IDENTIFICAZIONE DI POTENZIALI MARCATORI MOLECOLARI PER IL TRATTAMENTO PERSONALIZZATO DI PAZIENTI AFFETTI DA CARCINOMA POLMONARE NON A PICCOLE CELLULE (NSCLC) MEDIANTE NEXT-GENERATION SEQUENCING (NGS)

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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI PISA

Facoltà di Medicina e Chirurgia

SPECIALIZZAZIONE IN PATOLOGIA CLINICA

TESI

IDENTIFICAZIONE DI POTENZIALI MARCATORI MOLECOLARI PER IL

TRATTAMENTO PERSONALIZZATO DI PAZIENTI AFFETTI DA

CARCINOMA POLMONARE NON A PICCOLE CELLULE (NSCLC)

MEDIANTE NEXT-GENERATION SEQUENCING (NGS)

Relatore: Nicola Traverso

Relatore: Aldo Paolicchi

Correlatore: Francesco Grossi

CANDITATO

Irene Vanni

Anno accademico 2015-2016

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RINGRAZIAMENTI

Un sentito ringraziamento a tutte le persone che in modi diversi mi sono

state vicine e mi hanno permesso di raggiungere tale obiettivo. Desidero

ringraziare Francesco Grossi per l’opportunità di aver fatto parte del suo

laboratorio e per le responsabilità che mi ha affidato facendomi crescere

professionalmente.

Desidero inoltre ringraziare il Prof. Nicola Traverso, mio relatore, per il suo

sostegno durante la stesura della tesi e la stima impartita.

Ringrazio tutti i miei colleghi dell’Unita Operativa Semplice Tumori

Polmonari. In particolare, Simona che oltre ad essere collega e punto di

riferimento è soprattutto una grande amica che mi ha sempre supportato

con pazienza aiutandomi in qualsiasi campo.

Un inestimabile ringraziamento va alla mia famiglia, amici e a tutte le

persone che con ruoli diversi mi sono stati vicini in questi anni e che oltre ad

avermi “supportato” mi hanno più di tutto “sopportato”.

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SOMMARIO

1. INTRODUZIONE

pag.1

2. EPIDEMIOLOGIA DEI CARCINOMI POLMONARI

pag.3

3. DIAGNOSI E STADIAZIONE NEI NSCLC

pag.7

4. CLASSIFICAZIONE MOLECOLARE

pag.10

4.1. EGFR pag.14 4.2. KRAS pag.28 4.3. ALK pag.29 4.4. ROS1 pag.34 4.5. RET pag.36 4.6. NTRK1 pag.38 4.7. MET pag.41 4.8. BRAF pag.42 4.9. PIK3CA pag.44 4.10. HER2 pag.45

5. RILEVAZIONE DELLE ALTERAZIONI GENETICHE

pag.46

5.1. La biopsia tissutale pag.46

5.2 La biopsia liquida e il DNA libero circolante (cfDNA) pag.50

6. NEXT GENERATION SEQUENCING

pag.56

6.1. Evoluzione del sequenziamento pag.56

6.2. Piattaforme di NGS pag.62

7. OBIETTIVI DELLO STUDIO

pag.71

(4)

8.1 MATERIALI E METODI pag.74

8.1.1 Raccolta dei campioni pag.74

8.1.2 Estrazione e controllo di qualità del DNA pag.77

8.1.3 Amplificazione dell’intero genoma pag.80

8.1.4 NGS del DNA pag.81

8.1.5 Analisi dei dati di NGS pag.83

8.1.6 Valutazione della “performance” dell’NGS pag.84

8.1.7 Sequenziamento Sanger e Pirosequenziamento pag.84

8.2 RISULTATI pag.86

8.2.1 Valutazione del limite di rilevazione, della pag.86

specificità, della sensibilità e del valore predittivo positivo della piattaforma di NGS

8.2.2 Controllo di qualità dei DNA ottenuti dai pag.87

campioni FFPE

8.2.3 NGS dei campioni FFPE e SF pag.88

8.2.4 NGS del cfDNA pag.94

9. OBIETTIVO 2

pag.98

9.1. MATERIALI E METODI pag.98

9.1.1 Raccolta dei campioni pag.98

9.1.2 Estrazione RNA, controllo di qualità dell’RNA e pag.99

retrotrascrizione in cDNA

9.1.3 NGS del cDNA pag.103

9.2 RISULTATI pag.107

9.2.1 Controllo di qualità e quantità degli RNA pag.107

(5)

9.2.2 NGS dei campioni pag.108

10. DISCUSSIONE

pag.110

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1

1. INTRODUZIONE

Il carcinoma polmonare rappresenta attualmente la prima causa di morte per cancro in tutto il mondo con circa 1.7 milioni di decessi all’anno ed è responsabile di più morti rispetto ai i seguenti tumori combinati: tumore alla mammella, colon e pancreas1. Sebbene la maggior parte dei tumori osservati nel polmone (80-90%) sono causati dal fumo (infatti le sigarette sono la principale causa dello sviluppo del carcinoma polmonare), altri fattori ambientali e fattori genetici sono noti per contribuire alla carcinogenesi del polmone2,3. Inoltre, fattori ereditari sono responsabili di circa l'8% dei casi di cancro al polmone4. Fino ad oggi, il carcinoma polmonare non viene più semplicemente definito come una singola neoplasia maligna dell'epitelio polmonare, ma è piuttosto rappresentato da una varietà di aspetti istologici e caratteristiche molecolari. Dal punto di vista istologico, circa l’85% dei casi di carcinoma polmonare è del tipo non a piccole cellule (Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC) e la maggior parte dei pazienti con NSCLC riceve la diagnosi della malattia in stadio avanzato con un tasso di sopravvivenza globale a 5 anni del 4%. Il vero cambiamento epocale del trattamento del NSCLC in stadio avanzato è legato alle terapie a bersaglio molecolare. L’aver compreso che determinate alterazioni molecolari sono bersaglio per farmaci estremamente mirati e molto efficaci, consente ad oggi in pazienti selezionati di raggiungere sopravvivenze due o tre volte superiori rispetto a quanto si ottiene con la chemioterapia standard nei pazienti non mutati. Attualmente, il profilo genetico di tali pazienti e quindi la valutazione delle alterazioni molecolari suscettibili di terapia target e/o di resistenze ai trattamenti farmacologici avviene tramite biopsia. Tuttavia, tale tecnica presenta degli svantaggi, in quanto non sempre è praticabile, è invasiva e la metodica di preparazione/conservazione del campione bioptico può degradare il DNA da analizzare. Infatti, nel contesto clinico la maggior parte dei campioni di tessuto tumorale, ottenuti tramite biopsia, sono fissati in

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2

formalina e inclusi in paraffina (FFPE) e gli acidi nucleici (DNA e RNA) estratti da questi campioni risultano spesso di ridotta quantità e qualità.

