3.5.1 Scongelamento della linea cellulare
Le cellule, opportunamente conservate in criotubi in azoto liquido, sono di nuovo utilizzabili solo dopo una procedura che ne rende possibile il ritorno allo stato metabolico attivo. La procedura di scongelamento prevede di porre il criotubo in un bagnomaria termostatato a 37°C per circa un minuto per scioglierne il contenuto. Una volta scongelato, il contenuto viene trasferito in una provettasterile da 15 ml, nella quale vengono successivamente aggiunti lentamente 5-6 ml di mezzo di coltura completo, anch’esso precedentemente scaldato a 37°C. La provetta viene quindi centrifugata a 1100 rpm per 5 minuti, per allontanare il DMSO dalla sospensione cellulare. Una volta eliminato il surnatante, si risospende il pellet ottenuto in un adeguato volume di mezzo di coltura e si semina nell’opportuno supporto di coltura.
3.5.2 Mantenimento in coltura
Il mantenimento delle linee A-375, 501Mel e MeWo prevede che le cellule siano conservate, in fase di crescita esponenziale, in fiasche (Starstedt, Verona, Italia) poste in incubatore a 37°C e con un 5% di CO2. Le colture
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vengono quindi controllate quotidianamente, sostituendo ogni 48 ore il mezzo di coltura consumato con del mezzo completo fresco per eliminare i metaboliti di scarto prodotti dalle cellule e mantenere un costante apporto di sostanze nutrienti alle cellule. Se osservando la coltura al microscopio si dovesse notare la presenza di detriti, si effettua un preliminare lavaggio in PBS.
Le cellule da noi usate crescono in adesione in monostrato e, quando raggiungono un buon livello di confluenza (circa il 70-80%) devono essere staccate dal supporto di coltura per evitare la formazione di multistrati che causerebbero sofferenza cellulare. Per staccare le cellule della superficie della fiasca si può sfruttare una semplice azione meccanica oppure, qualora le cellule aderissero con forza alla superficie, si utilizza una soluzione di tripsina- EDTA.
Nel primo caso, con un pipettatore si fa scendere con forza il mezzo di coltura sul tappeto di cellule che viene quindi disgregato. La sospensione cellulare ottenuta è centrifugata ed il pellet risospeso delicatamente e riseminato. Qualora l’azione meccanica non fosse sufficiente a disgregare il monostrato cellulare è necessario invece utilizzare la tripsina. Il mezzo di coltura delle cellule è aspirato e sostituito con una soluzione di tripsina 10x opportunamente diluita in PBS. La fiasca è quindi posta in incubatore a 37°C al fine di promuovere l’attivazione della tripsina. Dopo circa un minuto, si verifica mediante osservazione al microscopio che le cellule si stiano staccando e si procede a neutralizzare la tripsina con altro mezzo di coltura; in particolare, è l’FBS contenuto nel mezzo che consente la neutralizzazione della tripsina. La sospensione cellulare ottenuta è quindi centrifugata a 1100 rpm per 5 minuti al fine di allontanare la tripsina residua. Successivamente, il surnatante viene aspirato ed il pellet risospeso in un opportuno volume di mezzo di coltura completo, se si vuole procedere alla semina in nuove fiasche, o in una specifica soluzione di congelamento, se si intende procedere al congelamento.
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3.5.3 Congelamento delle colture cellulari
Il congelamento cellulare è un procedimento utilizzato al fine di mantenere le cellule in uno stato di quiescenza per lunghi periodi. Nello specifico, questo processo prevede che le cellule siano staccate dalla superficie della fiasca meccanicamente o con l’ausilio della tripsina, come precedentemente descritto. Dopo centrifugazione della sospensione cellulare ottenuta, si risospende il pellet in 1,7 ml di mezzo di congelamento, costituito da FBS con un 10 % di DMSO (Sigma-Aldrich, Milano, Italia), come agente crio-protettore. L’FBS contribuisce al mantenimento dell’ambiente sierologico delle cellule e, essendo ricco di proteine, stabilizza la membrana.
I criotubi ottenuti sono quindi congelati inizialmente a -20°C per alcune ore poi a -80°C per un massimo di 24 ore ed in seguito sono inseriti nel dewar dell’azoto liquido (-192°C).
3.5.4 Metodi per il trattamento con vemurafenib 3.5.4.1 Conta cellulare
Le cellule, precedentemente staccate, sono centrifugate a 1100 rpm per 5 minuti e il pellet ottenuto è risospeso omogeneamente in un volume noto di PBS.
Nella camera di Burker, opportunamente pulita con etanolo a 70° e chiusa con il vetrino coprioggetto, si caricano 8 μL di una soluzione contenente la sospensione cellulare e 0,2% di Trypan Blue in PBS 1X (Sigma Aldrich, Milano) nel rapporto di 10:1. Il Trypan Blue è aggiunto poiché consente di distinguere, durante la conta, le cellule vive da quelle morte ed evitare così errori nella semina cellulare. In particolare, questo colorante non permea nelle cellule vive, che risultano ad esso impermeabili, al contrario di quelle necrotiche, apoptotiche o morte, si colorano di blu in quanto la loro membrana diventa permeabile al colorante.
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La camera è costituita da un vetrino rettangolare, con lati rispettivamente di 7,5 cm e 3,5 cm e uno spessore di 4 mm. Presenta due celle di 3 x 3 mm, profonde 0,1 mm, ciascuna divisa in 9 quadrati di 1 mm, ognuno con 16 quadrati di 0,5 x 0,5 mm, e superficie di 1/25 mm². Si procede quindi alla conta cellulare in almeno 3 dei 9 quadrati, escludendo le cellule che risultano colorate in blu e quindi morte. Per ottenere il numero di cellule totali si applica la seguente formula:
N° medio di cellule per quadrante x 104 x mL di sospensione cellulare.
3.5.4.2 Semina e trattamento
Per il trattamento con vemurafenib, 220.000 cellule sono state seminate in dischi da 35 mm (Starstedt, Verona, Italia) in 1,5 mL di DMEM con 10% di FBS e 1% di penicillina/streptomicina. Dopo 24 ore dalla semina, tempo necessario per consentire l’adesione cellulare al supporto, il mezzo viene sostituito con un mezzo fresco privo di FBS, in modo da riportare le cellule ad uno stato di quiescenza (fase G0) che permette di sincronizzarle prima del trattamento.
Il giorno successivo si procede al trattamento: il mezzo è sostituito con una soluzione contenente vemurafenib 10 μM e, in alcuni campioni con DMSO 0,02%, opportunamente diluiti in DMEM ricostituito con 1% FBS e 1% penicillina streptomicina. Le cellule trattate con DMSO costituiscono un controllo che permette di valutare separatamente gli effetti del farmaco e del solvente in cui esso è disciolto.
Trascorse altre 24 ore, le cellule sono staccate dal supporto di coltura e ne viene fatto un pellet che servirà per la successiva estrazione dell’RNA o per ottenere un lisato proteico.
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