3.8.1 Estrazione proteica e dosaggio proteico
Una volta che sono state staccate dal supporto, le cellule vengono centrifugate a 11000 rpm per 5 minuti e il pellet così ottenuto viene, prima, lavato con PBS e poi addizionato di 100 µL del tampone di lisi ricostituito al momento. Il campione viene vortexato fino alla dissoluzione del pellet ottenuto e, successivamente, si sonica per 3 volte per 10 secondi. Il lisato è quindi posto su ruota a velocità medio-bassa per un’ora in camera fredda e, in seguito, si centrifuga a 12000 rpm per 20 minuti a 4°C. In seguito a questa operazione si aspira il surnatante che costituisce il lisato e si mantiene a -80°C.
La quantizzazione è stata effettuata secondo il metodo di Bradford, un saggio analitico spettrofotometrico rapido che si basa sul contenuto aminoacidico delle proteine in analisi. In particolare questo saggio si basa sulla variazione di assorbanza del colorante Coomassie Brilliant Blue G-250, che in ambiente acido vede la forma rossa diventare blu legando le proteine. Per far avvenire questo processo la forma rossa del colorante dona il suo elettrone libero ai gruppi ionizzabili posti sulle proteine. Questo causa l’esposizione di tasche idrofobiche che, nella struttura terziaria, legano la regione non polare del colorante attraverso le forze di Van der Waals, posizionando i gruppi aminici positivi in prossimità delle cariche negative del colorante. Il legame delle proteine stabilizza la forma blu del colorante e l’aumento dell’assorbanza a 595 nm (lunghezza d’onda del blu) è indice di un aumento nella concentrazione
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Il protocollo prevede di preparare una soluzione costituita da: 780 µL di acqua 20µL di lisato proteico e 200 µL di soluzione Bio-rad Protein Assay. Dopo aver vortexato, si attendono 10 minuti e, ponendo il contenuto delle eppendorf in apposite cuvette, si effettua una lettura a 595 nm attraverso lo spettrofotometro GeneQuant Pro (GE Healthcare) che rileverà diversi tassi di assorbanza a seconda della concentrazione proteica.
È possibile determinare la concentrazione del campione in analisi utilizzando una retta di taratura (Figura 15) ottenuta usando, concentrazioni note di γ- globulina 0,1 mg/mL (riportate in Tabella 7) e gli stessi diluenti e coloranti. Si ottiene in questo modo il coefficiente di proporzionalità tra assorbanza e concentrazione proteica, che consentirà di risalire alle concentrazioni dei campioni analizzati dopo averne ottenuto l’assorbanza.
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Punto della retta γ-globulina 0,1
mg/mL (mL) Acqua (mL) Bradford (mL) A 0 0,8 0,2 B 0,01 0,79 0,2 C 0,02 0,78 0,2 D 0,04 0,76 0,2 E 0,08 0,72 0,2 F 0,16 0,64 0,2
Tabella 7. Quantità di standard, acqua e reattivo di Bradford utilizzati per ottenere ciascun punto della retta di taratura
3.8.2 Western Blot
Il Western Blot è una tecnica semi-quantitativa che permette di riconoscere e quantizzare le proteine attraverso l’utilizzo di specifici anticorpi. La proteina in esame è separata in base al suo peso molecolare mediante l’utilizzo di una corsa elettroforetica su gel di acrilammide. Le proteine sono quindi trasferite su di un supporto in nitrocellulosa al quale si legherà l’anticorpo primario. L’anticorpo secondario, diretto contro l’anticorpo primario, è marcato con una perossidasi di rafano, la quale in presenza di perossido di idrogeno ossida il luminolo, dando luogo alla chemioluminescenza, fenomeno registrabile attraverso lo strumento ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden). (Figura 16)
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Figura 16. Schema riassuntivo della tecnica del Western Blot: le proteine separate con SDS- PAGE sono trasferite su di una membrana di nitrocellulosa che viene trattata con anticorpo primario e secondario. Quest’ultimo permetterà l’emissione di chemiluminescenza.
La prima parte della procedura prevede di effettuare una separazione delle proteine servendosi dell’SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis), ovvero una corsa su gel di poliacrilammide che sfrutta le proprietà denaturanti dell’SDS. Quest’ultimo, infatti, denatura le proteine privandole della struttura secondaria e della terziaria; inoltre conferisce carica netta negativa a tutte le proteine permettendone una separazione sulla base esclusivamente del peso molecolare. Le proteine così complessate migrano verso il polo positivo con una mobilità inversamente proporzionale al Log10 del
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Per la corsa elettroforetica si utilizza un gel costituito da due parti a diversa percentuale di acrilammide/bisacrilammide: lo stacking e il resolving gel. Lo stacking gel, a bassa percentuale di acrilammide/bisacrilammide, permette di caricare i campioni e concentrarli negli appositi pozzetti in modo che inizino la corsa nello stesso punto. Il sottostante resolving gel consente, invece, di separare le proteine in base al peso molecolare, grazie alla sua maggiore concentrazione di acrilammide/bisacrilammide In particolare, abbiamo utilizzato uno stacking gel al 4% per ottenere un ingresso uniforme dei campioni nel gel ed un resolving gel al 12% per ottenere una buona separazione della Cx26, proteina con peso molecolare attorno ai 26 kDa Il primo gel ad essere preparato è il resolving gel. Esso è ottenuto preparando un tampone, mantenuto in costante agitazione, secondo quanto riportato in Tabella 8; soltanto pochi istanti prima del caricamento si aggiungono i catalizzatori APS 10% e TEMED, che permettono una rapida gelificazione. Il gel è ricoperto con acqua fino a completa gelificazione per evitare reazioni di ossidazione durante la polimerizzazione.
