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Ottimizzazione di un “workflow” mediante NGS nel rilevamento di mutazioni “driver” del NSCLC partendo da DNA estratto da tessuto FFPE e

8.1. MATERIALI E METOD

8.1.1 Raccolta dei campioni

Nel presente studio sono stati arruolati dodici pazienti (“Training Set”) in diversi stadi di malattia sottoposti precedentemente ad intervento chirurgico per NSCLC. Tutti i pazienti selezionati erano positivi per mutazioni a carico del gene KRAS o EGFR precedentemente individuati mediante sequenziamento classico SS o tramite Real-Time PCR Therascreen IVD (Qiagen, Hilden, Germany) (Figura 25). Le caratteristiche cliniche dei pazienti arruolati sono riportate nella Tabella 11. Per ciascun paziente sia il tessuto tumorale SF che il tessuto corrispondente FFPE è stato recuperato. Tutti i tessuti SF dei 12 pazienti sono stati recuperati dalla biobanca, mentre i tessuti FFPE sono stati ottenuti dall’archivio dell’Anatomia Patologica dell’Istituto “IRCCS AOU San Martino - IST Istituto Nazionale sulla Ricerca sul Cancro”, Genova. Tutti i campioni sono stati valutati per il contenuto di cellule maligne da un patologo e tramite macrodissezione la componente tumorale è stata arricchita fino ad ottenere un contenuto di cellule tumorali di almeno il 50%. Inoltre, per 9 dei 13 pazienti arruolati, un campione di plasma è stato raccolto al momento della diagnosi.

Ulteriori 13 pazienti NSCLC sono stati arruolati come “Validation Set” e per ogni paziente il tessuto FFPE è stato rivisto dal patologo per verificare il contenuto delle cellule tumorali (Tabella 12). Inoltre, tre tessuti FFPE Standard di Riferimento Horizon Diagnostics (EGFR p.Thr790Met, EGFR p.Glu746_Ala750del e EGFR wild-type; Horizon,

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Cambridge, UK) e due linee cellulari umane NSCLC (NCI-H1650 p.Glu746_Ala750del e NCI- H1975 p.Thr790Met / p.Leu858Arg; American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) sono stati utilizzati per valutare i parametri di “performance” dell’analisi di NGS. Il presente studio è stato approvato dal comitato etico locale (TP-01-2014; 255REG2014) ed il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti.

Figura 25: Stato mutazionale di EGFR e KRAS dei 12 pazienti NSCLC (“Training set”) identificato

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Tabella 11. Caratteristiche cliniche dei 12 pazienti NSCLC del "Training Set". Paziente Età del

tessuto SF FFPE cfDNA Istologia TNM Stadio

Età alla diagnosi S

Abitudine

al fumo PS OS Stato

1 2012 x x x SCC T1b, N0, M0 IA 77 M S 1 30 A

2 2010 x x x ADK T1a, N2, M0 IIIA 67 M NS 1 18 DOD

3 2013 x x x ADK T2, N2, M1a IV 76 F NS 1 14 DOD

4 2010 x x x ADK T2b, N0, MX IIA 76 M FS 1 11 DOD

5 2013 x x NA ADK T2a, N2,

M1b IV 75 F NS 1 13 A

6 2011 x x NA ADK T2a, N0, MX IB 78 F NS 1 29 DOD

7 2013 x x x ADK T2a, N2,

M1b IV 65 M S 1 3 DOD

8 2013 x x x ADK T2b, N1, M0 IIB 59 F S 1 23 A

9 2012 x x x ADK T2a, N0, MX IB 72 M FS 0 28 A

10 2011 x x NA ADK T2b, N0, M0 IIB 66 F FS 1 42 A

11 2010 x x x ADK T1a, N0, M0 IA 77 M FS 0 49 DOD

12 2010 x x x ADK T1a, N0, M0 IA 60 F S 1 32 DOD

Tabella 12. Caratteristiche cliniche dei 13 pazienti NSCLC del "Validation Set". Paziente Età del

