p<0,01) a 90 giorni.

Fig.11. Fattore di Condizione (CF) delle spigole campionate per ogni trattamento durante la sperimentazione.* (p< 0.05); **(p<0.01).

Riguardo l’indice epatosomatico solo dopo 90 giorni di esposizione si assiste ad una riduzione dei gruppi sperimentali rispetto ai controlli.

I risultati dell’analisi PERMANOVA non hanno evidenziato differenze significative tra i 3 livelli (CTRL, MPV, MPI) del fattore ”trattamento” per i tempi di esposizione a 30 e 60 giorni, mentre differenze significative (F1,53= 12,744; p<0,01) sono state rilevate a 90

giorni. I confronti a coppie (Pair-wise) mostrano, infatti, differenze significative per CTRL vs MPV(p<0,01) e per CTRL vs MPI(p<0,01) a 90 giorni.

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Fig.12. Indice epatosomatico (HSI) delle spigole campionate per ogni trattamento durante la sperimentazione.* (p<0.05); **(p<0.01).

4.2. BIOMARKER

Per le indagini dei biomarker sono stati considerati tutti i trattamenti dopo 30 giorni di esposizione, e dopo un esposizione prolungata di 60 giorni solo i trattamenti in cui sono state rilevate strutture ascrivibili a neoformazioni. Nella tabella 9 sono riportati i risulati relativi alle analisi dei tre biomarker in esemplari di spigola campionate per ciascun trattamento ad ogni tempo di esposizione. I risultati sono espressi come valore medio e deviazione standard.

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Tab.9. Biomarker analizzati nei fegati di spigole campionate per ogni trattamento ad ogni tempo di espozione.

CTRL T0 6 14,2 ± 2,2 6 4,1 ± 2,4 6 5,3 ± 2,4 CTRL T30 8 10,9 ± 2,6 9 6,8 ± 1,2 15 5,7 ± 5,7 MPV T30 9 11,2 ± 4,5 10 4,7 ± 2,5 15 7,3 ± 5,1 MPI T30 7 9,7 ± 2,4 10 6,0 ± 2,8 10 10,5 ± 7,1 CTRL T60 5 16,1 ± 1,9 5 3,6 ± 2,4 5 2,5 ± 1,9 MPV T60 ­ ­ ­ ­ ­ - MPI T60 8 6,5 ± 2,8 8 4,6 ± 3,7 8 8,6 ± 9,7 CTRL T90 5 8,1 ± 4,5 5 7,5 ± 5,6 17 4,8 ± 3,5 MPV T90 5 8,7 ± 4,4 5 4,0 ± 2,0 18 8,6 ± 7,0 MPI T90 7 8,8 ± 2,2 7 9,4 ± 5,4 18 11,1 ± 7,9

Trattamento Tempo di esposizione EROD

(pmol substrato x min¯¹ x mg prot¯¹)

ENA (frequenza ‰) n

n LPO

(nmol TBARS formati x mg prot¯¹) n

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4.2.1. ENA assay

Le indagini delle risposte genotossiche per l’esposizione a microplastiche hanno evidenziato che i valori di frequenza delle anomalie nucleari totali per ogni trattamento a tutti i tempi di esposizione (30, 60, 90 giorni) sono influenzati principalmente dai valori delle anomalie nucleari di tipo lobato.

A tutti i tempi di esposizione si è verificato un discreto aumento della frequenza totale delle anomalie nucleari dei gruppi sperimentali rispetto ai relativi controlli (Fig.15a,b,c), ma con differenze significative solo a 90 giorni (Fig.15c).

Infatti, i risultati dell’analisi PERMANOVA ad un fattore, non evidenziano differenze significative tra i 3 livelli (CTRL, MPV, MPI) del fattore ”trattamento” per i tempi di esposizione a 30 e 60 giorni, mentre sono emerse differenze significative (F1,53= 5,1722;

p<0,05) tra il gruppo di controllo ed i due gruppi sperimentali (MPV, MPI) a 90 giorni. I confronti a coppie (Pair-wise) mostrano, infatti, differenze significative per CTRL vs MPV(p<0,05) e per CTRL vs MPI (p<0,01) a 90 giorni.

I micronuclei non sono stati rilevati in nessun trattamento dopo 30 giorni di esposizione, mentre seppur con bassa frequenza sono stati ritrovati micronuclei sia nel gruppo MPI a 60 giorni (0,2‰) sia nei gruppi MPV (0,1‰) ed MPI (0,2‰) dopo 90 giorni di esposizione.

