3.6.1 Estrazione dell’RNA totale
La procedura utilizzata con RNeasy kit combina la selettività delle membrane di silice e la velocità delle spin columns. Questo sistema riassunto in Figura 9 permette di estrarre fino a 100 µg di RNA della lunghezza di almeno 200 basi. Il protocollo prevede prima di tutto staccare le cellule dal loro supporto e centrifugarle per 5 minuti a 1100 rpm. Una volta scartato il surnatante, il pellet ottenuto è lavato per tre volte in PBS e quindi risospeso in un volume noto così da procedere alla conta cellulare. Questo passaggio è necessario al fine di calcolare l’esatta quantità di buffer RLT (ricostituito con 1% di β- mercaptoetanolo) che deve essere utilizzata secondo le istruzioni del fornitore: 350 µl di buffer per un numero di cellule fino a 5x106 e 600 µl per un massimo
di 107 cellule.
Successivamente, si eseguono nuovamente dei lavaggi in PBS del pellet e vi si addiziona il corrispondente quantitativo di buffer, vortexando fino a completa dissoluzione. A tale soluzione è aggiunto un volume di etanolo 70% (RF) pari al volume di buffer RLT utilizzato e si lavora con una bacchetta di vetro per evitare la formazione di grumi o filamenti. Questo accorgimento è necessario in quanto la lisi cellulare indotta nel campione causa un aumento delle viscosità della soluzione e per evitare una separazione in due fasi conseguente all’aggiunta di etanolo.
Fino a 700 µl di lisato ottenuto sono caricati nelle spin columns posizionate nei collection tubes e centrifugati per 15 secondi ad una velocità maggiore a 10000 rpm.
Dopo aver scartato l’eluato, contenente il buffer RLT, si aggiungono 350 µl di buffer RW1 e si centrifuga per poi scartare, anche in questo passaggio, l’eluato.
Si procede aggiungendo 500 µl di buffer RPE per lavare la membrana delle spin columns e ad una ulteriore centrifugazione seguita da eliminazione
Capitolo III Materiali e Metodi dell’eluato. Altri 500 µl di buffer RPE sono quindi aggiunti e si centrifuga per 2 minuti a velocità superiore a 10000 rpm. Si esegue una seconda centrifugazione di 1 minuto per eliminare eventuale etanolo residuo.
A questo punto il tubo collettore viene eliminato e la spin column, in cui vengono caricati 40 µl di acqua RF, è posta in una nuova eppendorf. Grazie ad una centrifugazione di 1 minuto a velocità maggiore i 10000 rpm, l’RNA viene fatto eluire dalla colonna nella sottostante eppendorf, che viene quindi posta in ghiaccio.
La concentrazione dell’RNA estratto viene determinata con lo spettrofotometro NanoQuant Infinite 2000 (TECAN, Salzburg, Austria), misurandone l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260 nm.
Per valutare la purezza dell’RNA estratto è necessario calcolare la ratio tra l’assorbanza a 260 nm e 280 nm, lunghezze d’onda alle quali si ha la massima assorbanza rispettivamente dell’RNA e delle proteine. Il valore ottimale di questo rapporto è compreso tra 1,8 e 2.
Ai fini di valutare l’integrità dell’acido nucleico è stata fatta una corsa elettroforetica su gel di agarosio all’1%, preparato solubilizzando l’agarosio in TBE 0,5X ed aggiungendo come intercalante il bromuro di etidio. L’esperimento è stato condotto in una camera orizzontale il cui tampone di corsa è TBE 0,5X e il voltaggio applicato è di 120V per circa 30 minuti. In ogni pozzetto, 6 μl di una soluzione contenente 5 μL di campione e 1 μL di blu di bromofenolo. La visualizzazione si ha per mezzo del transilluminatore.
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Figura 9. Schema di estrazione dell’RNA totale con RNeasy Minikit
3.6.2 Retrotrascrizione
La retro-trascrizione, tecnica che permette di ottenere cDNA a partire dall’RNA precedentemente estratto, è stata condotta utilizzando QuantiTect Reverse Transcription Kit. I campioni di RNA e i vari componenti del kit sono scongelati prima della procedura, centrifugati per avere omogeneità e mantenuti in ghiaccio fino al momento dell’uso. Il protocollo prevede prima di tutto l’eliminazione del DNA genomico dei campioni aggiungendo 14 μL di una soluzione costituita da 2 μL di gDNA Wipeout Buffer 7x, 1 µg di RNA totale,
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RF Water q.b. a 14 μL centrifugando e incubando per 2 minuti nel termociclizzatore a 42°C.
