Dopo aver osservato che le cellule di melanoma in studio esprimevano sia Cx26 e Cx43, abbiamo proceduto andandone a valutare la presenza a livello proteico attraverso studi di immunocitochimica e Western Blot.
Abbiamo utilizzato la tecnica dell’immunoperossidasi al fine di eseguire una prima sommaria valutazione dell’espressione proteica e della localizzazione della Cx43 e Cx26 e degli altri target in esame nelle linee in studio. Questa tecnica è stata inoltre utile al fine di valutare il funzionamento degli anticorpi primari utilizzati (dato non riportato).
La tecnica dell’immunofluorescenza è stata eseguita secondo il protocollo descritto nello specifico capitolo riportato in “Materiali e Metodi”. Essa ha permesso di determinare la presenza e la localizzazione dei target d’interesse ovvero le connessine Cx26, Cx43, Cx43 fosforilata (sulla serina 368), e le proteine fosforilate da PKC e RhoA. Abbiamo scelto di effettuare inoltre una colorazione del nucleo in tutte le cellule per permettere una migliore localizzazione dei target analizzati mentre la visualizzazione dei microfilamenti costituiti da actina F con l’uso della falloidina è stata utile per evidenziare la forma delle cellule.
I risultati della Figura 19 mostrano la presenza e la localizzazione di Cx26,Cx43 e RhoA nelle linee cellulari analizzate.
Capitolo IV Risultati e Discussione
Figura 19. Rappresentazione riassuntiva dell’analisi con immunofluorescenza dei campioni analizzati
4.2.1 Espressione proteica di Cx26
L’analisi di immunofluorescenza delle cellule A-375, 501Mel e MeWo evidenzia l’espressione della Cx26 (in verde), nelle linee cellulari in studio
Capitolo IV Risultati e Discussione
Figura 20. Presenza e localizzazione di Cx26 nella linea MeWo, 501Mel e A-375
Nelle MeWo, la connessina Cx26 risulta essere localizzata sia a livello citoplasmatico che nucleare, come è possibile osservare dall’analisi tridimensionale riportata in Figura 21.
Capitolo IV Risultati e Discussione
Figura 21. Rappresentazione 3D dell’espressione della Cx26 (verde) nella linea cellulare MeWo. Il nucleo è rappresentato in blu mentre i microfilamenti di actina F sono visualizzabili in rosso.
Nelle cellule 501Mel, Cx26 risulta essere invece situata sulla membrana citopasmatica in forma maggiormente organizzata, mentre nelle A-375 il segnale fluorescente di Cx26 è rilevabile prevalentemente a livello citoplasmatico (Figura 20).
I livelli di espressione proteica della Cx26 nelle cellule appartenenti alle linee A-375 e MeWo sono stati analizzati anche mediante Western Blot. Le bande ottenute dallo sviluppo della membrana di nitrocellulosa sono state analizzate tramite densitometria attraverso il software ImageQuant™TL. I dati sono stati normalizzati sull’housekeeping β-actina, così da poter ottenere
Capitolo IV Risultati e Discussione
Diversi esperimenti sono stati necessari al fine di raggiungere una messa a punto della tecnica, in quanto quest’ultima non era mai stata effettuata per la valutazione dell’espressione delle connessine all’interno del nostro laboratorio. Il primo esperimento condotto su campioni di A-375 e MeWo ha visto l’utilizzo del tampone di lisi RIPA (Santa Cruz Biotechnology). Sui lisati così ottenuti sono stati testati due anticorpi differenti a diverse concentrazioni senza ottenere mai le bande di interesse. L’anticorpo monoclonale di topo CX- 12H10 (Thermo-Fischer) diretto verso il loop citoplasmatico della Cx26 è stato utilizzato sia alla diluizione consigliata dal fornitore (1:500) sia a una diluizione cinque volte maggiore (1:100), ma in entrambi gli esperimenti non ha portato alla rilevazione di segnali. Abbiamo ipotizzato che il mancato funzionamento di tale anticorpo potesse essere dovuto alle condizioni di lavoro denaturanti (uso di SDS e Laemmli), che in genere causano perdita della struttura secondaria e terziaria della proteina. In questo modo, un’eccessiva denaturazione potrebbe aver reso non riconoscibile l’epitopo, collocato nel loop citoplasmatico della connessina Cx26 che per sua natura ha una forma ripiegata. E’ stata pertanto valutata, ma non ancora messa in pratica, la possibilità di utilizzare condizioni native, non denaturanti.
Sugli stessi campioni l’anticorpo policlonale prodotto nel coniglio sc130729 (Santa Cruz Biotechnology) diretto verso un epitopo situato nelle vicinanze del dominio C-terminale della Cx26 non ha mostrato bande alla diluizione consigliata di 1:200. Ha mostrato, invece, alla diluizione di 1:100, alcuni segnali a svariate altezze, ma non a 26 kDa (corrispondente al peso molecolare della proteina analizzata).
