INDICI MORFOMETRIC

3.5.1. Indici Biometrici

Su tutti gli individui campionati sono stati rilevati il peso totale (P), la lunghezza totale (LT) e la lunghezza alla forca (LF) (Fig.8).

- _{lunghezza totale (LT): misura la distanza dall’estremità anteriore del capo alla parte} distale della pinna caudale;

- lunghezza alla forca (LF): misura la distanza dall’estremità anteriore del capo fino all’estremità del raggio più corto della pinna caudale;

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Fig.8. Lunghezza totale (LT) e lunghezza alla forca (LF) in D. labrax.

3.5.2. Indici somatici

I dati biometrici sono stati utilizzati per calcolare i seguenti indici somatici: - Indice epatosomatico o Hepatosomatic index HSI:

100 x peso del fegato(g)/peso totale(g)

- _{Fattore di Condizione o Condition Factor CF:} 100 x peso totale(g)/lunghezza totale3 _(cm3₎ 3.6. ANALISI ECOTOSSICOLOGICHE

3.6.1. Erythrocytic Nuclear Abnormalities (ENA) assay

Per i test di genotossicità, una frazione di sangue interoestratto dalla vena caudale con siringhe eparinizzate delle spigole campionate è stata utilizzata per lo striscio di sangue.I vetrini sono stati fissati in metanolo per 10 minuti, e lasciati asciugare all’aria. Poi sono stati immersi per 30 min in una soluzione contenente il colorante Giemsa diluito al 5% in tampone Sorensen (Na2HPO4 H2O; KH2PO4 50:50), quindi lavati con acqua deionizzata e lasciati asciugare all'aria. Al microscopio ottico ad immersione (Olympus

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BX41), sono stati contati 1000 eritrociti maturi, per campione (Pacheco & Santos, 1996) e

rilevate le anomalie nucleari. La frequenza totale di anomalie è data dalla somma delle 4 tipologie di anomalie (espressa come frequenza ‰).

Le 4 anomalie sono mostrate nella figura 9:

1. nucleo kidney (piccola depressione da una parte del nucleo); 2. nucleo lobato (nucleo a forma di ameba o di cuore);

3. nucleo segmentato (nucleo strizzato in due parti connesse); 4. micronucleo.

Fig. 9. Eritrociti maturi con micronuclei e anomalie nucleari: nuclei kidney (a, b), nuclei lobati (c, d), nuclei segmentati (e), micronuclei (f), eritrociti maturi (g) e nucleo normale (h).

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3.6.2. Attività etossiresorufina-O-deetilasi (EROD)

E’ stata valutata l’induzione del complesso delle monoossigenasi a funzione mista (MFO) nei campioni di fegato delle spigole di ciascun trattamento (CTRL, MPV, MPI) durante i tre campionamenti (T30,T60 e T90).

Inizialmente è stata isolata la frazione cellulare definita S9, contenente il citosol e la frazione microsomiale. Per ogni campione di fegato è stata pesata quindi un’aliquota di 300-500 mg di tessuto a cui è stata aggiunta una quantità di tampone saccarosio 0,25 M (pH 7,5), corrispondente a 4 ml di tampone/g tessuto. Ciascun campione, mantenuto in ghiaccio, è stato omogenato in Potter (10 passaggi a 440 giri/min). L’omogenato ottenuto è stato centrifugato per 20 minuti a 9000 giri a 4°C; il pellet ottenuto (frazione mitocondriale e nucleare) è stato eliminato, mentre il sovranatante (frazione S9) è stato utilizzato per il test EROD.

La valutazione dell’attività EROD è stata misurata nella frazione S9 in accordo con la metodica elaborata da Lubet et al., (1985) che quantifica, tramite lettura fluorimetrica, la trasformazione dell’etossiresorufina (substrato specifico) in resorufina.

In cuvette di quarzo è stata posta la seguente miscela di incubazione: - 2,13 ml di tampone TRIS HCl 50 mM, MgCl2 25 mM (pH 7,5) - 10 µl etossiresorufina (0,1 mg/ml)

- 100 µl S9.

La cuvetta di quarzo contenente la miscela è stata alloggiata nella cella di lettura (mantenuta a temperatura costante di 32°C) del fluorimetro (Perkin Elmer LS 50B: eccitazione 522 nm; emissione 586 nm). Dopo un intervallo di tempo variabile fra i 20 e i 40 sec, alla miscela sono stati aggiunti 10 µl di NADPH 125 µM che, essendo un donatore di elettroni, funge da start per la reazione enzimatica. Lo strumento registra la cinetica di reazione per i successivi 240 sec, e successivamente, calcola il δ di

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fluorescenza/min. I campioni sono stati analizzati in doppio e l’attività EROD è stata espressa come pmol substrato × min-1 _{× mg prot}-1_{, in relazione ad una curva standard di}

resorufina.

3.6.3. Analisi Perossidazione Lipidica (LPO)

Il livello di perossidazione lipidica è stato misurato nel fegato delle spigole campionate tramite la quantificazione di un prodotto secondario del processo di perossidazione, la malondialdeide (MDA), secondo il metodo proposto da Ohkawa et al., (1979) e Bird & Draper, (1984), modificato. Il test quantifica, tramite lettura spettrofotometrica, il contenuto di TBARS (specie reattive dell’acido tiobarbiturico) formati in seguito alla reazione di MDA con il TBA (acido tiobarbiturico).