Recentemente, la valutazione di mutazioni nel DNA libero circolante (circulating free DNA, cfDNA) nel sangue dei pazienti affetti da NSCLC, definita “biopsia liquida”, è emersa come una metodica alternativa e poco invasiva utile per la caratterizzazione molecolare del paziente. Inoltre, la biopsia liquida può risultare utile nella definizione di meccanismi di resistenza a farmaci biologici per specifici target molecolari, permettendo, durante il trattamento, il monitoraggio dell’insorgenza di cloni selezionati dalla pressione selettiva del farmaco. Nel corso dell’ultimo ventennio lo sviluppo delle tecnologie definite “high-throughput” ha consentito un accesso senza precedenti allo studio del genoma tumorale che ha portato all’acquisizione di una grande mole di nuove conoscenze sulla biologia della malattia. Recentemente, il sequenziamento di nuova generazione o Next Generation Sequencing (NGS) ha rivoluzionato la ricerca biomedica, permettendo di studiare l’intero genoma, le regioni cromosomiche o i singoli geni in tempi più rapidi rispetto alle metodiche tradizionali. Inoltre, questa metodica può essere eseguita anche su minime quantità di tessuto tumorale FFPE o sul cfDNA estratto da sangue periferico. L’NGS permette di identificare sia mutazioni che coinvolgano target genetici come potenziali bersagli di farmaci attualmente in uso nella pratica clinica sia di scoprire nuove alterazioni utili allo sviluppo di nuove molecole.

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2. EPIDEMIOLOGIA DEI CARCINOMI POLMONARI

In Italia, escludendo i carcinomi della cute (non melanomi), il tumore più frequente risulta essere quello del colon-retto (con 52.000 nuovi casi di cui 29.500 tra gli uomini e 22.900 tra le donne), seguito dal tumore della mammella (con circa 50.000 nuovi casi), dal tumore del polmone (con oltre 41.000 nuovi casi di cui 27.800 tra gli uomini e 13.500 tra le donne), dal tumore della prostata (con 35.000 nuove diagnosi) ed infine dal tumore della vescica (con circa 26.600 nuovi casi di cui 21.400 tra gli uomini e 5.200 tra le donne). Tuttavia, i dati dei Registri Tumori Italiani indicano il tumore del polmone come la prima causa di morte oncologica nella popolazione (19%) con una frequenza di morti del 26% negli uomini e dell’11% tra le donne5.

Il carcinoma del polmone risulta la prima causa di morte oncologica anche in tutte le fasce di età rappresentando il 14% dei decessi tra i giovani (0-49 anni), il 30% tra gli adulti (50-69 anni) e il 26% tra gli ultra settantenni5. Nel 2017 sono attese oltre 41.000 nuove diagnosi di tumore del polmone (oltre il 30% fra le donne). Sebbene si registri una marcata diminuzione di incidenza negli uomini (in relazione alla riduzione dell’abitudine al fumo), pari a -2,0%/anno negli anni più recenti, a questa tendenza fa purtroppo riscontro un aumento dei nuovi casi tra le donne (+2,6%/anno dal 1999 al 2016).

La maggior parte dei casi di carcinoma polmonare sono diagnosticati in stadio avanzato per presenza di metastasi (57%), mentre una quota più ridotta di casi è diagnosticata in stadio localmente avanzato (22%), in stadio iniziale (15%) o con malattia non stadiabile (6%). Si tratta di neoplasie altamente aggressive, che rappresentano la prima causa di morte correlata a tumori negli Stati Uniti, con una mortalità di 48.4/100.000 abitanti; il tasso di sopravvivenza globale a 5 anni (5-year overall survival; 5Y-OS) si riduce con l’estensione della malattia: 54% in stadio iniziale, 26.5% in stadio localmente avanzato,

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4.0% in stadio avanzato con metastasi a distanza e 7.4% nei casi di malattia non stadiabile6.

Il principale fattore di rischio associato ai carcinomi polmonari è costituito dal fumo di sigaretta, al quale è ascrivibile l’85%-90% di tutti i nuovi casi. Il rischio relativo di carcinoma del polmone nei fumatori è incrementato 14 volte rispetto ai non fumatori (nel caso dei forti fumatori, fino a 20 volte); inoltre, è noto come la cessazione del fumo si traduca in un progressivo decremento del rischio di contrarre questa patologia. Altri fattori di rischio sono rappresentati dal fumo passivo, da esposizioni ambientali o professionali ad agenti inquinanti come il gas radon o da processi infiammatori cronici a carico dell’apparato respiratorio7 -10.

Esistono diversi istotipi di carcinoma polmonare, differenti tra loro per caratteristiche morfologiche e biologiche, e sensibili a diversi approcci terapeutici. Il carcinoma polmonare è classificato in due gruppi principali: carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) e carcinoma non a piccole cellule (NSCLC) (Figura 1).

Figura 1: Classificazione istologica del carcinoma polmonare in SCLC (15%) e NSCLC (85%) (con i

sottotipi istologici del NSCLC). (Tratto da: https://www.lungevity.org/for-patients-caregivers/lung-cancer-101/types-of-lung-cancer ).

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Gli SCLC comprendono circa il 15% di tutti i carcinomi polmonari ed è fortemente associato al tabagismo11. Istologicamente, SCLC è definito dalla presenza di granuli neurosecretori all'interno delle cellule: circa il 90% dei casi sono positivi per i marcatori neuroendocrini. Le cellule di SCLC hanno grandi nuclei, un piccolo orlo di citoplasma e sono infatti caratterizzati da un elevato rapporto nucleo-membrana citoplasmatica (Figura 2A)11,12.

Il NSCLC è invece l'istotipo più comune di carcinoma polmonare, che rappresenta circa l'85% di tutti i casi di cancro del polmone. Il NSCLC può essere ulteriormente classificato in tre grandi sottoinsiemi: adenocarcinoma, carcinoma a cellule squamose e carcinoma a grandi cellule (Figura 3).

L'adenocarcinoma è l'istotipo più comune di cancro del polmone e rappresenta circa il 50% dei casi NSCLC. Nasce da ghiandole della mucosa bronchiale o da cellule che occupano la superficie dell’epitelio polmonare ed in particolare gli alveoli (Figura 2B)11,12. Recenti studi hanno evidenziato che il 90% degli adenocarcinomi polmonari rientrano nel sottotipo misto, cosicché è stata proposta una classificazione che contenesse le percentuali di ciascuno dei vari componenti istologici come segue: leptidico, acinare, papillare, micropapillare e solido. Infatti, istologicamente, gli adenocarcinomi sono spesso eterogenei, mostrando una varietà di patterns: il carcinoma con prevalente crescita leptidica, il carcinoma acinare, il carcinoma papillare, il carcinoma micropapillare ed il carcinoma a componente prevalentemente solida13. La diagnosi di adenocarcinoma può essere realizzata mediante colorazione positiva per citocheratina 7, fattore di trascrizione tiroideo 1 (TTF-1), e apoproteina A; tuttavia, gli adenocarcinomi metastatici sono tipicamente negativi per la colorazione con TTF-1 nei siti secondari12.