tessuto SF FFPE cfDNA Istologia TNM Stadio

Età alla diagnosi S Abitudine al fumo PS OS Stato 13 2015 NA x NA ADK T2, N2, M0 IIIB 59 M S 0 5 A 14 2014 NA x NA ADK Tx, Nx, M1a IV 42 M NS 0 14 A 15 2015 NA x NA ADK T3, N3, M1a IV 64 M FS 1 4 A 16 2014 NA x NA ADK T4, N2, M1b IV 77 F NS 0 12 A 17 2014 NA x NA ADK T3, N2, M0 IIIA 70 F NS 1 8 A 18 2012 NA x NA ADK T3, N2, M1b IV 63 M S 1 37 A 19 2014 NA x NA ADK T4, N2, M1b IV 70 M FS 1 2 DOD 20 2014 NA x NA ADK T4, N0, M0 IIIA 68 M FS 0 16 A

21 2011 NA x NA ADK T1a, N0, M0 IA 71 F NS 1 42 DOD

22 2014 NA x NA ADK T2, N2, M1b IV 81 F NS 1 10 DOD

23 2013 NA x NA ADK T1b, N2, M0 IIIA 72 M FS 1 22 A

24 2014 NA x NA ADK T3, N3, M1b IV 61 M NS 1 11 DOD

25 2015 NA x NA ADK Tx, Nx, M1b IV 55 F FS 0 7 A

Abbreviazioni: ADK: Adenocarcinoma; SCC: carcinoma a cellule squamose; TNM: Tumore-Noduli-

Metastasi; S: Sesso; F: Femmina; M: maschio; S: Fumatore; NS: non fumatore; FS: ex fumatore; PS: Performance Status; OS: sopravvivenza globale (mese); A: Vivo; DOD: Morto di malattia; x: presente; NA: non disponibile.

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8.1.2 Estrazione e controllo di qualità del DNA

Il DNA dei tessuti SF e delle due linee cellulari (NCI-H1650 e NCI-H1975) è stato isolato mediante l’utilizzo del kit “QIAamp® DNA Mini Kit” (Qiagen, Hilden, Germania), mentre il DNA dei tessuti FFPE è stato estratto utilizzando il kit “GeneRead DNA FFPE kit” (Qiagen), seguendo i manuali d’istruzione dei kit. La quantità dei DNA di tutti i campioni è stata misurata mediante “Qubit® 2.0 Fluorometer” (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) utilizzando il kit “High sensitivity assay kit Qubit® dsDNA” (Invitrogen).

Il cfDNA è stato estratto da 400 µl di plasma mediante l’utilizzo del kit “QIAamp DNA Blood Mini Kit” (Qiagen). I cfDNA estratti sono stati quindi quantificati attraverso una PCR quantitativa (qPCR) mediante valutazione del numero di copie del gene “Human Telomerase Reverse Transcriptase” (hTERT) (Catalogo: 4403316; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Le reazioni di qPCR sono state effettuate sul sistema RealPlex2 (Eppendorf, Amburgo, Germania) in un volume finale di 10 µL consistenti in: 5 µL di TaqMan universal Mastermix (ThermoFisher Scientific), 1 µL della sonda “TaqMan® Copy Number Reference Assay hTERT” e 4 µL di cfDNA. La curva di calibrazione è stata calcolata sulla base di una serie di diluizioni di un DNA standard (Promega, Madison, WI, USA): 1, 10, 100, 1000, 10.000, 100.000 numero di copie (3.3 pg di DNA = 1 copia del gene). Ciascun campione è stato eseguito in duplicato e la concentrazione finale è stata calcolata per interpolazione della media dei valori dei cicli soglia (CT) con la curva di calibrazione. Un controllo di qualità del DNA estratto sia da tessuti SF che dai FFPE è stato eseguito. La qualità/purezza del DNA, intesa come assenza di contaminanti, è stata valutata utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE, USA) per misurare l'intero spettro di assorbimento (220-750 nm) e calcolare il rapporto di assorbanza sia a 260/280 che a 260/230. Lo stato di frammentazione dei DNA estratti dai tessuti SF è stato analizzato su un gel di agarosio alla concentrazione di 0.8%

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per visualizzare la distribuzione dimensionale del DNA. Per valutare invece lo stato di frammentazione dei DNA estratti da tessuti FFPE un saggio di controllo di qualità basato su una PCR multiplex è stato messo a punto modificando leggermente un protocollo precedentemente pubblicato183.