Al fine di migliorare l’estrazione delle proteine di membrana e quindi incrementare la sensibilità della tecnica abbiamo quindi deciso di utilizzare tamponi di lisi in grado di arricchire il lisato di proteine transmembranarie tra cui le connessine, note soprattutto per tale tipo di localizzazione. I tamponi di lisi scelti erano costituiti da TRIS-HCl 20 mM, NaCl 150 µM e differiscono per la presenza di due diversi detergenti: Triton X100 all’1% e NP-40 (Igepal) allo 0,5%.
Capitolo IV Risultati e Discussione
Dalle linee A-375 e MeWo abbiamo quindi ottenuto degli estratti proteici secondo la procedura descritta in “Materiali e Metodi”. Abbiamo condotto l’esperimento in doppio, utilizzando sia campioni in cui la denaturazione era favorita da alte temperature sia campioni sottoposti a condizioni di temperatura denaturanti attraverso bollitura per 8 minuti.
L’utilizzo di tamponi in grado di arricchire l’estratto in proteine transmembranarie ha portato alla visualizzazione di segnali attribuibili alla Cx26 in quanto, secondo l’analisi con il software ImageQuant™TL, sono state riscontrate bande all’altezza di circa 26 kDa (Figura 22).
Figura 22. Western Blot di messa a punto con tamponi di lisi indicati per una migliore estrazione proteica delle proteine di membrana
A parità di quantità di campione caricato, il segnale risultava più intenso nei campioni non bolliti rispetto a quelli bolliti ed in particolare in quelli ottenuti estraendo le proteine con il tampone contenente Triton X100 all’1%. La
Capitolo IV Risultati e Discussione
denaturazione termica era probabilmente dovuta alla possibilità di causare, ad alte temperature, la precipitazione della proteina di interesse, soprattutto in presenza di regioni idrofobiche, come per i domini transmembranari delle connessine.
Inoltre, da questa prima analisi risultava che Cx26 era maggiormente espressa nella linea cellulare MeWo rispetto alle A-375, dato apparentemente in linea con l’analisi di immunofluorescenza. Ripetendo il protocollo sperimentale su altri campioni di MeWo ed A-375 abbiamo ottenuto risultati analoghi (Figura 23).
Figura 23. Espressione proteica di Cx26 e β-actina secondo l’analisi di Western Blot condotto su cellule MeWo ed A-375.
Questi esperimenti evidenziano inoltre, segnali non corrispondenti al peso molecolare della proteina in esame (Figura 22). Dato che la formazione di polimeri risiede nella natura intrinseca delle proteine in esame, abbiamo ipotizzato che tale evidenza potesse essere correlata alla capacità dell’anticorpo di riconoscere l’epitopo localizzato sul dominio C-terminale della connessina sia in forma monomerica sia in forma polimerica organizzata.
Capitolo IV Risultati e Discussione Dall’analisi densitometrica e dalla normalizzazione ottenuta utilizzando la β- actina come housekeeping, abbiamo dimostrato che Cx26 è espressa per il 34% in più nelle MeWo rispetto alle A-375, dato in linea con il precedente esperimento e apparentemente anche con il dato in immunofluorescenza. L’andamento dei livelli di espressione proteica, osservati con diverse metodiche, non corrisponde a quello osservato a livello trascrizionale. Questa differenza può essere attribuita, in parte, al fatto che non esiste una correlazione semplice e lineare tra trascrizione e sintesi proteica, in quanto molto eventi possono intervenire tra questi due processi biologici [50].
Inoltre, è stato dimostrato che Cx26 risulta poco espressa non solo nei nevi ma anche nei melanomi confinati allo strato basale dell’epidermide; invece, essa sembra aumentare durante i processi di invasione del derma ed in particolare nelle cellule tumorali che invadono il compartimento linfonodale. Questa evidenza sembra essere concorde con quanto da noi rilevato a livello proteico poiché MeWo, una linea cellulare derivante da melanoma metastatico linfonodale, ha dimostrato di avere livelli proteici più elevati delle cellule di melanoma primario A-375.[51]
4.2.2 Espressione proteica di Cx43
L’analisi di immunofluorescenza ha evidenziato l’espressione della Cx43 in tutte le linee cellulari analizzate (Figura 24).
Capitolo IV Risultati e Discussione
Figura 24. Presenza e localizzazione di Cx43 nella linea MeWo, 501Mel e A-375
Dalla Figura 24 possiamo osservare come i livelli di espressione della Cx43 appaiano maggiori nella linea MeWo, intermedi nell 501Mel e minori nelle A- 375.