Il carcinoma a cellule squamose, chiamato anche carcinoma epidermoide, rappresenta circa il 30% di tutti i casi di cancro del polmone. Nasce nei bronchi prossimali e questo

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istotipo ha la più alta associazione con storia di fumo rispetto alle altre forme di NSCLC11,12. Il carcinoma a cellule squamose è istologicamente classificato dalla presenza di cheratinizzazione e ponti intercellulari (Figura 2C)11.

Il carcinoma a grandi cellule, che rappresenta circa l'8% dei NSCLC, si sviluppa nei bronchi ed è definito dalla presenza di grandi nuclei e dall’assenza di differenziazione ghiandolare o squamosa, specifica rispettivamente dell’adenocarcinoma e del carcinoma a cellule squamose (Figura 2D)11,12. Storicamente, i tumori polmonari sono stati ampiamente trattati con diversi agenti chemioterapici in base alle caratteristiche istologiche al momento della diagnosi14.

Figura 2: Sottotipi istologici di cancro al polmone. (A) carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC); (B)

Adenocarcinoma; (C) Carcinoma a cellule squamose; (D) Carcinoma a grandi cellule (H&E; ingrandimento 40x).

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Figura 3: Sottotipi istologici del NSLC. (Tratto e modificato da: Chan et al. Transl Lung Cancer Res. 2015; 4:36-54).

3. DIAGNOSI E STADIAZIONE NEI NSCLC

Diversamente da altre neoplasie, per i NSCLC non esiste al momento una strategia di diagnosi precoce comunemente accettata nella pratica clinica; perciò, spesso la diagnosi è ottenuta tardivamente, come riscontro incidentale in corso di accertamenti per altre patologie o a seguito della comparsa di sintomi più o meno aspecifici correlati alla progressione loco-regionale o sistemica della malattia. Quando sussiste il sospetto clinico o di carcinoma polmonare, è indicato un approfondimento radiologico mediante tomografia computerizzata (TC) del torace, possibilmente con mezzo di contrasto iodato (MDC). La diagnosi di certezza di carcinoma cellulare (NSCLC o SCLC) è sempre anatomo-patologica, normalmente ottenuta tramite agobiopsia o agoaspirato della lesione primitiva o di eventuali localizzazioni metastatiche qualora siano facilmente aggredibili. L’esame anatomo-patologico deve essere mirato al raggiungimento di una diagnosi precisa in grado di definire lo specifico istotipo e di stabilire con un buon margine di sicurezza l’origine polmonare del tumore. A tale scopo, l’anatomo-patologo studia il materiale a disposizione tramite valutazione morfologica e specifici parametri immuno-fenotipici15. Una volta confermata la diagnosi di carcinoma polmonare, il paziente è

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sottoposto a stadiazione di malattia tramite diversi esami strumentali che possono essere i seguenti: TC con MDC del torace ed estesa almeno all’addome superiore (spesso già eseguita in corso di work-up diagnostico), TC con MDC o risonanza magnetica nucleare (RMN) dell’encefalo e tomografia ad emissione di positroni con 5-fluoro-desossi-glucosio (FDG-PET). La stadiazione strumentale può essere integrata, a seconda della situazione, da procedure invasive come la broncoscopia con ecografia endo-bronchiale (endo-bronchial ultrasound; EBUS) con biopsia per valutare eventuali linfoadenopatie mediastiniche sospette, la biopsia di lesioni sospette per localizzazioni metastatiche di malattia, o la toracentesi per distinguere un versamento pleurico reattivo da un

versamento neoplastico

(http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/nscl.pdf)16. La corretta valutazione dell’estensione di malattia è attuata tramite il sistema di classificazione TNM, in cui i parametri sono costituiti dall’estensione della neoplasia primitiva (T), dall’eventuale interessamento linfonodale loco-regionale (N) e dalla presenza o meno di localizzazioni metastatiche a distanza (M); il TNM è valutato tramite esami clinico-strumentali (TNM clinico; cTNM), approfondimenti anatomo-patologici su campioni bioptici o chirurgici (TNM patologico; pTNM), oppure una combinazione di questi. In base alla combinazione di tali parametri, i NSCLC sono classificati in diversi stadi, che indicano l’estensione di malattia e che hanno valore prognostico. Come sarà descritto in seguito, la stadiazione dei NSCLC non ha solo valore prognostico, ma influisce pesantemente sull’impostazione terapeutica di ogni paziente. Pertanto, nella pratica clinica è necessario prestare grande attenzione al conseguimento di una stadiazione precisa, poiché essa è necessaria per una scelta terapeutica corretta.

Nella Tabella 1 è riportata la classificazione TNM attualmente in uso nei NSCLC, mentre nella Tabella 2 è riportata la suddivisione in stadi17.

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CATEGORIA DESCRZIONE

T: TUMORE PRIMITIVO

TX Tumore non valutabile, oppure presenza del tumore dimostrata dalla presenza di cellule maligne nell’espettorato o nel lavaggio bronchiale, ma non visualizzato radiologicamente o tramite broncoscopia

TO Nessuna evidenza del tumore primitivo Tis Carcinoma in situ

• Tis (AIS): adenocarcinoma

• Tis (SCIS): carcinoma a cellule squamose

T1 Tumore di dimensioni ≤3 cm nel diametro maggiore, circondato da parenchima polmonare o pleura viscerale, senza evidenza di invasione più prossimale rispetto al bronco lobare T1mi Adenocarcinoma minimamente invasivo

T1a Tumore di dimensioni <1 nel diametro maggiore

T1b Tumore di dimensioni >1 cm ma ≤2 cm nel diametro maggiore T1c Tumore di dimensioni >2 cm ma ≤3 cm nel diametro maggiore

T2 Tumore > 3 cm ma <5 cm; o tumore con una qualsiasi delle seguenti caratteristiche (tumori T2 caratteristiche con queste caratteristiche sono classificati T2a se ≤4 cm o se dimensione non può essere determinata e come T2b se > di 4 cm ma < 5 cm):

• Coinvolge bronco principale indipendentemente dalla distanza dalla carena, ma senza coinvolgere la carina

• Invade pleurico viscerale

• Associata con atelettasia o polmonite ostruttiva che si estende alla regione ilare, sia coinvolgendo parte del polmone o l'intero polmone

T2a Tumore >3 cm ma <4 cm di dimensione massima T2b Tumore >4 cm ma non <5 cm di dimensione massima

T3 Tumore >5 cm e <7 cm di dimensione massima o uno che invade direttamente qualsiasi dei seguenti: pleura parietale (PL3), parete toracica (compresi tumori del solco superiore), nervo frenico, pericardio parietale; o associate a nodulo tumorale separato (s) nello stesso lobo come primario