Nel frattempo, si prepara la Reverse Transcription Master Mix utilizzando 1 μL di QuantiScript Reverse Transcriptase, 4 μL di QuantiScript RT buffer 5x contenente deossinucleotidi trifosfato, 1 μL di RT Primer Mix. Questa Mix è poi aggiunta direttamente al campione, che viene posto nuovamente nel termociclizzatore con il seguente protocollo: 42°C per 30 minuti, 95°C per 3 minuti terminati i quali lo strumento manterrà e 4°C per tempo infinito.
Questo protocollo permette di attivare la trascrittasi inversa e di ottenere campioni di c-DNA, che possono essere utilizzati sia per PCR sia per Real- Time PCR e conservati a -20°C (Figura 10).
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3.6.3 PCR
La PCR è una tecnica di biologia molecolare che rende possibile l’amplificazione esponenziale di segmenti di DNA stampo a sequenza conosciuta.
Il protocollo da noi seguito prevede innanzitutto di scongelare, ponendole in ghiaccio, le componenti necessarie prima di iniziare,
Si procede preparando, per ogni target, una miscela dei primers reverse e forward che vengono diluiti con acqua RF, in modo da ottenere una concentrazione finale pari a 0,4 µM. A tale miscela viene addizionata la Master Mix, preventivamente scongelata, in un volume pari a 5 µL, in base alle istruzioni del fornitore per ottenere un volume finale di 10 µL. Il cDNA, in un quantitativo ≤1 µg/reazione, viene aggiunto come ultimo componente.
Il termociclizzatore (MyCycler, Bio-rad), nel quale viene posto il campione viene impostato per eseguire una iniziale denaturazione del cDNA, effettuata mantenendo la temperatura di 95°C per 3 minuti e, successivamente, ripeterà 35 cicli secondo il seguente schema:1 minuto a 95°C per denaturare, 1 minuto alla temperatura di annealing per facilitare l’appaiamento dei primers,1 minuto a 72°C per estendere l’amplificato. Si avrà quindi una fase di estensione finale a 72°C per 10 minuti ed il mantenimento della reazione a 4°C (Figura 11). Il prodotto genico così amplificato può essere congelato o utilizzato subito per effettuare l’elettroforesi su gel di agarosio.
La temperatura di annealing (Ta), ovvero la temperatura alla quale i primers si appaiano alle sequenze complementari del DNA a singolo filamento, è specifica per ogni primer ed è calcolata con la formula:
Ta=Tm-5°C
dove Tm è la temperatura di melting, ovvero la temperatura di fusione in cui si ha la rottura dei legami a idrogeno tra i primer e la sequenza ad essi complementare di DNA. Tale temperatura dipende dalla composizione dei
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nucleotidi contenenti le basi azotate guanina, citosina, adenina o timina e si calcola secondo la formula:
Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C.
Sono state effettuate quindi alcune PCR in gradiente (da Ta=Tm a Ta=Tm- 5°C) per determinare la temperatura ottimale di annealing alla quale l’amplificato risultava maggiormente presente e senza segnali aspecifici. La temperatura di annealing dei primers così definita è riportatati in Tabella 1.
Figura 11. Rappresentazione schematica delle fasi della reazione a catena della polimerasi
3.6.4 Elettroforesi su gel di agarosio
Una volta che i frammenti del DNA da analizzare sono stati amplificati con la reazione PCR è necessario separarli ed identificarli. A tale scopo si utilizza la
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seguito ad applicazione di un campo elettrico che viene generato dalla differenza di potenziale creata da un alimentatore di corrente. Dato che in tampone alcalino o neutro gli acidi nucleici si comportano come molecole cariche negativamente (anioni), esse migreranno verso il polo positivo. L’elettroforesi viene effettuata su supporto solido costituito da gel di agarosio utile per separazioni rapide a bassa risoluzione, quando i frammenti sono grandi e molto diversi tra loro per grandezza
Per preparare il gel di agarosio all’1% si pongono in un becher il TBE 0,5x e l’agarosio, si porta ad ebollizione e una volta raggiunta una soluzione limpida si aggiunge 0,01% di bromuro di etidio e si cola nella camera per corsa in orizzontale in cui si è precedentemente posto un pettine per la formazione dei pozzetti. A gelificazione avvenuta, il gel è immerso nel tampone di corsa (TBE 0,5x) all’interno del sistema di elettroforesi orizzontale.
