3. Risultati e discussione
3.7. Studio delle interazioni dei complessi carbenici NHC con proteine (BSA)
La possibile interazione di complessi organometallici con albumina del siero bovino (BSA) è stata studiata attraverso metodi spettrofluorimetrici. Per valutare l’interazione dei composti con albumina sono state eseguite micro titolazioni spettroscopiche di soluzioni di BSA (circa 10-7 M). Volumi noti di soluzioni dei complessi di Au(I)NHC (7, 8 e 15) e di Cu(I)NHC (10) sono stati aggiunti direttamente nella celletta contenente la proteina mediante una microsiringa Hamilton di vetro collegata ad una vite micrometrica (aggiunta minima 0.164 μL). In seguito ad ogni aggiunta è stato registrato uno spettro per valutare se e come come cambiasse l’intensità del segnale. Si osserva una variazione di segnale durante la titolazione; in particolare la fluorescenza emessa dalla BSA decresce all’aumentare del contenuto del complesso metallico.
Risultati e discussione 61
Riportando in grafico i valori delle concentrazioni di complesso in soluzione contro la variazione del segnale di emissione della BSA (ΔF = F – F°) preso a 338 nm (normalizzata rispetto alla concentrazione di BSA) è stata ottenuta la curva di titolazione che descrive il comportamento del sistema, definita isoterma di binding. In figura 3.44 è riportata a titolo di esempio una isoterma di binding, ovvero quella ottenuta nel caso del complesso 7. Il valore di F° è ottenuto registrando lo spettro di una soluzione contenente solo BSA e i valori di F sono misurati a seguito dell’aggiunta di volumi noti di una soluzione contenente il complesso.
Soluzioni dei complessi, in presenza del tampone di riferimento, sono stati analizzati tramite spettroscopia UV-Vis, allo scopo di verificare la loro stabilità termica, registrando spettri a temperatura crescente. I complessi 7, 8 e 15 sono stabili in soluzione fino a oltre 45°C. Non è stato possibile ottenere informazioni riguardo la formazione dell’addotto tra il carbene di rame iPrCuSR (10) e la BSA perché quest’ultimo risulta essere instabile in soluzione sopra i 35°C. 0 100 200 300 400 500 600 700 280 300 320 340 360 380 400 420 440 nm
Fluorescenza di BSA senza aggiunta del complesso Fluorescenza di BSA dopo le aggiunte del complesso
Figura 3.43. Variazione nella emissione di fluorescenza della BSA in seguito ad aggiunte crescenti di
iPrAuCl, C
BSA = 1.50·10-6, CiPrAuCl =4.76·10-4 M; 25°C, tampone cacodilato 0.01M, [NaCl] = 0.5M, [NaCaco]
Risultati e discussione 62
Il quenching in fluorescenza si riferisce a qualsiasi processo che causa la diminuzione del’'intensità della fluorescenza di un campione e una varietà di interazioni molecolari potrebbero essere causa di questo fenomeno come, ad esempio, riarrangiamenti molecolari, trasferimenti di energia, formazione di legami e collisioni. In generale, i meccanismi di quenching sono classificati come statici oppure dinamici. Essi vengono descritti dall’equazione di Stern Volmer (equazione 3.1).
= 𝐾 [𝐶] + 1
Il quenching dinamico dipende solo da urti governati dalla diffusione e, di conseguenza, per tale fenomeno ad alte temperature si osserva un aumento della costante di Stern Volmer (Ksv). Quello che interessa per i nostri studi è, invece, il quenching statico che è relativo alla formazione di un vero e proprio addotto tra proteina e quencher (C). Se ne deduce che, nel caso di una Ksv che non aumenta con la temperatura si può sicuramente concludere che avviene la formazione di una addotto, mentre nel caso di un aumento di Ksv occorrono studi più approfonditi (ad es. di misure di tempi di vita) per discriminare tra quenching statico e dinamico. Non è stato possibile eseguire la trattazione dei dati ottenuti dalle titolazioni di tutti i complessi con l’equazione di Stern-Volmer classica (equazione 3.1) a causa di una deviazione dalla linearità della retta con una concavità verso il basso, caratteristica della presenza di due popolazioni differenti di fluorofori. Questo fenomeno potrebbe essere dovuto alla diversa accessibilità, nei confronti delle
-18 -16 -14 -12 -10 -8 -6 -4 -2 0 0 1 2 3 4 5 6
ΔF
/C
BS A(∙1
0
-8M
-1)
[
iPrAuCl](10
-5M)
Figura 3.44. Isoterma di binding a λem= 338.04 nm del sistema iPrAuCl/BSA a 25°, CBSA = 1.50·10-6, CiPrAucl =
0M ( --- ) CiPrAuCl = 7.41·10-5 M; λexc = 280 nm, fend 2.5nm/2.5nm.
Risultati e discussione 63 molecole di quencher, dei residui triptofanici presenti sulla proteina. I dati sono stati trattati con una modifica della Stern-Volmer (equazione 3.2).136
=
[ ]+
dove fa rappresenta la frazione dei siti totali raggiungibili dal quencher.
L’equazione di Stern Volmer (equazione 3.2) permette di calcolare graficamente Ka e fa. Un grafico di F0/ΔF contro 1/[C] permette di calcolare fa e Ka.