T4 Tumori >7 cm o uno che invade qualsiasi delle seguenti: diaframma, mediastino, cuore, grossi vasi, trachea, nervo laringeo ricorrente, esofago, corpi vertebrali, carena; nodulo tumorale separata (s) in un diverso lobo omolaterale a quella del primario

N: LINFONODI REGIONALI

NX Linfonodi regionali non valutabili

NO Assenza di metastasi linfonodale regionale

N1 Metastasi in linfonodi omolaterali ilari peribronchiali e / o omolaterali e linfonodi intrapolmonari, incluso il coinvolgimento per estensione diretta

N2 Coinvolgimento di linfonodi mediastinici omolaterali e/o in sede sotto carenale

N3 Coinvolgimento di linfonodi mediastinici controlaterali, ilari controlaterali, scaleni omolaterali o controlaterali, e/o sovraclaveari

M: METASTASI A DISTANZA

MO Assenza di metastasi a distanza M1 Presenza di metastasi a distanza

M1a Nodulo tumorale separato (s) in un lobo controlaterale; tumore con noduli pleurico o pleurico maligno o versamento pericardico; la maggior parte (pericardico) del versamento pleurico con cancro del polmone sono dovuti al tumore; in alcuni pazienti, tuttavia, diversi esami microscopici di fluido pleurico (pericardico) sono negativi per tumore, ed il fluido è sia non sanguinante che essudato; dove questi elementi e il giudizio clinico impongono che il versamento non è correlato al tumore, il versamento deve essere escluso come

descrittore della stadiazione

M1b Metastasi singola extra toracica in un singolo organo e coinvolgimento di un singolo linfonodo distante (non regionale)

M1c Metastasi multiple extra toraciche in uno o più organi

Tabella 1: Classificazione TNM attualmente in uso (8a edizione). (Tratto ed adattato da: Goldstraw P et al. J Thorac Oncol. 2016;11(1):39-51).

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STADIO T N M

CARCINOMA OCCULTO TX N0 M0

STADIO 0 Tis N0 M0

STADIO IA1 T1mi N0 M0

T1a N0 M0 STADIO IA2 T1b N0 M0 STADIO IA3 T1c N0 M0 STADIO IB T2a N0 M0 STADIO IIA T2b N0 M0 STADIO IIB T1a,b,c N1 M0 T2a,b N1 M0 T3 N0 M0 STADIO IIIA T1a,b,c N2 M0 T2a, b N2 M0 T3 N1 M0 T4 N0 M0 T4 N1 M0 STADIO IIIB T1a,b,c N3 M0 T2a,b N3 M0 T3 N2 M0 T4 N2 M0 STADIO IIIC T3 N3 M0 T4 N3 M0

STADIO IVA Qualsiasi T Qualsiasi N M1a Qualsiasi T Qualsiasi N M1b STADIO IVB Qualsiasi T Qualsiasi N M1c

Tabella 2: Suddivisione dei NSCLC in stadi in base ai parametri TNM. (Tratto ed

adattato da: Goldstraw P et al. J Thorac Oncol. 2016;11(1):39-51).

4. CLASSIFICAZIONE MOLECOLARE

Nel corso degli ultimi decenni, crescenti sforzi hanno dimostrato che i tumori spesso presentano ricorrenti mutazioni oncogeniche, amplificazioni e riarrangiamenti nei geni che guidano la proliferazione e la sopravvivenza cellulare. Queste alterazioni possono verificarsi in diversi geni considerati “drivers” e possono essere mutualmente esclusivi all'interno dello stesso tumore. Ad esempio, in una sottoclasse di adenocarcinomi polmonari mutati nel proto-oncogene KRAS (omologo dell'oncogene virale del sarcoma 2 di Kirsten nel ratto) altri eventi genetici sono stati identificati sia nei geni STK11 (gene codificante una serina-treonina chinasi 11) / LKB1 (gene codificante la chinasi del fegato

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B1) o nel gene TP53 (gene che codifica la proteina tumorale 53)18. Al contrario, alcune alterazioni genetiche si trovano raramente in concomitanza con altre mutazioni ed in particolar modo nella “pathways” del recettore tirosin-chinasico. In particolare, le mutazioni nel gene per il recettore del fattore di crescita dell'epidermide (EGFR) raramente vengono riscontrate in tumori con mutazioni in KRAS, suggerendo un rapporto mutualmente esclusivo19.

Le cellule tumorali dipendenti dal segnale proveniente da proteine ongeniche mutate sono sensibili a specifici trattamenti terapeutici mirati20. Questi risultati hanno portato ad un cambiamento che rivoluziona i paradigmi nella classificazione e nel trattamento del carcinoma polmonare che ora è focalizzato su criteri molecolari oltre che sulla classificazione istologica. Ciò è particolarmente vero per l’adenocarcinoma dove si sono verificati la maggior parte dei progressi sulla caratterizzazione molecolare, mentre nel carcinoma a cellule squamose spesso questo istotipo non viene ulteriormente sotto classificato. Infatti, nel 2015, la classificazione dei tumori del polmone, pleura, timo e cuore da parte della World Health Organization (WHO) è arrivata alla stesura del settimo volume della 4° edizione della serie WHO sulla tipizzazione istologica e genetica dei tumori umani con numerosi importanti cambiamenti rispetto alla classificazione WHO del 200415. Le variazioni più significative di questa edizione sono state: l'uso di immunoistochimica in tutta la classificazione, dare nuova enfasi sugli studi genetici ed in particolare sull’integrazione dei test molecolari per personalizzare le strategie di trattamento per i pazienti affetti da cancro del polmone avanzato, fornire un approccio completamente diverso per l'adenocarcinoma del polmone come precedentemente proposto nel 2011 dalla “Association for the Study of Lung Cancer/American Thoracic Society/European Respiratory Society classification”, riclassificare i carcinomi a cellule squamose15.

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Un numero considerevole di alterazioni genetiche sono già state individuate nel guidare la tumorigenesi del polmone (in particolare nell’adenocarcinoma) tra cui le principali sono quelle a carico dei geni ALK, BRAF, EGFR, HER2, MEK1, MET, NTRK1, PIK3CA, RET e ROS1 (Figura 4)21. Inoltre, in questo contesto la “Food and Drug Administration (FDA)” (Agenzia per gli Alimenti e i Medicinali, abbreviato in FDA) ha già approvato l’utilizzo di piccole molecole ad uso terapeutico nei pazienti con adenocarcinoma del polmone in presenza di mutazioni nel gene EGFR e di riarrangiamenti genici sia nel gene che codifica per il recettore tirosin-chinasico del proto-oncogene ROS1 (ROS1) che sul gene che codifica la chinasi del linfoma anaplastico (ALK)21. Un certo numero di altre alterazioni hanno farmaci che sono attualmente in via di sperimentazione in studi clinici.

Figura 4: Frequenza dei geni alterati nell’adenocarcinoma del polmone e

farmaci in sperimentazione e approvati dalla FDA. (Tratto da: Tsao AS et al. J

Thorac Oncol. 2016;11(5):613-638).