In particolare, siccome il nostro sistema di sequenziamento prevede una cattura delle regioni d’interesse mediante PCR che produce ampliconi con un range di dimensioni tra i 140-260bp, è stato ideato un sistema basato su un’amplificazione del DNA mediante PCR che permette di valutare la presenza di 3 frammenti (200, 300 e 400 bp) del gene gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH). Brevemente, 30 ng dei DNA estratti dai tessuti FFPE, quantificati mediante “Qubit® 2.0 Fluorometer” (Invitrogen), sono stati analizzati mediante una reazione di PCR multiplex utilizzando tre serie indipendenti di primer che amplificano tre frammenti di differente lunghezza (200, 300 e 400 bp) del gene GAPDH. L’amplificazione è stata eseguita sul termociclatore “Mastercycler® nexus Thermal Cycler” (Eppendorf) in un volume di reazione di 30 µL con concentrazioni e ciclazione termica riportata in Figura 26.

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I prodotti di PCR sono stati poi analizzati mediante lo strumento “Agilent 2100 Bioanalyzer” utilizzando il Kit “High Sensitivity DNA Assay” (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). La resa risultante dei tre ampliconi è stata valutata confrontandola con la resa degli ampliconi ottenuti da un DNA di riferimento (Promega) (Figura 27). Il rapporto medio di concentrazione (AYR) calcolato per ciascun amplicone, è stato utilizzato come indicatore quantitativo di integrità del DNA estratto da tessuto FFPE. Sulla base del valore AYR tre cut-off sono stati definiti:

• x < 0.3 Il DNA estratto risulta essere troppo degradato (> 70%) da poter essere utilizzato per il sequenziamento. Tale campione non risulta idoneo per il sequenziamento NGS;

• 0.3 ≤ x < 0.8 Il DNA estratto risulta avere un livello di degradazione compreso tra il 70% e 20%. Tale campione è quindi considerato idoneo e sottoposto a NGS. Tuttavia la quantità di DNA da utilizzare per il sequenziamento sarà raddoppiata a 20 ng rispetto alla quantità di 10 ng prevista dal protocollo;

• ≥ 0.8 Il DNA estratto risulta avere un basso livello di degradazione (< 20%). Tale campione è quindi considerato idoneo e sottoposto a NGS, usando una quantità di DNA standard (10 ng).

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Figura 27: Esempio di analisi su Bioanalyzer di un campione di DNA paraffinato. Il valore AYR è ottenuto

dalla media dei rapporti di concentrazione tra gli ampliconi del campione da testare rispetto ad un DNA di riferimento.

8.1.3 Amplificazione dell’intero genoma

Siccome da alcuni campioni di plasma il cfDNA estratto risultava essere inferiore alla quantità indicata dal protocollo di sequenziamento (10 ng), è stato testato un sistema di amplificazione dell’intero genoma (Whole Genome Amplification, WGA). cfDNA con concentrazioni inferiori ad 1 ng, stimati mediante qPCR, sono stati amplificati mediante WGA utilizzando il kit “REPLI-g Kit Single Cell” (Qiagen). Il kit “REPLI-g Single Cell” si basa su un processo di “Amplificazione mediante Spostamento Multiplo del filamento” (MDA)184. Tale tecnologia effettua un’amplificazione isotermica del genoma utilizzando una DNA polimerasi capace di replicare 100 KB senza mai dissociarsi dal DNA genomico stampo. Questa DNA polimerasi presenta un'attività esonucleasica 3’-5’ di lettura della bozza che consente di mantenere una elevata fedeltà di replicazione ed è utilizzata in presenza di primers resistenti all’attività esonucleasica in maniera tale da ottenere rese elevate di DNA. Per valutare la prestazione di questo kit per l’eventuale utilizzo in NGS, sono state amplificate mediante WGA diluizioni scalari (10, 1 e 0,1 ng) di DNA estratto dalla linea cellulare NCI-H1650. I DNA amplificati sono stati diluiti 1:100 e valutati

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mediante qPCR utilizzando il saggio hTERT, come precedentemente descritto (sezione “Estrazione e controllo di qualità del DNA”).