È possibile inoltre osservare una diversa localizzaione della Cx43 nelle linee cellulari in studio. Nelle MeWo appare situata a livello citoplasmatico e talvolta sulla membrana in forma organizzata, probabilmente in strutture polimeriche come i connessoni. Nelle 501Mel sembra trovarsi nel citoplasma e nelle A-375 è localizzata a livello citoplasmatico, oltre che in forma organizzata sulla membrana. Questo dato allo stato attuale dell’arte appare in contrasto con
Capitolo IV Risultati e Discussione l’analisi Real-Time PCR, anche se i dati di immunofluorescenza sono da confermare.
Questa evidenza sembra inoltre non mostrare una correlazione diretta tra status della mutazione BRAF e i livelli di espressione proteici della connessina in esame[49].
È stato dimostrato che Cx43 diminuisce nei primi stadi tumorali causando la perdita di contatti con i cheratinociti. Negli stadi successivi si ha un aumento dei livelli della stessa connessina, la quale facilita il processo di metastatizzazione, favorendo la diapedesi e la stabilizzazione dei contatti con le cellule endoteliali. Inoltre, tale incremento permette il passaggio di ioni e secondi messaggeri tra le cellule tumorali ed il microambiente che le circonda facilitando la progressione tumorale[31].
Questa evidenza sembra essere in linea con i risultati da noi ottenuti in quanto le MeWo e le 501Mel, appartenenti a linee tumorali metastatiche, hanno mostrato in immunofluorescenza una positività maggiore a quella della linea A-375, linea di tumore primario. Si renderà quindi opportuno verificare tali differenze ripetendo l’esperimento e utilizzando altre tecniche.
4.2.3 Espressione proteica di Cx43p e PKCps
Dopo aver osservato la presenza della Cx43 nelle linee cellulari in studio, abbiamo proceduto alla valutazione, sempre con immunofluoresenza, della Cx43 fosforilata sulla serina 368 e dei prodotti fosforilati della PKC. Tale analisi è stata effettuata al fine di valutare la presenza di eventuali meccanismi di regolazione del funzionamento delle connessine tramite fosforilazione del residuo di serina 368 della Cx43 da parte di PKC.
Per entrambi i target in oggetto non è stato rilevato alcun segnale (dato non riportato).
PKC non risulta attiva in quanto non sono presenti i suoi prodotti fosforilati e quindi possiamo dedurre che il meccanismo di fosforilazione attraverso tale
Capitolo IV Risultati e Discussione
regolazione attraverso la fosforilazione non avvengono sulla serina 368 della Cx43, poiché l’anticorpo in grado di legare la connessina con tale modificazione non ha permesso nessuna rivelazione di segnale.
Questo dato è plausibile poichè non tutti i tessuti mostrano meccanismi di fosforilazione sulla serina 368 della Cx43 da parte di PKC. Tale meccanismo è infatti attivo nel miocardio dove induce una riduzione della permeabilità dei canali costituiti da Cx43 [52], mentre non è presente nel colon in cui una alta
attività di PKC, dimostrata dagli alti livelli dei prodotti fosforilati, non è correlata alla fosforilazione della serina 368[53].
4.2.4 Espressione proteica di RhoA
RhoA, è un membro della famiglia proteica “Rho”, GTPasi, i cui membri regolano tra le altre cose l’assemblaggio e la riorganizzazione del citoscheletro di actina e il trasporto di proteine sulla membrana. Abbiamo deciso di visualizzarne la presenza e soprattutto la localizzazione di questa proteina poiché è un fattore implicato anche nel trasporto delle connessine.
Gli esperimenti effettuati dimostrano la presenza di RhoA nelle linee cellulari MeWo, 501Mel e A-375 (Figura 25).
Capitolo IV Risultati e Discussione
Figura 25. Presenza e localizzazione di RhoA nella linea MeWo, 501Mel e A-375
Come si può osservare dall’immagine sopra riportata, si ha una localizzazione differente di RhoA a seconda della linea analizzata. Mentre nelle Mewo e nelle 501Mel, RhoA è localizzata attorno al nucleo e nel citoplasma, nelle A-375 si trova localizzata sulla membrana cellulare. Tale localizzazione consente di presupporre che RhoA si trovi in forma attiva nelle cellule A-375 e in forma inattiva nelle cellule Mewo e 501Mel. Questi risultati sono in linea con dati precedentemente pubblicati da Derangeon (2008) i quali dimostrano come
Capitolo IV Risultati e Discussione
sembrava aumentare la permeabilità dei canali costituiti dalla Cx43 e la dimensione delle placche giunzionali che si formano nei cardiomiociti di ratto[18].