Nel carcinoma polmonare, sono state identificate anche diverse mutazioni in geni soppressori, come TP53, LKB1 e RB (gene che codifica la proteina del retinoblastoma), che

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contribuiscono alla tumorigenesi22-24. Inoltre, l'analisi genetica dei tumori in soggetti fumatori e non fumatori ha identificato differenti caratteristiche molecolari. Infatti, mutazioni nel gene EGFR di solito si riscontrano nei pazienti con tumore del polmone non fumatori, mentre mutazioni nel gene KRAS si ritrovano nei pazienti fumatori25-27. Di particolare interesse è uno studio pubblicato nel 2012 in cui i ricercatori hanno analizzato il profilo genetico di 178 carcinomi del polmone a cellule squamose per fornire uno scenario completo delle alterazioni genomiche ed epigenomiche28. In questo studio, gli autori hanno dimostrato che questo tipo tumore è caratterizzato da complesse alterazioni genomiche (una media di 360 mutazioni esoniche, 165 riarrangiamenti genomici e 323 alterazioni di “copy number” per tumore). Le mutazioni più frequentemente riscontrate sono state trovate in 11 geni, tra cui TP53; inoltre mutazioni mai riportate sono state riscontrate nel gene del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) HLA-A di classe I. Le “pathways” trovate più significativamente alterate sono state CDKN2A e RB1 in circa il 72% dei tumori28. Similmente, un altro studio ha analizzato dal punto di vista genetico 230 adenocarcinomi polmonari asportati rivelando un alto tasso di mutazioni somatiche (media 8.9 mutazioni/megabase)29. I ricercatori hanno identificato diciotto geni che erano significativamente mutati; tra questi le mutazioni di EGFR erano più comuni nelle femmine, mentre mutazioni nel gene RBM10 erano più frequenti nei pazienti di sesso maschile. Inoltre, aberrazioni nei geni NF1, TEM, ERBB2 e RIT1 si sono verificati in circa il 13% dei campioni tumorali ed erano maggiormente presenti nei campioni che non presentavano un oncogene attivato29.

Molto recentemente, mediante sequenziamento dell'esoma ed analisi di “copy number” sono stati esaminati 660 adenocarcinomi e 484 carcinomi squamosi del polmone (tessuto tumorale vs tessuto normale) allo scopo di identificare nuovi “driver” di cancerogenesi del polmone30. Da questa analisi, nuovi geni sono stati trovati mutati significativamente in

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entrambi gli istotipi; tuttavia le alterazioni trovate a maggior frequenza nel carcinoma squamoso del polmone erano più simili ad altri carcinomi squamosi rispetto agli adenocarcinomi polmonari. È interessante notare che circa il 47% degli adenocarcinomi del polmone ed il 53% dei carcinomi squamosi polmonari avevano almeno cinque neoepitopi predetti, suggerendo che l’utilizzo di immunoterapie potrebbero aiutare nel trattamento di entrambi gli istotipi30.

4.1. EGFR

I recettori tirosin-chinasici (o receptor tyrosine kinase, RTK) sono proteine di membrana aventi attività chinasica ed agiscono fosforilando residui di tirosina nella proteina bersaglio. Le proteine recettoriali tirosin chinasiche sono costituite da un dominio extracellulare (di circa 50-80 kD) che possiede un sito di legame per il ligando specifico, un dominio citoplasmatico (che può variare dai 150 ai 350 kD) che possiede un sito di attacco per l'adenosintrifosfato (ATP) ed un secondo dominio citoplasmatico con cui riconosce specifiche sequenze delle proteine bersaglio. La regione transmembrana è costituita da una singola alfa elica idrofobica che attraversa la membrana. Il sito attivo è invece costituito da una breve ansa, che forma una piccola apertura in fondo alla quale si trova il sito di legame per l'ATP. Adiacente al sito attivo vi è una sequenza, indicata col nome di labbro di fosforilazione, che possiede alcuni residui di tirosina la cui fosforilazione è fondamentale per l'attività chinasica della proteina.

Il recettore del fattore di crescita dell'epidermide (EGFR) è una proteina di membrana di 170 KDa codificata da un gene di 28 esoni localizzato sul cromosoma 7 in 7p12 (Figura 5).

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Figura 5: Rappresentazione del locus dove mappa il gene EGFR (7p12).

L’EGFR appartenente alla famiglia dei recettori tirosina chinasi HER (o ErbB) (Figura 6), viene codificato dal gene erbB-1 localizzato sul braccio corto del cromosoma 7 in posizione 12 (7p12) ed è costituito da 28 esoni che codificano per una glicoproteina transmembrana di 170 kDA costitutivamente espressa sulla superficie delle cellule epiteliali, definita EGFR. In particolare, gli esoni 2-16 codificano per il dominio extracellulare, l’esone 17 codifica per il dominio transmembrana, gli esoni 18-24 codificano per il dominio tirosin chinasico e gli esoni 25-28 codificano per il dominio regolatore del recettore EGFR.

In generale, i ligandi degli RTK sono molecole solubili o più spesso ormoni peptidici. Tra i ligandi troviamo numerosi fattori di crescita come il fattore di crescita dell'epidermide (epidermal growth factor, EGF), il fattore di crescita derivato dalle piastrine (platelet-derived growth factor, PDGF) e molti altri. Allo stato inattivo gli RTK si trovano in forma monometrica ancorati alla membrana cellulare. Il legame con queste molecole porta all'attivazione del recettore, che omodimerizza con un altro recettore EGFR od eterodimerizza con altre proteine della famiglia dei recettori per il fattore di crescita epiteliale come HER2/c-neu (ErbB-2), HER3 (ErbB-3) e HER4 (ErbB-4)31,32. Il partner più frequente di EGFR è rappresentato da HER2/c-neu (Figura 6)33.

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Figura 6: La famiglia di EGFR: 4 differenti recettori in cui si distinguono 3 domini:

dominio extracellulare, che, ad eccezione di HER2, interagisce con uno specifico ligando; dominio transmembrana; dominio intracellulare, che, fatta eccezione per HER3, è dotato di attività tirosin-chinasica.

La omo/eterodimerizzazione porta all'avvicinamento dei domini citoplasmatici dei suddetti recettori, che possiedono un'attività tirosin chinasica. Dopo la dimerizzazione dei recettori tirosin chinasici, i primi bersagli della fosforilazione sono i numerosi residui di tirosina localizzati nel dominio C-terminale del recettore, tra cui Y992, Y1045, Y1068, Y1148 e Y117334; in conseguenza a ciò si ha un cambiamento conformazionale della proteina ed il sito attivo per la fosforilazione delle tirosine comincia a fosforilare altre proteine bersaglio. Il passaggio successivo nella propagazione del segnale è l’attivazione di una proteina G, in questo caso appartenente alla famiglia RAS. La proteina G, attivata dal suo legame con GTP, si lega poi a una proteina chinasi citoplasmatica, cambiandone la conformazione e innescandone l’attività chinasica. Le proteine chinasiche che sono a valle nella cascata sono le proteine RAF, MEK (1 e 2) e MAPK (ERK1 ed ERK2). I bersagli di alcune di queste proteine sono attivatori e repressori trascrizionali che, cambiando conformazione, inducono o reprimono la trascrizione di geni importanti per la proliferazione e crescita cellulare. La dimerizzazione di EGFR non comporta soltanto

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l'attivazione della via di RAS, ma anche l'innesco della via di PI3K, il cui principale bersaglio è AKT che, in seguito ad attivazione, è in grado di inibire fortemente l'apoptosi.