8.1.4 NGS del DNA

Tutti i campioni di DNA sono stati amplificati (preparazione delle “libraries”) utilizzando il pannello “Ion AmpliSeq™ Colon and Lung Cancer Research Panel v.1” (ThermoFisher Scientific), costituito da 90 ampliconi, che analizza regioni target e hotspot di 22 geni (AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2,

FGFR3, KRAS, MAP2K1, MET, NOTCH1, NRAS, PIK3CA, PTEN, SMAD4, STK11 e TP53)

coprendo più di 500 mutazioni coinvolte nel cancro del colon e del polmone. Le regioni target (90) sono state amplificate seguendo il manuale di istruzione del kit "Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0” (ThermoFisher Scientific) partendo da concentrazioni diverse di DNA a seconda della tipologia del campione:

• 20 ng di DNA estratto dai tessuti FFPE (valori di AYR < 0.8 o ≥ 0.3);

• 10 ng di DNA estratto dai tessuti SF o DNA estratto da FFPE (valori di AYR > 0.8); • 10 ng di cfDNA amplificato mediante WGA;

• valori compresi da 1 a 10 ng per i cfDNA no-WGA.

Ciascun campione è stato etichettato con un specifico “barcode” durante la preparazione delle “libraries” con il kit "Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0” (ThermoFisher Scientific). La procedura di amplificazione è stata effettuata sul termociclatore “Mastercycler® nexus Thermal Cycler” (Eppendorf) con differenti condizioni di ciclazione a seconda della tipologia di DNA:

• 22 cicli per DNA estratto da tessuto FFPE; • 22 cicli per cfDNA no-WGA;

82 • 19 cicli per cfDNA WGA.

Inoltre, nella seconda amplificazione opzionale del protocollo del kit "Ion AmpliSeq™ Library Kit 2.0” (ThermoFisher Scientific), i campioni SF, FFPE e cfDNA WGA sono stati sottoposti a 5 cicli di PCR, mentre i campioni cfDNA no-WGA a 7 cicli di PCR.

Successivamente, 1μL delle “libraries” amplificate sono state analizzate con il kit “High Sensitivity DNA Assay” sullo strumento “Agilent 2100 Bioanalyzer” (Agilent Technologies). Le librerie ottenute mediante l’utilizzo del pannello “Ion AmpliSeq™ Colon and Lung Cancer Research Panel v.1” (ThermoFisher Scientific) si presentano come picchi multipli nel range tra le 140 e le 260bp. Quindi, la dimensione degli ampliconi amplificati durante la preparazione delle “libraries” è stata verificata mediante strumento “Agilent 2100 Bioanalyzer” (Agilent Technologies), mentre la loro concentrazione è stata valutata mediante “Qubit® 2.0 Fluorometer” utilizzando il kit “High sensitivity assay kit Qubit® dsDNA” (Invitrogen). Successivamente, ogni “library” è stata diluita con TE in maniera tale da ottenere una concentrazione di ~100pM. Le “libraries” sono state quindi combinate per poter essere sequenziate in un numero ridotto di chip e si è proceduto con la preparazione del templato. Il templato è stato ottenuto utilizzando il kit “Ion PGM Template OT2 200 KIT” (ThermoFisher Scientific) seguendo il manuale d’istruzione. Per la preparazione del templato è stato utilizzato lo strumento OneTouch™ (ThermoFisher Scientific) (Figura 24B) nel quale avviene la PCR in emulsione. Dopo il controllo della qualità del campione non arricchito mediante quantificazione con “Qubit® 2.0 Fluorometer” e kit “Ion Sphere Quality Control” (Invitrogen), si è proceduto con l’arricchimento del campione utilizzando lo strumento OneTouch™ ES (Figura 24A) (ThermoFisher Scientific) seguendo il manuale d’istruzione del kit “Ion PGM Template OT2 200 KIT” (ThermoFisher Scientific). Infine, il sequenziamento è stato eseguito sullo

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strumento Ion PGM (ThermoFisher Scientific) con il kit di sequenziamento “Ion PGM 200” (ThermoFisher Scientific), caricando i campioni barcodati su chip 314v.2 o 316v.2.