Ad 1 ml di TCA al 12% in soluzione acquosa sono stati aggiunti 100 µl della miscela preparata prima (150 µl omogenato + 5 µl BHT) e agitati in vortex. Poi sono stati aggiunti 900 µl di tampone Tris HCl 60 mM (pH 7,4) ed 1 ml di TBA allo 0,73%. La miscela è stata quindi posta in bagno termostatato a 100°C per 1 h. Ciascun campione è stato trasferito in apposite provette e centrifugato a 13400 giri per 5 min a 4°C. Per la lettura spettrofotometrica (Agilent Technologies Cary 60 UV-Vis) effettuata ad una lunghezza d'onda di 535 nm è stato utilizzato 1 ml del sovranatante. Prima è stata effettuata la lettura del bianco e poi analizzati i campioni in doppio e il livello di LPO espresso come nmol TBARS formati × mg prot-1_{, usando un coefficiente di estinzione molare pari a 1,56 x}

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3.6.4. Analisi istologica del fegato ed intestino

Per le analisi istologiche sono stati campionati i fegati e gli intestini di sei (6) spigole per trattamento (2 per ogni replica) ad ogni campionamento (T30,T60 e T90) per un totale di 54 pesci.

Le porzioni d’organo prelevate, sono state campionate dalla parte centrale dell’organo con dimensioni al di sotto di 1cm3_{, disposte all’interno di biocassette ed immediatamente}

fissate in liquido di Bouin. Dopo 24h le biocassette sono state conservate in alcool a 70°. A questo punto si è proceduto per tutti i campioni con le operazioni di disidratazione attraverso il passaggio nella serie crescente di alcol (80°, 90°, 95°, 100°), chiarificazione in xilene ed inclusione in paraffina.

Mediante un microtomo rotativo (Leitz, 1516) sono state ottenute quattro sezioni di 5µm di spessore, successivamente montate su un vetrino portaoggetto. Tali sezioni sono state poste in stufa a 37° C over-night e poi colorate con Ematossilina & Eosina (H&E). Per le indagini istopatologiche ed istomorfometriche, i vetrini così allestiti sono stati osservati al microscopio ottico (Leica DMR) dotato di telecamera (DFC295) e le immagini acquisite ed analizzate tramite il software IM-1000 (Leica).

Dopo aver valutato lo stato delle quattro sezioni ed accertato che non ci fossero differenze strutturali, le indagini sono state effettuate su una sezione selezionata at random dal vetrinorispettivamente per ogni organo incluso.

Fegato

Sulle sezioni epatiche è stata effettuata una prima indagine qualitativa. Successivamente sulle stesse sezioni sono stati determinati i seguenti parametri istomorfometrici in quanto indicatori dell’attività epatica (Dabrowska et al., 2012):

• numero di epatociti per area (30,000 µm2); • area del nucleo degli epatociti (µm2).

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Per le analisi istomorfometriche del fegato il numero di epatociti e le dimensioni dei loro nuclei sono stati valutati all’interno di un’area di 30,000µm2 _{per ogni fegato di spigola}

campionata. Per tale motivo, sono state scattate 3 foto a 40x d’ingrandimento di ogni sezione analizzata e per ogni foto è stata selezionata at random un’area da 10,000 µm2

all’interno della quale sono stati rilevati i parametri succitati.
Intestino

Tutti i campioni di intestino sono stati suddivisi nei tratti prossimale (IP) medio (IM) e distale (ID).

Le alterazioni istopatologiche dell'intestino sono state valutate mediante un analisi semi- quantitativa con l'assegnazione di un punteggio (da 0 a 4) (0 normale struttura; 1 lievi alterazioni strutturali; 2 alterazioni strutturali moderate; 3 alterazioni strutturali pronunciate; 4 gravi alterazioni strutturali) secondo lo schema riportato in tabella 7.

Tab. 7. Alterazioni istopatologiche dell’intestino.

Per valutare l’integrità funzionale della mucosa intestinale è stato considerato il seguente indice morfometrico (Giari et al., 2007):

• numero di cellule mucipare o goblet cells.

Per l’analisi istomorfometrica dell’intestino il numero di goblet cells è stato individuato all’interno di un’area di 600,000 µm2_{. Sono state quindi scattatte 4 foto ad ingrandimeno}

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10x rappresentative di ogni sezione trasversale analizzata. Successivamente per ogni sezione fotografata, sono state selezionate at random diverse aree dei villi intestinali fino ad arrivare ad un’area totale di 600,000 µm2_.

3.6.5. Analisi istologiche delle neoformazioni

Per le analisi istologiche delle neoformazioni, sono state processate tutte le strutture rilevate nella cavità celomatica delle spigole campionate.

La maggior parte di queste strutture non superava le dimensioni di 1 cm e per tale motivo sono state trattate interamente. Le neoformazioni, le cui dimensioni superavano 1 cm, sono state invece ridimensionate.

I campioni sono stati processati con le tecniche istologiche standard precedentemente descritte per i campioni di fegato ed intestino e colorati in Ematossilina ed Eosina (H&E).