3.7.1 Metodi per immunoperossidasi
L’immunoperossidasi è una tecnica immunocitochimica che permette la visualizzazione di antigeni attraverso una reazione catalizzata da perossidasi, enzimi ossido-reduttasici che catalizzano la trasformazione dei perossidi organici secondo la seguente reazione: 2R−O−OH+2H+→ 2R=O+2H2O. Il protocollo prevede, innanzitutto, di effettuare degli opportuni trattamenti che permettano una adeguata permeabilizzazione della membrana, lo smascheramento antigenico e il bloccaggio di siti di legame aspecifici per gli anticorpi. Questo accorgimento serve per fare in modo che l’antigene, localizzato sulla membrana o all’interno della cellula, venga riconosciuto dall’opportuno anticorpo primario, al quale si legherà il corrispondente anticorpo secondario biotinilato.
In particolare, la biotinilazione dell’anticorpo secondario è fondamentale per consentirne il legame con la streptavidina, altamente affine alla biotina e coniugata a sua volta in vari siti con l’enzima perossidasi.
Nello specifico, dopo l’esposizione alla DAB e al perossido di idrogeno si avrà la polimerizzazione della DAB che apparirà come un precipitato bruno, indice della presenza dell’antigene. La streptavidina, coniugata con una perossidasi, consente di ottenere l’amplificazione del segnale dato dal cromogeno DAB. Per una visione ottimale delle cellule si utilizza anche la colorazione con Ematossilina che permette di evidenziare il nucleo (Figura 13).
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Figura 13. Schema dei meccanismi implicati nella visualizzazione con la tecnica dell’immunoperossidasi.
Le cellule A-375, 501Mel e MeWo sono seminate in spot su vetrini e mantenute in DMEM con 10% FBS, 1% penicillina streptomicina per 24 ore dopo le quali si procede con il fissaggio con 1% di paraformaldeide in PBS per 10 minuti a 4°C. Il fissativo è quindi aspirato ed i vetrini mantenuti a 4°C fino all’utilizzo. Gli spot cellulari sono delimitati con l’ausilio di una pap-pen ed i vetrini vengono quindi sottoposti a diversi lavaggi all’interno di una giara ed incubazioni in camera umida: Dopo essere stati immersi 5 minuti in acqua distillata i vetrini subiscono 3 lavaggi da 5 minuti in PBS 1X e una incubazione di 10 minuti Triton 0,2% al fine di promuovere lo smascheramento antigenico e la permeabilizzazione della membrana. In seguito si inibiscono le perossidasi endogene immergendo i campioni per 15 minuti al buio in una soluzione con H2O2 36v 3% in metanolo. Dopo l’incubazione per 20 minuti a 37°C degli spot
cellulari trattati con siero di capra al fine di bloccare eventuali siti di legame aspecifici degli anticorpi si effettua un lavaggio di 5 minuti con PBS 1X e si
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procede a incubazione overnight a 4°C con gli anticorpi primari diluiti in BSA 0,1% in PBS 1X. Il mattino successivo i vetrini sono tuffati in Tween 0,1% in PBS 1X, lavati in PBS 1X 5 minuti per 3 volte ed incubati per un’ora a temperatura ambiente con anticorpo secondario diluito 1:200 in siero di capra 1,5% in PBS Al fine di allontanare l’anticorpo secondario non legato seguiranno 3 lavaggi da 5 minuti in PBS 1X. In seguito all’incubazione con streptavidina per 30 minuti a temperatura ambiente si immergono i vetrini in Tween 0,1% in PBS 1X e si effettuano 3 lavaggi da 5 minuti in PBS 1X. Infine si incuba per 3 minuti al buio con diaminabenzidina ricostituita con perossido di idrogeno a 36 volumi e si tuffa il vetrino in Tween 0,1% in PBS 1X.
A questo punto si procede con la colorazione del nucleo delle cellule fissate con ematossilina immergendo i vetrini per 30 secondi in emallume e risciacquando 2 minuti con acqua corrente.
Successivamente avverrà la disidratazione graduale delle cellule immergendo il vetrino per 7 minuti in etanolo 96% e seguite da 3 immersioni in etanolo assoluto per 7 minuti. La chiarificazione delle cellule in analisi avviene effettuando 3 immersioni da 5 minuti in xilolo del vetrino che subisce il processo di diafanizzazione, opacizzazione atta a rendere visibile in microscopia il campione
Il vetrino è quindi montato; ovvero sigillato con l’apposito balsamo (Micromount, Diapath) su cui verrà apposto un vetrino coprioggetto. La visualizzazione avviene trascorse alcune ore dal montaggio attraverso il microscopio DMRB light microscope e DFC480 fotocamera digitale per la cattura delle immagini.
3.7.2 Metodi per immunofluorescenza
L’immunofluorescenza è una tecnica che appartiene all’immunocitochimica e permette, grazie ad anticorpi specifici coniugati con fluorofori, di determinare l’abbondanza e la localizzazione della molecola target. Questa tecnica viene
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mentre è indiretta se agli anticorpi primari si legano a secondari coniugati con fluorofori. La tecnica indiretta, quella che abbiamo scelto per questo progetto, permette l’amplificazione del segnale fluorescente in quanto gli anticorpi secondari si legano in vari siti del primario (Figura 14).
Figura 14. Schema di funzionamento della tecnica dell’immunofluorescenza diretta ed indiretta
Le cellule A-375,501Mel e MeWo sono seminate in spot su vetrini e fissate con le stesse tecniche utilizzate per l’immunoperossidasi.
I vetrini con le cellule fissate sono trattati con una soluzione di Triton 0,2% in PBS, lavati in PBS e incubati per un’ora a temperatura ambiente con Blocking Solution, così da bloccare eventuali siti di legame aspecifici per gli anticorpi. Gli spot cellulari sono quindi delimitati con l’ausilio di una pap-pen in modo da evitare contaminazioni tra anticorpi posizionati in differenti spot. In ogni spot è aggiunto l’opportuno anticorpo primario diluito in Blocking Solution (Tabella 2) e si lascia in incubazione overnight alla temperatura di 4°C.
Il giorno dopo i vetrini sono lavati in BS e incubati con gli anticorpi secondari (Tabella 3) per un’ora e mezza a temperatura ambiente ed al buio in modo da non eccitare i fluorofori. Sullo spot adibito alla visualizzazione dell’actina si applica quindi la falloidina diluita in MeOH e BS, mentre sugli altri spot si
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aggiunge solo BS e si incuba al buio per 20 minuti. Dopo 3 lavaggi in PBS si procede a colorare il nucleo applicando sugli spot il TO-PRO e, dopo 3 lavaggi in PBS per allontanare l’anticorpo non legato, si applica una soluzione 2:1 di glicerolo e PBS, si chiude con vetrino coprioggetto e si sigilla con lo smalto. Si procede quindi alla visualizzazione utilizzando il microscopio confocale Leica TCS SP8 (Leica microsystems).