Il pettine è quindi rimosso mantenendosi perpendicolari rispetto al gel e i pozzetti ottenuti vengono riempiti con un adeguato volume di una soluzione contenente il campione e blu di bromofenolo in rapporto 1:5. In un pozzetto si carica una soluzione contenente il ladder al posto dei campioni.
Nella fase di caricamento è importante avere alcuni accorgimenti: evitare la formazione di bolle, non far uscire il campione fuori dal pozzetto e non bucare il fondo del gel. Quindi l’operatore si pone con il puntale perpendicolarmente al gel ed corrispondenza di un angolo del pozzetto. Una volta chiusa la camera, lo strumento è impostato a voltaggio fisso di 120 V per 30’ controllando di tanto in tanto se la corsa procede. In particolare, la velocità della migrazione dipende dal peso molecolare dei vari frammenti: i frammenti a più alto peso molecolare migrano più lentamente rispetto a quelli a più basso peso molecolare. Trascorsi i 30 minuti, il gel è estratto dalla camera di corsa e le bande vengono visualizzate attraverso un trans-illuminatore.
Questo tipo di analisi porta allo svolgimento di una PCR end-point, ovvero in cui il risultato analizzato deriva dallo stato finale di plateau della reazione, molto variabile.
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Tale risultato, inoltre, si basa solo su una differenza nelle dimensioni dell’amplificato, criterio non molto preciso e sensibile a variazioni di circa 10 volte.
3.6.5 Real-Time PCR
La Real-Time PCR è una tecnica che permette di amplificare e contemporaneamente avere un’indicazione quantitativa sul campione di DNA grazie a molecole fluorescenti che, in seguito al legame con l’amplificato, emettono fluorescenza. Quest’ultima viene quantificata ad ogni ciclo da appositi strumenti ed è proporzionale al prodotto amplificato. La sonda da noi usata è una SYBR Green, un composto organico aromatico dotato di attività fluorofora, che viene usato come colorante di acidi nucleici in quanto ha la capacità di intercalarsi nella doppia elica di DNA in modo non specifico e, conseguentemente a tale legame, di emettere fluorescenza.
Per l’esecuzione del protocollo è necessario porre in apposite piastre una soluzione composta da 5 µL sonda SsoAdvanced™ Universal SYBR® Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, USA), i primers reverse e forward alla concentrazione di 0,4 µM, 50 ng di cDNA e acqua RF q.b. a 10 µL, in base a quanto indicato nelle istruzioni del fornitore.
La piastra viene chiusa con gli opportuni tappi e viene posta nello strumento programmato per riscaldare inizialmente i campioni a 95°C per 30 secondi e, successivamente, per effettuare 40 cicli così composti:15 secondi a 95°C al fine di denaturare il cDNA e 30 secondi alla temperatura di annealing per consentire il corretto appaiamento dei primers.
Ad ogni ciclo lo strumento esegue una lettura dell’emissione di fluorescenza. Alla fine dei 40 cicli si ha l’analisi della curva di melt che prevede un incremento di mezzo grado in mezzo grado da 65°C a 95°C. La curva di melt permette di valutare la presenza di eventuali prodotti aspecifici o dimeri di primers qualora essa dovesse presentare più picchi.
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La Real-Time PCR permette di determinare la quantità di amplificato nella fase esponenziale della reazione, quella fase in cui il numero di copie di DNA rilevate sono direttamente proporzionali alla quantità iniziale nel campione. Il parametro che valutiamo è quindi il Cycle Threshold (Ct), ovvero il numero di ciclo al quale il campione raggiunge il livello di Threshold, cioè quel livello che consente allo strumento di rivelare una fluorescenza diversa da quella di background (Figura 12).
I risultati ottenuti in Real-Time PCR vengono analizzati normalizzando il Ct del target rispetto al Ct del gene housekeeping prescelto. In particolare, essi sono stati calcolati con la formula:
Numero di copie= 2-ΔCt ΔCt=Ct(target)-Ct(housekeeping.media)
Figura 12. Rappresentazione della cinetica della reazione di PCR, del Threshold e del parametro Ct.
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