Evoluzione del sequenziamento

Con il termine sequenziamento si intende la decodifica dell’esatta sequenza di nucleotidi di un acido nucleico (DNA o RNA). Un filamento di DNA o RNA contiene qualche miliardo di nucleotidi, ma i dispositivi di analisi hanno una capacità limitata di lettura, permettendo di sequenziare solo dei frammenti, di lunghezza variabile, denominati “reads”; le “reads” devono poi essere allineate ed assemblate per formare la sequenza di nostro interesse. Il primo esempio di sequenziamento è stato nel 1973 con l’elaborazione da parte del fisico e biochimico Maxam e Gilbert di un breve frammento di circa 24bp e successivamente nel 1977 essi pubblicarono la loro metodica di sequenziamento177_{. In} contemporanea, nel 1977 Sanger pubblicò la sua metodica di sequenziamento enzimatico che fu successivamente automatizzata e commercializzata nel 1998 con l’introduzione nel mercato del primo sequenziatore automatico a capillare (ABI 310) da parte della ditta Applied Biosystem178_{. Il sequenziamento sia di Maxam Gilbert che di Sanger viene definito} sequenziamento di 1° generazione poiché sono stati i primi due metodi ad essere stati sviluppati ed utilizzati. Tuttavia tra le due tecniche di sequenziamento, il metodo Sanger

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ha preso il sopravvento in seguito alla messa in commercio di sequenziatori capillari automatizzati basati sul sequenziamento Sanger (o metodo enzimatico) che hanno permesso la riduzione dei tempi di ottenimento e di interpretazione dei dati; inoltre, ad oggi, tale metodica rappresenta ancora il “gold standard” in molti laboratori sia di analisi che di ricerca.

Il metodo Maxam-Gilbert si basa su alterazioni chimiche del DNA e sul conseguente taglio in posizioni specifiche. La metodica prevede che il DNA da sequenziare sia purificato e marcato radioattivamente ad un’estremità (generalmente usando 32P). Il campione di DNA da sequenziare viene denaturato in presenza di DMSO e viene diviso in quattro aliquote uguali, ciascuna delle quali viene trattata con dei reagenti chimici che ne causano la metilazione o la rottura in corrispondenza di basi specifiche. Utilizzando i reagenti a basse concentrazioni si può fare in modo che i tagli non avvengano su tutte le basi ma, ipoteticamente, un taglio per ogni molecola di DNA in modo tale che venga generata una serie di frammenti marcati (dalla fine della molecola al primo sito di taglio della stessa) di dimensione specifica e che vengano così separati in base alla lunghezza attraverso elettroforesi su gel. Il gel viene posto a contatto con una pellicola radiografica sulla quale lascia impressa la disposizione delle bande dei frammenti generati tramite i quali è possibile determinare l'ordine dei nucleotidi e quindi la sequenza di partenza177_.

Il metodo sviluppato da Maxam e Walter Gilbert viene comunemente descritto come metodo chimico per differenziarlo dal metodo enzimatico di Sanger (Figura 18).

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Figura 18: Principio di sequenziamento di tipo chimico di Maxam-Gilbert (A) e di tipo enzimatico di

Sanger (B).

Il metodo Sanger è un metodo cosiddetto enzimatico, poiché richiede l'utilizzo di un enzima; questa tecnica si basa sull'utilizzo di nucleotidi modificati (dideossitrifosfato, ddNTPs) per interrompere la reazione di aggiunta di nucleotidi in posizioni specifiche. I nucleotidi ddNTPs sono molecole artificiali corrispondenti ai nucleotidi naturali, ma si differenziano per l'assenza del gruppo idrossilico sul carbonio 2' e 3' della molecola. I ddNTPs, a causa della loro conformazione, impediscono che un altro nucleotide si leghi ad essi, in quanto non si possono formare legami fosfodiesterici. Il protocollo classico richiede un templato di DNA a singolo filamento, un primer per iniziare la reazione di polimerizzazione, una DNA polimerasi, deossinucleotidi e ddNTPs per terminare la reazione di polimerizzazione. I ddNTPs sono marcati con un fluroforo in modo da poter visualizzare le bande dei frammenti di DNA neosintetizzato dopo aver effettuato l'elettroforesi. Nella metodica iniziale il materiale genetico da sequenziare veniva diviso in quattro reazioni separate, ognuna delle quali contenente la DNA polimerasi e tutti e 4 i deossiribonucleotidi (dATP, dCTP, dGTP e dTTP). Ad ognuna di queste reazioni veniva poi