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Fig.15. Frequenza totale di anomalie nucleari (media, d.s.) rilevata negli eritrociti delle spigole campionate per trattamento ad ogni tempo di esposizione. * (p<0.05) ** (p<0.01) indicano rispettivamente le differenze significative e le differenze altamente significative dei gruppi sperimentali rispetto al gruppo controlloal T90, (PERMANOVA ad un fattore).

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4.2.2. Attività Etossiresorufina-O-deetilasi (EROD)

La figura 13 mostra i valori medi dell’attività dell’Etossiresorufina-O-deetilasi rilevata nei fegati delle spigole campionate dutante la sperimentazione. L'attività EROD non è risultata indotta nei trattamenti (CTRL, MPV, MPI) a nessun tempo di esposizione. Dall’analisi PERMANOVA ad un fattore, non sono infatti emerse differenze significative tra i valori dell’attività EROD dei gruppi sperimentali rispetto al controllo ai tempi di esposizione.

Fig.13. Attività EROD (media, d.s.) misurata nel fegato delle spigole durante la sperimentazione.

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4.2.3. Livelli di Perossidazione lipidica (LPO)

Nella figura 14 sono riportati i livelli di stress ossidativo rilevati negli esemplari di spigola campionati a diversi tempi di esposizione. I livelli di perossidazione riscontrati negli animali alimentati con microplastiche (MPV, MPI) non hanno mostrato differenze statisticamente significative rispetto ai gruppi di controllo a nessun tempo di esposizione come confermato dall’analisi statistica PERMANOVA ad un fattore.

Fig.14. LPO (media, d.s.) misurata nel fegato delle spigole campionate per trattamento ad ogni tempo di esposizione.

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4.2.4. Indagini istologiche ed istomorfometriche

In totale sono stati analizzati i fegati e gli intestini di sei spigole campionate per trattamento ad ogni tempo di esposizione (T30,T60 e T90) per un totale di 54 pesci.
Valutazione istopatologica ed istomorfometrica del fegato

Da una prima analisi qualitativa dei fegati campionati (N= 54), è emerso che tutti gli individui indistintamente presentavano un fegato steatosico a vari livelli. Sono stati inoltre riscontrati disturbi di circolo (ingorgo venoso e aree edematose) soprattutto nei campioni sottoposti ai trattamenti sperimentali (MPV, MPI) già dopo 30 giorni di esposizione (Fig.16, 17).

Fig.16. Sezioni longitudinali del fegato di spigole esposte a PVC nativo (a,b) per 90 gg. Congestione venosa e aree edematose. (H&E; 5x a; 40x b).

Fig.17. Sezioni longitudinali del fegato di spigole esposte a PVC marino (c,d) per 90 gg. Edema diffuso. (H&E; 5x c; 40x d).

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Per il numero di epatociti non sono emerese differenze statisticamente significative tra i trattamenti rispetto al controllo ai diversi tempi di esposizione. In tabella 10 si riporta il numero degli epatociti.

Tab.10. Numero di epatociti (media ± deviazione standard) nei fegati di spigole alimentate con microplastiche.

Trattamento T30 T60 T90 CTRL 68 ± 8,7 84 ± 16,8 89 ± 6,4 MPV 66 ± 12,3 82 ± 18,1 98 ± 19,7 MPI 81 ± 9,0 72 ± 10,3 78 ± 17,2 Numero Epatociti

Relativamente all’area del nucleo degli epatociti, si è verificata una riduzione graduale delle dimensioni dei nuclei nei gruppi sperimentali rispetto ai relativi controlli ad ogni tempo di esposizione, ma con differenze significative solo dopo 60 giorni di esposizione. Sono state, infatti, rilevate differenze significative tra il gruppo di controllo e il gruppo MPI dopo un tempo di esposizione di 60 giorni (F1,17= 3,1572; p<0,05) e tra il gruppo di

controllo ed i gruppi MPV e MPI a 90 giorni (F1,17=8,1365;p<0,01).

Dai confronti a coppie (Pair-wise) risultano differenze significative per CTRL vs MPI (p<0,05) a 60 giorni, per CTRL vs MPV e MPI (p<0,01; p<0,05) a 90 giorni (Fig.18).

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Fig.18. Dimensione nucleo degli epatociti delle spigole campionate per ogni trattamento durante la sperimentazione.I dati sono espressi come valore medio e d.s.; * (p< 0.05); **(p<0.01).

