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Determinazione della costante di equilibrio e della stechiometria attraverso

6. Appendice

6.4. Determinazione della costante di equilibrio e della stechiometria attraverso

Esprimendo l’interazione tra un complesso C e un sito attivo della proteina P con l’equazione:

𝐶 + 𝑃  CP

la cui costante di equilibrio è espressa dall’equazione 6.7.

Se CP è la concentrazione totale della proteina e N è il numero si siti attivi per ogni proteina, la concentrazione totale dei siti vale:

[𝑃] = 𝑁𝐶

Seguendo l’ipotesi di Scatchard, i siti indipendenti tra loro sono saturati in modo tale che l’equazione della massa si applica nella sua classica forma, ovvero:

[𝑃] = [𝐶𝑃] + [𝑃]

Combinando l’equazione 6.17 e 6.18 si ottiene:

(6.15)

(6.16)

(6.17)

(6.18)

Appendice 87

[𝐶𝑃] + [𝑃] = 𝑁𝐶

Introducendo il fattore 𝑟 =[ ]= l’equazione 6.20 diventa:

𝑟𝐶 + [𝑃] = 𝐵𝐶 → [𝑃] = 𝐶 (𝐵 − 𝑟)

Infine, dall’equazione 6.7 e 6.21 si ottiene l’equazione di Scatchard (equazione 6.22).

[ ]= 𝐾 𝑁 − 𝐾 𝑟

Il grafico di r/[D] contro r è lineare con la pendenza uguale a –Ksc e l’intercetta sul’asse delle x è uguale a N. Secondo la trattazione di Scatchard, il reciproco di N fornisce la stechiometria della reazione di formazione dell’addotto proteina/complesso, definito in equazione 6.18, e indicata come n.

La linearità, con l’equazione 6.22, è ottenuta raramente e solo nel caso in cui sia presente una sola classe di siti attivi indipendenti nella struttura della proteina che, oltretutto, devono essere saturati in maniera ordinata, senza spazi vuoti tra un sito attivo occupato e il seguente. Questo si verifica quando N=1.

Quando i siti non sono indipendenti ed è presente un certo grado di cooperatività tra di essi, alcuni siti attivi non possono essere occupati e l’equazione di Scatchard non può più fornire un modello valido per l‘equilibrio. La costante di equilibrio non è più costante ma è una funzione del grado di saturazione della proteina. In particolare, Ksc aumenta per una cooperatività positiva e diminuisce per una cooperatività negativa, producendo un grafico con delle concavità opposte.

Questo problema è stato razionalizzato da Mc Ghee e Von Hippel attraverso modelli matematici, introducendo un fattore correttivo nell’equazione di Scatchard. Gli autori hanno dimostrato che il grafico di Scatchard potrebbe mostrare una deviazione dalla linearità alla fine della titolazione, con valori di r elevati.

(6.20)

(6.21)

Appendice 88

Il valore di N è quindi più piccolo del valore reale di 1/n. I due valori sono legati dalla

relazione

𝑛 =

.

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