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aggiunto solo uno dei quattro ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) in quantità stechiometricamente inferiore per permettere una elongazione del filamento sufficiente per l'analisi. L'incorporazione di un ddNTP lungo il filamento di DNA in estensione ne causa la terminazione prima del raggiungimento della fine della sequenza di DNA stampo; questo dà origine ad una serie di frammenti di DNA di lunghezza diversa interrotti in corrispondenza dell'incorporazione del ddNTP, che avviene casualmente quando esso è aggiunto dalla polimerasi in luogo di un nucleotide deossi. I frammenti generati da queste reazioni venivano poi fatti correre su gel di poliacrilamide-urea in grado di separare frammenti che differiscono anche di una sola base. Ognuna delle 4 reazioni è corsa su pozzetti vicini, dopodiché le bande sono visualizzate su lastra autoradiografica o sotto luce UV, e la sequenza viene letta direttamente sulla lastra o sul gel, a seconda del tipo di marcatura dei ddNTPs. Basandosi su questa procedura, la metodica è stata affinata per facilitare la reazione, e con l'avvento dell'automatismo, la reazione di sequenziamento è diventata molto più veloce. Attualmente è possibile effettuare, anziché quattro reazioni distinte per ogni nucleotide modificato, una sola reazione utilizzando i 4 ddNTPs marcati fluorescentemente in modo diverso tra loro ed utilizzando lettori ottici appropriati. Al posto del gel di elettroforesi in poliacrilamide-urea viene utilizzato un capillare contenente un polimero (POP) all'interno del quale i frammenti vengono fatti correre secondo le loro dimensioni; all'estremità opposta del capillare è presente un laser che eccita il fluoroforo che emette una luce diversa a seconda del ddNTP incorporato, il sistema di rilevazione interpreta il segnale e elabora la sequenza178_.

Le principali differenze tra il sequenziamento di Sanger e di Maxam-Gibert sono riportate in Figura 19.

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Figura 19: Principali differenze tra la tecnica di sequenziamento di Sanger e di Maxam-Gibert.

I principali problemi del sequenziamento Sanger (SS) sono la limitata lunghezza del DNA da poter analizzare (fino ad una lunghezza massima di 1000 nucleotidi), il numero limitato di campioni che possono essere trattati in parallelo e la mancanza di un’automazione nella preparazione del campione. Queste limitazioni e problemi hanno portato allo sviluppo di nuove tecniche di sequenziamento che hanno la capacità di sequenziare un gran numero di campioni in parallelo.

Solo nel 2005 si è affacciato sul mercato un sistema tecnologico alternativo, denominato sequenziamento di nuova generazione (o alternativamente Next Generation Sequencing, NGS, o Massive Parallel Sequencing, MPS). In tempi brevissimi, diverse piattaforme tecnologiche basate su questo nuovo sistema di sequenziamento sono state sviluppate e via via perfezionate, dando origine ad una vera e propria rivoluzione nel campo del sequenziamento degli acidi nucleici, sia per quanto riguarda la quantità dei dati prodotti sia per la velocità con cui essi vengono generati.

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Più piattaforme di sequenziamento NGS sono disponibili attualmente in commercio, tra cui le piattaforme Illumina (HiSeq, MiSeq, e sistemi NextSeq; Illumina, San Diego, CA, USA), ThermoFisher (PGM, Proton, sistemi Ion S5; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) e Pacific Biosciences (PacBio RS II system; Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA). Le piattaforme Illumina utilizzano una chimica di “sequencing-by-synthesis” mediante l’utilizzo di terminatori reversibili fluorescenti (“reversible dye terminator”) che prevede cicli ripetitivi di incorporazione di singole basi nucleotidiche, visualizzazione e clivaggio dei terminatori. Le piattaforme Ion Torrent (ThermoFisher Scientific) sono sistemi che utilizzano diversi chip Torrent che funzionano come pH-metri ultrasensibili in grado di rilevare gli ioni idrogeno che sono rilasciati quando i nucleotidi vengono incorporati durante la sintesi del DNA. I sistemi PacBio utilizzano un'unica tecnologia di sequenziamento in tempo reale della singola molecola che permette di monitorare l'attività di un singolo enzima DNA polimerasi in una singola molecola di DNA templato a singolo filamento in tempo reale durante il sequenziamento del DNA. I sistemi Illumina generano la massima resa di sequenziamento, i sistemi Ion Torrent richiedono minor quantità di DNA da sequenziare ed il sistema PacBio fornisce letture più lunghe. Ogni tecnologia di sequenziamento ha i suoi vantaggi e debolezze intrinseche; laboratori clinici dovrebbero scegliere la piattaforma che meglio si adatta alle loro esigenze. I dettagli tecnici ed i principi principali delle diverse piattaforme NGS sono ampiamente descritti179- 181_.

Le piattaforme NGS più comunemente utilizzate nei laboratori clinici sono quelle dell’Illumina (MiSeq, HiSeq e NextSeq 500) e quelle della ThermoFisher Scientific (PGM, Ion S5 e Proton). Le macchine NGS ad oggi disponibili sono dispositivi molto flessibili. Esistono, inoltre diverse applicazioni che possono essere attuate con le piattaforme di NGS, tra cui:

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➢ Whole Genome Sequencing – WGS, noto anche come Whole Genome Shotgun: analisi dell’intero genoma di un individuo;

➢ Whole Exome Sequencing – WES: analisi dell’intera regione codificante di tutti i geni di un individuo;

➢ Targeted Sequencing: analisi di un gruppo di geni (pannello) o di singolo gene; ➢ Transcriptome Analysis: analisi di tutti gli RNA prodotti da una cellula

(trascrittoma).