Si prepara quindi il tampone per lo stacking gel come riportato in Tabella 8 che, dopo l’aggiunta dei catalizzatori, è caricato sopra il resolving gel applicando il pettinino che permette la formazione dei pozzetti in cui verranno caricati i campioni.
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Sostanze Resolving gel 12% Stacking gel 4%
Acqua milliQ 3,4 mL 3,05 mL SDS 10% 100 μL 50 μL Resolving/stacking buffer 2,5 mL 1,25 mL Acrilammide/bisacrilammide 30% 4 mL 650 μL APS 10% 100 μL 50 μL TEMED 10 μL 10 μL
Tabella 8. Sostanze e relative quantità per la preparazione di resolving e stacking gel
Il buffer resolving contiene TRIS base (Sigma-Aldrich, Milano) 1,5M a pH=8,8. Il buffer stacking contiene TRIS base 0,5M con pH=6,8
Il gel è a questo punto introdotto nella camera di elettroforesi e immerso in un apposito tampone di running (TRIS 25 mM, 0,01%SDS e glicina 192 mM; pH 8,3). Prima di procedere al caricamento dei campioni è opportuno verificare che il livello del liquido all'interno della camera sia più elevato di quello esterno. I campioni sono preparati aggiungendo opportune quantità di Laemmli 2x (TRIS O,5 M, SDS 10%, 1 mL di glicerolo, 0,5 mL di β-mercaptoetanolo e tracce d blu di bromofenolo), che serve per denaturare ulteriormente le proteine e colorare il campione in modo da controllare il caricamento e la corsa elettroforetica.
Una volta caricati i campioni, si effettua quindi la corsa elettroforetica a 90 V per i primi 10 minuti e poi a 110 V fino a fine corsa, ovvero fino a quando le bande delle proteine non raggiungono la fine del gel.
Terminata la corsa elettroforetica, il gel di poliacrilammide contenente le proteine separate è trasferito su una membrana di nitrocellulosa, riequilibrata precedentemente in tampone di blotting (TRIS 25 mM, 0,1% SDS, 20% metanolo, 192mM glicina; pH 8,3). Tale trasferimento è effettuato, innanzitutto,
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mediante la preparazione di un sandwich, costituito nell’ordine da: catodo/doppia spugna/carta da filtro/membrana di nitrocellulosa/gel/carta da filtro/spugna/anodo. È importante in questa fase evitare la formazione di bolle d’aria che impedirebbero il trasferimento delle proteine sulla membrana di nitrocellulosa. Il sandwich è quindi inserito all’interno di una camera di trasferimento e immerso nel tampone di blotting freddo e, applicando una corrente di intensità pari a 350 mA per 60 minuti perpendicolarmente al gel, si ottiene il trasferimento delle proteine dal gel alla nitrocellulosa.
A questo punto, la nitrocellulosa è incubata per 45 minuti a temperatura ambiente con una soluzione di blocking, costituita da TBS-Tween 0,1%(TRIS 20 mM 2,42 g/l, NaCl 500 mM 29,4 g/l pH 8, Tween-20 0,05%) e no-fat milk 1% che permette il bloccaggio di siti aspecifici.
Dopo il bloccaggio la nitrocellulosa è sottoposta a incubazione con l’anticorpo primario, procedimento che avviene in costante agitazione su una bascula alla temperatura di 4°C per tutta la notte.
La mattina successiva sono effettuati tre lavaggi, ciascuno di 5 minuti e a temperatura ambiente, con la soluzione di TBS-Tween 0,1% con il fine di eliminare l'anticorpo primario non legato.
Al termine di questa procedura si aggiunge la soluzione contenente l'anticorpo secondario specifico per il primario che si è usato, il quale viene preparato alla opportuna diluizione. La nitrocellulosa viene lasciata incubare per due ore a temperatura ambiente.
Finita questa incubazione, si effettuano tre lavaggi ciascuno con la soluzione TBS-Tween 0,1% a temperatura ambiente e della durata di 5 minuti.
A questo punto, è possibile visualizzare la nitrocellulosa in chemiluminescenza utilizzando lo strumento ImageQuant™ LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden) e trattando la membrana per due minuti con una soluzione contenente luminolo e tampone perossido in rapporto 1:1 (LiteAblot™Plus, Euroclone spa). Lo strumento è in grado di definire un tempo
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questo tempo è possibile osservare la comparsa di bande, che dovrebbero essere dovute alla presenza della proteina in esame; l’immagine viene catturata e salvata per poi analizzarla, mediante densitometria con l’apposito software ImageQuant™TL.
Capitolo IV Risultati e Discussione
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Risultati e Discussione
4.1 Espressione genica di Cx26 e Cx43 in cellule umane di melanoma