8.1.5 Analisi dei dati di NGS

I dati di sequenziamento sono stati analizzati con l’Ion Torrent Software Suite v.4.2 (ThermoFisher Scientific) utilizzando il plugin variant Caller (VC) V.4.2-r88446. Nel plugin VC sono stati caricati sia le regioni “Hotspot” e “target” che i parametri JSON associati al pannello “Ion AmpliSeq Colon and Lung Cancer Panel v.1” (ThermoFisher Scientific). Tutte le varianti identificate sono state visivamente confermate attraverso l’Integrative Genomics Viewer (IGV)185. Per validare i dati di NGS ottenuti mediante VC, è stato utilizzato un secondo software per le chiamate delle varianti ovvero il “Genome Analysis Toolkit (GATK) 2.5 Unified Genotyper”. GATK ha chiamato le varianti nelle regioni target che erano incluse nel file BED con Phred score superiori a 5 (quelli con un punteggio Phred score compresi tra 5 e 30 sono stati indicati come varianti di bassa qualità). Solo le SNVs sono state considerate, annotate da SNPEff e comparate a quelle chiamate con Ion™ Reporter186. I campioni SF, FFPE e cfDNA appartenenti allo stesso paziente sono stati analizzati in modalità multi-campione. Le varianti sono state annotate utilizzando i tools PolyPhen-2) (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/187), SIFT (http://sift.jcvi.org/188) e Genomic Evolutionary Rate Profiling (GERP). Inoltre, sono stati identificate le varianti in base al catalogo delle mutazioni somatiche nel cancro (COSMIC) (http://cancer.sanger.ac.uk/cosmic189) e al database dei polimorfismi a singolo nucleotide (dbSNP). Inoltre, per distinguere i polimorfismi comuni dalle varianti rare è stata calcolata la frequenza allelica minore globale (Global Minor Allele Frequency; GMAF) utilizzando le frequenze alleliche del progetto 1000 genomi (http://www.1000genomes.org/190).

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8.1.6 Valutazione della “performance” dell’NGS

Per valutare i parametri di “performance” di NGS della nostra analisi, sono stati sequenziati secondo il flusso di lavoro stabilito due linee cellulari NSCLC e due standard di riferimento FFPE (Horizon Diagnostics). I dati di NGS provenienti dalle due linee cellulari (NCI-H1650 e NCI-1975) sono stati confrontati con i genotipi ottenuti mediante l’uso del pannello “Ion AmpliSeq™ Cancer Panel” su piattaforma Ion PGM™ (ThermoFisher Scientific)191. Allo stesso modo, i dati di NGS ottenuti dai due standard di riferimento FFPE (Horizon Diagnostics) sono stati confrontati con il genotipo determinato dalla company mediante tecnologia ddPCR. Sono stati valutati anche i parametri di prestazione del nostro test sui campioni WGA confrontando il profilo mutazionale amplificato delle diluizioni scalari della linea cellulare NCI-H1650 (10, 1 e 0.1 ng) con la corrispondente linea di cellule non amplificata. La sensibilità, specificità ed il valore predittivo positivo (PPV) dei test sono stati calcolati come precedentemente descritto192. Inoltre, gli intervalli di confidenza sono stati calcolati utilizzando il “Confidence Interval Calculator”.

8.1.7 Sequenziamento Sanger e Pirosequenziamento

Le varianti di NGS identificate con frequenze superiori al 20% sono stati validate mediante SS, utilizzando primers specifici per identificare la variante193. Le varianti genetiche con una frequenza invece compresa tra il 5% e il 20% sono state validate mediante pirosequenziamento (PS). I primers per i saggi di PS (che includono una coppia di primer per la PCR ed un primer di sequenziamento) sono stati disegnati con il software Pyrosequencing Assay Design (Biotage, Uppsala, Svezia). In Tabella 13 sono riportate le sequenze dei primers, le condizioni di amplificazione della PCR e le sequenze da analizzare.