Riassumendo possiamo dire che l’attivazione di EGFR è in grado di innescare almeno due vie di segnale (Figura 7):

➢ La via KRAS-BRAF-MEK (Mitogen-activated ERK kinase)-MAPK (Mitogen Activated Protein Kibase) coinvolta principalmente nella proliferazione e differenziazione cellulare. L’attivazione di questo sistema consente l’ingresso della cellula nel ciclo cellulare con conseguente proliferazione. Infatti, in seguito all’attivazione dell’EGFR, viene reclutata la proteina RAS, la quale si lega ai residui di tirosina fosforilati della porzione intracitoplasmatica del recettore con conseguente attivazione della chinasi RAF. A cascata, si ha la fosforilazione e l’attivazione di ulteriori molecole effettrici, quali MEK ed ERK, che, a loro volta, interagiscono con specifici fattori trascrizionali inducendo così l’espressione di proteine nucleari (come le cicline D1 e D2) che mediano l’ingresso delle cellule nel ciclo cellulare (Figura 7A).

➢ La via PI3K-AKT è invece responsabile dei segnali di sopravvivenza attraverso l’inibizione del meccanismo di morte cellulare programmata (apoptosi). Infatti, l’attivazione di EGFR porta il recettore a reclutare ed attivare la PI3K (fosfoinositide 3-chinasi), la quale a sua volta fosforila il PI(4,5)P2 (fosfoinositide 4,5-bifosfato) a PI(3,4,5,)P3 (fosfoinositide 3,4,5trifosfato). Entrambi i fosfoinositidi servono da siti di attracco per due serina/treonina chinasi contenenti domini PH (domini di omologia alla pleckstrina) -AKT (detta anche proteina chinasi B o PKB) e PDK1 (proteina chinasi 1 dipendente da fosfoinositidi) che sono portate vicino alla membrana plasmatica. La fosforilazione e l’attivazione di AKT dipendono da PDK1, ma anche da una terza serina/treonina

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chinasi chiamata mTOR. AKT attivata si dissocia così dalla membrana plasmatica e fosforila diverse proteine bersaglio, tra cui la proteina Bad, che, nel suo stato non fosforilato, promuove la morte cellulare mediante apoptosi (Figura 7B)

Figura 7. Principali vie di trasduzione del segnale dipendenti dall’attivazione di EGFR. (A) Via di trasduzione del segnale delle MAP chinasi. (B) Via di trasduzione del segnale PI3K-AKT-mTOR. (C) Via di trasduzione del segnale Jak-Stat. (Tratto da: Palmirotta R et al. Recenti Prog Med. 2016; 107:652-672).

Una volta attivata, la trasduzione del segnale permane finché è presente l’interazione fra recettore e ligando e cessa con l’inattivazione del recettore, che può avvenire in maniera transitoria, per defosforilazione da parte di specifiche tiroxina-fosfatasi, oppure in maniera definitiva con l’internalizzazione mediante endocitosi del complesso recettore-ligando nei lisosomi e successiva degradazione. I recettori e le proteine implicati nella via di trasduzione del segnale di EGF, se mutati possono essere caratterizzati da un persistente stato di attivazione, anche in assenza del legame con il fattore di crescita; ciò

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fa sì che vengano inviati continui segnali mitotici alla cellula. Queste vie, se alterate, portano ad una serie di cambiamenti biochimici che possono favorire la proliferazione cellulare aumentando la probabilità di formazione del tumore e di conseguenza favorendo l’invasione dei tessuti con generazione di metastasi grazie alla capacità angiogenica.

Infatti, nei tessuti normali l’espressione e la funzione del recettore EGFR sono finemente regolate. Un’alterazione della regolazione dell’attività del recettore può determinare una modificazione dell’equilibro tra processi di crescita / morte cellulare con sbilanciamento a favore dell’iperproliferazione cellulare che può rappresentare quindi l’input allo sviluppo di tumori35. L’iperattivazione del recettore è strettamente connessa ad un’eccessiva produzione del ligando o del recettore (iperespressione) o alla presenza di mutazioni che ne determinano un’attivazione costitutiva35. Una aumentata espressione di EGFR è stata osservata in diversi tipi di cancro, tra cui la mammella, il colon, il polmone e la prostata, che ha portato allo sviluppo di molecole mirate contro EGFR36.

Le mutazioni a carico del gene EGFR in pazienti affetti da NSCLC sono state caratterizzate nel 2004 e, ad oggi, rappresentano l’esempio maggiormente studiato di alterazioni oncogeniche, con una prognosi più favorevole rispetto ai tumori EGFR wild type36. Tra le principali mutazioni identificate nel gene EGFR, ci sono quelle localizzate a carico di quattro esoni (18-21), che codificano una porzione del dominio tirosin chinasico (l’intero dominio chinasi è codificato dagli esoni 18-24), e sono raggruppate attorno alla tasca di legame per l’ATP (Figura 8)37.

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Figura 8: Le principali mutazioni identificate nel gene EGFR. (Tratto da: Sharma SV et al. Nat Rev Cancer. 2007;7(3):169-181).

Ad oggi, è noto che le mutazioni nel gene EGFR sono presenti in circa il 15-20% dei pazienti NSCLC in stadio avanzato con istotipo adenocarcinoma e che queste mutazioni si verificano negli esoni 18-21 codificanti il dominio tirosin-chinasico. Nel tumore NSCLC, tali mutazioni sono presenti in circa il 15% della popolazione Caucasica ed in circa il 40% della popolazione Asiatica, con una frequenza più elevata nelle pazienti donne non fumatrici e con diagnosi di adenocarcinoma38. In particolare, tra queste alterazioni genomiche, quelle maggiormente caratterizzate sono le cosiddette mutazioni attivanti, in quanto sembrano essere implicate in un aumento dell’attività tirosin-chinasica del recettore. Le principali sono:

➢ le delezioni” in-frame” nell’esone 19 (circa 45%) intorno ai residui aminoacidici 747-750;

➢ la mutazione puntiforme p.L858R nell’esone 21 (40-45%) che vede la sostituzione della leucina in posizione 858 con l’arginina;