In tabella 3.5 sono riportati i valori di Ka e fa dei tre complessi (7, 8 e 15) sottoposti a titolazione fluorimetrica.
iPrAuCl (7) iPrAuSR (8) iPr(SO
3Na)AuCl (15)
T° (K)
K
sv (104M-1)f
aK
sv (105M-1)f
aK
sv (104M-1)f
a 283 5.97±1.06 0.28±0.01 0.10±0.04 0.53±0.02 2.11±1.81 0.32±0.06 298 3.15±0.46 0.29±0.01 4.81±0.11 0.42±0.05 3.81±0.82 0.42±0.23 316 5.00±0.92 0.35±0.02 14.52±1.26 0.25±0.03 20.6±4.3 0.33±0.01 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 0 5 10 15 20 25 30 F0 /Δ F 1/[C] (105M-1)Tabella 3.5. Costante di quenching Ksv e frazione di siti accessibili fa per i diversi sistemi NHC/BSA a
diverse temperature.
Figura 3.45. Grafico dell’equazione di Stern-Volmer modificata (equazione 3.2) per il sistema iPrAuCl/BSA a
25°C.
Risultati e discussione 64 I complessi 8 e 15 possiedono valori di Ksv che, al di là di un errore piuttosto elevato dovuto alla complessità del sistema, crescono con la temperatura di un ordine di grandezza tra 25 e 45°C. Non si può quindi essere sicuri che ci sia una interazione di legame ma si potrebbe avere anche semplicemente quenching dinamico. Il complesso 7, invece, possiede valori di Ksv che possono essere considerati costanti e, di conseguenza, si può ipotizzare la formazione di legami tra i residui cisteinici, affini all’oro, e il centro metallico che ha perduto il suo legante alogenuro.137 Il complesso 8 al contrario possiede un legante ancillare tioglucosidico con cui il centro di oro(I) forma un legame più forte, mentre il complesso 15 porta due gruppi solfato carichi sui sostituenti arilici. Queste variazioni strutturali potrebbero essere la causa dell’assenza di interazioni in tempi brevi tra i siti attivi della BSA e i complessi metallici. Per approfondire la conoscenza di queste interazioni bisognerebbe proseguire con studi che permettano di considerare cinetiche più lente, come ad esempio esperimenti di fusione dopo incubazione, per qualche giorno, di miscele complesso/BSA.
I dati delle titolazioni fluorimetriche sono stati trattati per ottenere delle informazioni riguardo all’andamento della costante di equilibrio e della stechiometria di reazione del sistema BSA/quencher.
Una prima analisi è stata condotta sulla base di un modello approssimato che prevede la formazione di un addotto complesso:proteina di tipo 1:1 (equazione 3.3). I valori di Keq,
-10 -9.5 -9 -8.5 -8 -7.5 -7 -6.5 -6 -5.5 -5 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 CBS A /Δ F (1 0 -9M ) 1/[C] (105M-1)
Risultati e discussione 65 ottenuti come rapporto tra intercetta e pendenza di un grafico CBSA/ΔF contro 1/[Q], sono riportati in tabella 3.6.
=
+
[ ]
L’analisi sopra citata permette anche una valutazione accurata di da impiegare per una analisi secondo un modello migliorato che preveda stechiometrie diverse dalla 1:1 (equazione 3.4).138
[ ]
=
( )
( ( ) )
dove 𝑟 =[ | ]
= è il grado di riempimento della macromolecola mentre n è la stechiometria di reazione complesso/numero di siti sulla proteina In figura 3.47 è mostrato un esempio di grafico di r/[C] contro r del sistema iPrAuCl (7).
0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 r/ [C ]( 10 -5 M -1 ) r
Figura 3.47. Grafico basato sull’equazione 3.4 per il sistema iPrAuCl/BSA a pH 7.2, T = 25°C. L’intercetta
fornisce il valore di Keq mentre l’intercetta sull’asse delle x fornisce il reciproco di n.
(3.4) (3.3)
Risultati e discussione 66 In tabella 3.6 sono riportati i valori di Keq, Ksc ed nottenuti con le equazioni 3.3 e 3.4 alle diverse temperature, peri complessi 7, 8 e 15.
iPrAuCl (7)
T° (K) K
eq (105M-1)n
K
sc(105M-1)283 3.22±0.9 0.92 6.7±1.2
298 4.32±0.2 0.99 3.1±0.5
316 6.40±1.1 1.02 7.5±1.3
Va ricordato che nel caso dei complessi (8) e (15) i dati sono puramenti indicativi in quanto mancano misure volte a confermare l’effettiva formazione di un complesso. Riferendoci quindi per adesso unicamente alla specie iPrAuCl (7), si nota che questo reagisce secondo con la BSA con una stechiometria 1:1. Per quanto riguarda la dipendenza dei valori di equilibrio dalla temperatura va premesso che purtroppo per questo sistema il metodo è affetto da errori elevati che non ci permettono di affermare con sicurezza che le costanti di equilibrio siano significativamente diverse. Secondo questi risultati la Keq non varia con la temperatura o, comunque, la variazione è bassa. Date le considerazioni fatte fino ad ora, ci sentiamo di ipotizzare che solamente il complesso iPrAuCl (7) si leghi a uno dei siti attivi della proteina (BSA), con un legame covalente tramite sostituzione del legante ancillare secondo una cinetica veloce. I complessi iPrAuSR (8) e iPr(SO
3Na)AuCl (15), invece, non si legano ai siti attivi della BSA in tempi brevi, ma non si esclude un meccanismo più lento per la formazione dell’addotto. I dati ottenuti, inoltre, andrebbero confrontati con quelli ottenuti attraverso altre tecniche analitiche per garantire la robustezza dei valori raccolti come esperimenti di melting dopo incubazione della BSA con i complessi per alcuni giorno. Inoltre, ulteriori esperimenti di interazioni potrebbero essere condotti utilizzando tecniche ESI-MS.
Tabella 3.6. Parametri termodinamici Keq , Ksc e numero di siti attivi n (equazioni 3.3 e 3.4) ricavati per
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