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Tabella 13: Primers, condizioni di PCR e sequenza da analizzare per la validazione delle varianti mediante

pirosequenziamento.

Gene Primers della PCR Ta (°C)

Lunghezza amplicone

(bp)

Primer di sequenza Sequenza da analizzare MET F:ATTCTCCCCACAGATAGAAGAGC 56 98 S: TCCTGACTGTGTGGTG AGYGCCCTGGGAGC CAAAGTCCTTTCAT R:B-TGATGAACCGGTCCTTTACAGA MET F: B-GCCATGTGTGCATTCCCTATC 59 95 S: TGTTTTTGTTGACGATCTT GYTGAAGAAGTCGT TGACATATTTGAT R: GGTCCGTAAAAATGCTGGAGACA KRAS F: GGCCTGCTGAAAATGACTGA 56 79 S:CTTGTGGTAGTTGGAGCT NGTKGCGTAGGC R: B-GCTGTATCGTCAAGGCACTCT STK11 F: GCTCATCGGCAAGTACCTG 59 73 S: GGCAAGTACCTGATGG GGSACCTGCTGGGG GAAGGCTCTTACGG R:B-GTCCAGCACCTCCTTCACC TP53 F: B-CTGTGCAGCTGTGGGTTGAT 59 97 S: GCTTGTAGATGGCCATG KCGCGGACGCGGGT GCCGGGCGGGGG R:CTCACAACCTCCGTCATGTGC

Abbreviazioni: B: biotiniliato; F: primer forward della PCR; R: primer reverse della PCR; Ta: Temperatura di

annealing; S: primer di sequenziamento.

Le reazioni di PCR sono state effettuate amplificando 100 ng di DNA in un volume finale di reazione di 50 μL contenenti: 0.2 mmol/L dNTPs, 1 × GeneAmp® PCR Gold Buffer, 1.5 mmol di MgCl2, 0.2 μM di ciascun primer della PCR e 1.5 U di AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (Life Technologies). Il programma di PCR prevede: 10 minuti a 95 °C, 45 cicli di 30 secondi a 95 °C, 30 secondi alla temperatura specifica di annealing (vedi Tabella 13) e 30 secondi a 72 °C, seguiti da 5 minuti a 72 °C. I saggi di PS sono stati effettuati mediante lo strumento PSQ 96MA instrument (Qiagen); le reazioni di sequenziamento sono state eseguite con il kit “Pyro Gold reagent kit PSQ 96MA” seguendo le istruzioni del produttore e le analisi di sequenziamento condotte con il software PSQTM 96MA v.2.02 (Biotage).

86 8.2. RISULTATI

8.2.1 Valutazione del limite di rilevazione, della specificità, della sensibilità e del valore predittivo positivo della piattaforma di NGS

Per valutare il limite di rilevazione (Limit of Detection, LOD) del flusso di lavoro NGS, sono stati analizzati i DNA ottenuti dall’estrazione dei due tessuti FFPE Standard di Riferimento Horizon Diagnostics che presentavano mutazioni cliniche rilevanti nel dominio di tirosin chinasico di EGFR (EGFR p.Thr790Met e EGFR p.Glu746_Ala750del; Horizon, Cambridge, UK). Innanzitutto, sono state preparate una serie di diluizioni del DNA mutato per la p.Thr790Met sul gene EGFR (EGFR p.Thr790Met; Horizon) con il DNA estratto dal FFPE EGFR wild-type (Horizon) in modo da ottenere frequenze dell’allele mutato del 50%, 10%, 5% e 1%. Tutte le diluizioni dei DNA, mutati a differenti frequenze alleliche per la p.Thr790Met (50%, 10%, 5% e 1%), sono state utilizzate per la preparazione delle “libraries” e quindi sequenziate sull’Ion PGM ottenendo una copertura media per amplicone > 1200X ed una uniformità > 96% tra tutti i campioni di DNA analizzati. In particolare, il sistema NGS ha identificato la mutazione p.Thr790Met sul gene EGFR fino alla terza diluizione (5%) con frequenze alleliche rispettivamente del 49,6%, del 10,7% e del 5,6%. Al contrario, il sistema non è riuscito a chiamare la variante p.Thr790Met del campione con la frequenza allelica dell’1%.