Valutazione istopatologica ed istomorfometrica dell’intestino

Da una prima analisi semi-quantitativa effettuata su tutte le porzioni (IP, IM, ID) degli intestini campionati (N= 54) per trattamento e ad ogni tempo di esposizione, l’intestino distale è risultato la porzione che ha subito maggiormente alterazioni strutturali. Le porzioni di intestino distale dei gruppi di controllo hanno mostrato una struttura normale (0) (Fig.19a) o lievi alterazioni strutturali (1) (Fig.21a) per i tre tempi di esposizione, mentre i gruppi sperimentali hanno presentato un graduale peggioramento delle condizioni intestinali, nei tre periodi di esposizione, raggiungendo un quadro istologico seriamente compromesso per le esposizioni al maggiore periodo (90 g). Dopo 30 giorni di esposizione il 67% degli individui del gruppo MPV ha mostrato moderate alterazioni (2) della struttura dell’intestino distale visibile dall’ispessimento della lamina propria, accorciamento ed ispessimento dei villi, vacuolizzazione degli enterociti ed aumento delle cellule mucipare soprattutto nella zona apicale dei villi (Fig.19b). Il resto degli individui (33%) presentava invece lievi alterazioni (1) (Fig.23a). Un’elevata percentuale (83%) di individui appartenenti al gruppo MPI ha invece manifestato pronunciate alterazioni

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strutturali ascrivibili allo stadio (3) (Fig.23a). In questi esemplari l’epitelio si presentava distaccato dalla lamina propria, con fusioni dei villi e fenomeni di decapitazione e disepitelizzazione dei villi, vacuolizzazione degli enterociti ed aumento delle cellule rodlet (Fig.19c). Inoltre negli stessi individui è stato rilevato un evidente edema degli strati della sierosa, muscolare e sottomucosa. Sono invece state osservate moderate alterazioni della struttura (2) dell’intestino distale nel restante 17% dei campioni (Fig.23a).

Dopo 60 giorni di esposizione, gran parte delle spigole (67%) appartenenti al gruppo MPV mostrano ancora moderate alterazioni dell’intestino distale (2) (Fig.23b) con evidente distacco della mucosa dell’epitelio dalla lamina propria, fusione e decapitazione dei villi, iperplasia delle cellule mucipare nella parte apicale dei villi (Fig.20b). Nel restante 33% degli individui sono invece state osservate pronunciate alterazioni (3) (Fig.23b). Allo stesso tempo di esposizione, il 50% degli individui appartenenti al gruppo MPI, presentavano il più alto grado di alterazioni (4) (Fig.23b; Fig.20c). In questi individui gli strati della sierosa, muscolare e sottomucosa apparivano edematosi, con un evidente ectasia dei vasi ed infiltrato leucocitario. L’epitelio della mucosa intestinale era completamente distaccato dalla lamina propria (Fig.20c; Fig.22a), con villi desquamati e decapitati, ed il lume risultava pieno di muco, enterociti, eritrociti, cellule mucipare e di parti intere dell’epitelio della mucosa (Fig.20c). Inoltre è stato possibile osservare un incremento del numero di cellule rodlet nella mucosa intestinale (Fig.22b).

Cambiamenti moderati (2) e pronunciati (3) sono stati osservati rispettivamente nel 17% e nel 33% delle spigole appartenenti allo stesso gruppo (Fig.23b).

Dopo 90 giorni di esposizione, la metà degli individui (50%) di entrambi i gruppi MPV e MPI ha mostrato gravi alterazioni strutturali dell’intestino distale (4) (Fig.23c; Fig.21b,c). Il loro quadro istologico appariva lo stesso di come descritto precedentemente per il

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gruppo MPI a 60 giorni di esposizione, eccetto che per un’evidente perdita della regolare struttura degli strati della sierosa, muscolare e sottomucosa e delle connessioni tra questi strati, come si evince dalle Fig.22c. Il resto degli individui (50%) in entramabi i gruppi (MPV, MPI) presentavano invece pronunciate alterazioni (3) (Fig.23c).

I risultati dell’analisi di PERMANOVA a due fattori “nested” o gerarchizzati, effettuata sul punteggio attribuito alle alterazioni istologiche dell’intestino posteriore (da 0 a 4), hanno mostrato differenze significative solo tra i livelli del fattore “trattamento “ a 30 giorni (p<0,05), e differenze altamente significative a 60 e 90 giorni (p<0,01); non sono state invece rilevate differenze significative per il fattore intersezione “vasca x trattamento” a tutti i tempi di esposizione. I confronti a coppie (Pair-wise), mostrano differenze significative (p<0,05) per CTRL vs MPI e MPI vs MPV a 30 e 60 giorni, e tra il CTRL e gli altri due gruppi a 90 giorni (Fig.23).

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Fig.19. Sezione trasversale dell’intestino distale di Dicentrarchus labrax esposte cronicamente a microplastiche per 30 giorni (a) CTRL (b) MPV (c) MPI. L, lume; V, villi. (H&E; 10x).

Fig.20. Sezione trasversale dell’intestino distale di Dicentrarchus labrax esposte cronicamente a microplastiche per 60