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➢ altre mutazioni meno comuni localizzate in altri esoni: inserzioni “in-frame” nell’esone 20, mutazione puntiforme p.L861Q nell’esone 21 (sostituzione della leucina in posizione 861 con la glutammina), mutazione puntiforme p.G719X nell’esone 18 (sostituzione della glicina con un altro aminoacido, come la cisteina o la serina) e mutazione puntiforme p.S768I nell’esone 20 (sostituzione della serina con l’isoleucina). Queste mutazioni costituiscono circa il 5% della casistica37. Le mutazioni attivanti di EGFR rappresentano un determinante biologico critico per la scelta della terapia appropriata nei pazienti con tumore del polmone; infatti, esse si sono rivelate essere il più importante fattore predittivo di risposta ai farmaci biologici, quali gli inibitori tirosin chinasici dell'EGFR (EGFR-TKI). Tali alterazioni geniche modificano il sito di legame per l’ATP del recettore, aumentandone l’affinità per i EGFR-TKIs a discapito dell’ATP37. La mutazione clinicamente più rilevante nell’esone 20 è la p.T790M, che, a differenza delle precedenti sostituzioni amminoacidiche, viene definita mutazione di resistenza, in quanto implicata nella mancata risposta ai farmaci EGFR-TKIs. Tale alterazione genomica si verifica in circa il 50% dei casi trattati con EGFR-TKIs37. Si tratta di una mutazione puntiforme che consiste nella sostituzione della treonina con una metionina in posizione 790 nell'esone 20. La treonina 790 viene chiamata residuo “gatekeeper”, a causa della sua posizione all’ingresso della tasca idrofobica nella parte posteriore al sito di legame dell’ATP, rendendola un importante determinante della specificità degli inibitori delle proteine chinasi. La sua sostituzione con un residuo di metionina, molto più voluminoso, crea un ingombro sterico che interferisce nel legame dei EGFR-TKIs, portando al blocco dell'azione dei suddetti farmaci. La p.T790M aumenta l’affinità dell’ATP per il dominio tirosin-chinasico di EGFR, portando di conseguenza ad un calo del legame dei EGFR-TKIs39.

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Per tali motivi, sono state sviluppate due strategie terapeutiche per inibire l’EGFR, utilizzando farmaci biologici (Figura 9):

➢ Cetuximab e panitunumab, anticorpi monoclonali (mABS) che colpiscono il dominio extracellulare del recettore, bloccando di conseguenza il sito di legame con il ligando ed inducendo di conseguenza inibizione;

➢ EGFR-TKI che determinano il blocco dell’attivazione dell’EGFR mediante l’impiego di piccole molecole, quali gefitinib, erlotinib, afatinib ed osimertinib, in grado di legarsi alla tirosin chinasi del recettore, che è l’enzima responsabile della trasduzione del segnale post recettoriale all’interno della cellula (Figura 10).

Figura 9: Meccanismo d'azione dei farmaci anti-EGFR. (Tratto da: Ciardiello F et al. N Engl J Med. 2008; 358:1160-1174).

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Figura 10: Struttura dei TKIs. EGFR-TKIs reversibile di 1° generazione (A)

Gefitinib (Iressa) e (B) Erlotinib (Tarceva); (C) inibitore irreversibile di 2° generazione di EGFR e HER2 Afatinib (Gilotrif); (D) EGFR-TKI di 3° generazione Osimertinib (AZD9291) specifica per la mutazione p.T790M sul gene EGFR.

In particolare, i pazienti affetti da NSCLC vengono trattati con EGFR-TKIs in presenza delle specifiche mutazioni che determinano un’attivazione costitutiva dell’EGFR. Questi farmaci biologici agiscono come inibitori competitivi del legame dell'ATP con il sito attivo chinasico di EGFR, impedendo la fosforilazione continua e quindi la trasduzione del segnale a valle. Le mutazioni attivanti nel dominio tirosin-chinasico (esoni 18-21) del gene di EGFR sono predittive di una risposta favorevole a tali farmaci e sono associate ad una buona prognosi. Tali alterazioni geniche modificano il sito di legame per l’ATP del recettore, aumentandone l’affinità per i TKIs a discapito dell’ATP (Figura 11).

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Figura 11: Meccanismi di attivazione costitutiva del recettore EGFR in presenza delle

mutazioni attivanti a carico del gene EGFR e sua inibizione attraverso TKIs. (Tratto da: Jorge SE

et al. Braz J Med Biol Res. 2014; 47:929-939).

Altri fattori predittivi di risposta sono il genere femminile, l'etnia asiatica e lo stato di non-fumatori40. Pazienti con mutazioni di EGFR vengono sottoposti ad una prima linea di trattamento con gefitinib (o erlotinib o afatinib). Qualora avessero già iniziato la chemioterapia prima di aver identificato la mutazione, si deve interrompere o affiancare a gefitinib (o erlotinib o afatinib). In caso di progressione della malattia si procede con un ulteriore trattamento con EGFR-TKI: gefitinib o erlotinib o afatinib (NCCN Guidelines

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Version 5.201716). Gli studi clinici quali IPASS, OPTIMAL, EURTAC, LUX-Lung 3 e 6 hanno confermato la netta superiorità dei farmaci TKIs rispetto alla chemioterapia standard a base di platino nei pazienti con mutazioni di EGFR41-44. Inoltre, questi nuovi farmaci presentano un profilo di tossicità più tollerabile, caratterizzato in prevalenza da diarrea e rash cutaneo, rispetto ad una chemioterapia standard41-44.

In conclusione, molti trials di fase III hanno stabilito che l’utilizzo di farmaci EGFR-TKI nel trattamento di prima linea nei pazienti NSCLC con mutazione attivanti a livello del gene

EGFR determinava una maggiore efficacia, minore tossicità e migliore qualità di vita

rispetto all’utilizzo della chemioterapia standard citotossica42,43,45-49. In seguito a questi incoraggianti risultati, le linee guida raccomandano l'uso in prima linea di EGFR-TKI (gefitinib, erlotinib o afatinib) nei pazienti con mutazioni attivanti in EGFR. Gli studi LUX-Lung hanno fornito dati prospettici in seguito all’utilizzo di afatinib nei pazienti con mutazioni rare, tra cui le mutazioni sull’esone 18 di EGFR; i risultati hanno suggerito differenze di efficacia a seconda delle tipologie di mutazioni in EGFR50. L’utilizzo di afatinib determina un miglioramento in termini di sopravvivenza globale rispetto alla chemioterapia citotossica nei pazienti precedentemente non trattati che presentavano delezioni a livello dell’esone 19 di EGFR; tuttavia questo effetto non è stato riscontrato in pazienti che presentavano la mutazione puntiforme p.L858Q nell’esone 21 di EGFR50. Diversi studi di confronto tra i farmaci EGFR-TKI sono attualmente in corso per identificare quale farmaco tra questi sia il più efficace. Tuttavia i risultati ottenuti dallo studio LUX-Lung 7 di fase IIb hanno mostrato una maggiore sopravvivenza mediana libera da progressione con afatinib rispetto all’utilizzo con gefitinib in pazienti NSCLC positivi per mutazione nel gene EGFR (11.0 mesi con afatinib vs 10.9 mesi con gefitinib; hazard ratio [HR] 0.73 [95% CI 0.57-0.95]; p = 0.017) mentre i dati di sopravvivenza globale non sono ancora stati presentati51. Pertanto, la scelta dell'agente dovrebbe essere basata su fattori