Allo stesso modo, è stata valutata la LOD del sistema per chiamare correttamente le indel. Per fare ciò, sono state preparate una serie di diluizioni del DNA mutato per la p.Glu746_Ala750del sul gene EGFR (p.Glu746_Ala750del; Horizon) con il DNA estratto dal FFPE EGFR wild-type (Horizon) in modo da ottenere frequenze dell’allele mutato del 50%, 10%, 5% e 1%. Come fatto in precedenza per la mutazione p.Thr790Met, le diluizioni del DNA mutato per p.Glu746_Ala750del sono state utilizzate per preparare le “libraries” e

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sequenziarle. L’analisi anche in questo caso ha confermato una LOD del 5% nel rilevamento delle indel.

Inoltre, sono state sequenziati i DNA ottenuti sia dalle due linee cellulari NSCLC (NCI-H1650 e NCI-H1975) che dai due standard FFPE di riferimento che presentavano una frequenza allelica di mutazione su EGFR del 50% (EGFR p.Thr790Met e EGFR p.Glu746_Ala750del e EGFR wild-type; Horizon) in modo da poter valutare la specificità, la sensibilità ed il PPV del sistema NGS. L'analisi dei dati di NGS ottenuti ha rivelato una specificità del 100% sia per la rilevazione dei SNVs che delle indel comparando i genotipi ottenuti delle linee cellulari (NCI-H1650 e NCI-H1975) con i dati di genotipizzazione ottenuti da un precedente lavoro191. Anche i genotipi ottenuti mediante NGS dai due standard di riferimento FFPE sono stati comparati con i dati di genotipizzazione valutati dalla “company” Horizon utilizzando il sistema ddPCR. La sensibilità del rilevamento delle varianti alla LOD del 5% è stata del 96% (Intervallo di confidenza (CI) 95% = 80.5, 99.3), mentre il PPV è risultato del 100% (95% CI = 86.7, 100.0).

8.2.2 Controllo di qualità dei DNA ottenuti dai campioni FFPE

I DNA estratti dai tessuti FFPE hanno riportato una purezza molto elevata, ovvero assenza di contaminanti, riportando valori per i rapporti 260/280 e 260/230 maggiori dell’1.7 mediante lettura allo spettrofotometro “NanoDrop ND-1000” (ThermoFisher Scientific). Tutti i DNA estratti dai tessuti FFPE sono stati valutati tramite un saggio di controllo di qualità basato su una PCR multiplex e lo stato di degradazione ha presentato valori medi di AYR compresi tra 0.3 e 0.8.

Per identificare un “cut-off” AYR adatto per poter definire se procedere o meno alla preparazione della “library” per l’NGS sono stati scelti tre campioni di DNA estratto da FFPE con valori diversi di AYR (0.3, 0.6 e 0.8). Da questi DNA selezionati sono state

88

preparate le “libraries” partendo sia da 10 che da 20 ng di DNA. Come previsto, tutti i campioni di DNA sono stati amplificati con successo partendo da 20 ng di DNA, mentre solo due su tre sono stati amplificati a partire da 10 ng; infatti, il campione che non ha mostrato alcun prodotto di amplificazione era il DNA con lo stato di frammentazione più elevato, ovvero con AYR = 0.3 corrispondente al 70% di stato di degradazione. Inoltre, per individuare il “cut-off” di degradazione del DNA come pre-requisito per procedere con la preparazione della “library”, abbiamo aumentato tramite utilizzo del calore lo stato di frammentazione del DNA ottenendo DNA con AYR < 0.3. In particolare, tramite calore abbiamo ottenuto un DNA test con un AYR di 0.2 che è stato successivamente amplificato a partire da 20 ng di DNA input per la preparazione della “library”. Tuttavia, questo campione non ha mostrato alcun prodotto di amplificazione, suggerendo che AYR = 0.3 sia il “cut-off” per definire se i DNA ottenuti dai campioni FFPE siano idonei per effettuare

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