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quali “performance status”, accesso alle terapie ed eventi avversi del paziente (ad esempio, la tossicità epatica è più frequente con gefitinib, mentre diarrea e tossicità cutanea sono più frequenti con afatinib)45. Per aumentare l’efficacia degli EGFR-TKI, alcuni studi hanno investigato l’uso terapeutico combinato di essi con farmaci citotossici o con bevacizumab52,53. L’utilizzo combinato di erlotinib e bevacizumab ha migliorato significativamente la sopravvivenza libera da progressione rispetto alla sola terapia con erlotinib in pazienti con NSCLC positivi per mutazione su EGFR (16.0 mesi con erlotinib più bevacizumab vs 9.7 mesi con il solo erlotinib; HR 0.54 [95% IC 0.36-0.79]; p = 0.0015)53; tale risultato ha portato all'approvazione di questa combinazione da parte dell’Agenzia Europea per i Medicinali (EMA). Pazienti con NSCLC che presentano la rara mutazione rappresentata dall’inserzione nell’esone 20 di EGFR (presente nel 4-9% dei pazienti NSCLC positivi per mutazioni) sono intrinsecamente insensibili a tutti gli inibitori EGFR-TKI clinicamente disponibili; tuttavia, un nuovo agente, EGF816, (Novartis, Basel) ha mostrato efficacia in modelli sperimentali54. Sebbene alcuni pazienti rimangano stabili per molti anni con monoterapia con EGFR-TKI, quasi tutti alla fine vanno incontro a progressione della malattia a causa dell’acquisizione di resistenza al trattamento. Risultati di uno studio

in vitro hanno dimostrato che la resistenza acquisita si sviluppa attraverso la selezione di

cloni pre-esistenti resistenti e attraverso l'acquisizione di resistenza “de-novo” durante il trattamento55. Poiché il meccanismo di resistenza acquisita più frequente è la comparsa di una mutazione secondaria su EGFR (mutazione p.T790M che si verifica nel 50-65% dei campioni ri-biopsiati dopo lo sviluppo di resistenza acquisita)56,57, sono stati sviluppati un gruppo di EGFR-TKI, cosiddetti di terza generazione. Osimertinib, l'agente principale in questa classe, ha prodotto una risposta globale nel 61% dei pazienti ed una mediana di sopravvivenza libera da progressione di 9.6 mesi, quando somministrato a pazienti con mutazione p.T790M che erano progrediti dopo la terapia precedente con EGFR-TKI58. In

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seguito a questo risultato, il farmaco è stato approvato dalla FDA, EMA ed in Giappone come opzione di trattamento in pazienti NSCLC positivi per la p.T790M. Il farmaco EGFR-TKI osimertinib ha anche dimostrato di riuscire a passare la barriera emato-encefalica e risulta quindi efficace anche nel trattamento di metastasi nel sistema nervoso centrale59. Altri EGFR-TKI di terza generazione, come ad esempio olmutinib (BI 1.482.694 / HM61713, Boehringer Ingelheim, Ingelheim am Rhein), ASP8273 (Astellas Pharma, Tokyo), EGF816 (Novartis, Basilea), e PF-06.747.775 (Pfizer; Nuovo York), sono in corso di valutazione nell’ambito della sperimentazione clinica60. L’uso di EGFR-TKI di terza generazione nel trattamento in prima linea, per prevenire o ritardare la comparsa della mutazione di resistenza p.T790M, dovrebbe essere presa in considerazione. Infatti, dati provenienti da due studi di fase I nella coorte di pazienti dello studio AURA hanno mostrato una maggiore sopravvivenza libera da progressione (19.3 mesi con la dose di 160 mg) con osimertinib durante il trattamento in prima linea di pazienti NSCLC in stadio avanzato e positivi per la p.T790M61. Tuttavia, non è ancora chiaro se il trattamento in prima linea con osimertinib fornisce una maggiore sopravvivenza globale rispetto al trattamento di prima linea con EGFR-TKI di prima o seconda generazione seguita dalla seconda linea con osimertinib. Una comparsa di resistenza acquisita è stata segnalata anche per EGFR-TKI di terza generazione. La mutazione p.C797S sull’esone 20 di EGFR è uno dei meccanismi comuni di resistenza ai farmaci EGFR-TKI di terza generazione62. Infatti, nello studio pubblicato nel 2015 da Thress et al, gli autori hanno dimostrato che in circa il 40% dei pazienti con NSCLC in stadio avanzato il cui tumore aveva sviluppato resistenza all’inibitore EGFR-TKI di terza generazione acquisivano una nuova mutazione denominata p.C797S sul dominio tirosin chinasico di EGFR pur mantenendo la p.T790M62. Altri studi hanno identificato ulteriori meccanismi di resistenza indipendenti da EGFR, tra cui l’attivazione di “pathway” alternative quali ad esempio l’amplificazione di MET o

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HER2, attivazione di AXL, o variazioni fenotipiche, come trasformazione in carcinoma

squamoso e transizione epitelio-mesenchimale, che possono verificarsi contro tutti i farmaci EGFR-TKI63-67.

Inoltre, la presenza di mutazioni nel gene KRAS è associata ad una resistenza intrinseca agli EGFR-TKIs, per cui il loro rilevamento potrebbe essere usato per la selezione di pazienti come candidati per la terapia con EGFR-TKI. Infatti, le mutazioni nel gene KRAS sono le alterazioni “driver” più comuni nel cancro del polmone e si trovano spesso in pazienti con adenocarcinoma (25%), in particolare nei soggetti fumatori e di etnia non asiatica68. Inoltre, la presenza di mutazioni in KRAS è solitamente mutualmente esclusiva con mutazioni in EGFR o ALK69.

4.2 KRAS

Il proto-oncogene KRAS codifica per una proteina legante la guanina trifosfato (GTP) che gioca un ruolo centrale come mediatore di una via di trasduzione del segnale a valle di recettori di crescita e per tale motivo la sua presenza è cruciale per la proliferazione, la sopravvivenza e la differenziazione cellulare. Questa via, se alterata, porta ad una serie di cambiamenti biochimici che possono favorire la proliferazione cellulare, aumentando quindi la probabilità di formazione del tumore, la sua capacità di invadere i tessuti e dare metastasi, nonché la sua capacità angiogenica. Mutazioni in KRAS sono presenti in circa il 15-25% degli adenocarcinomi. Nella maggior parte dei casi, queste mutazioni sono state trovate nei tumori EGFR-wild type; pertanto, le mutazioni EGFR e KRAS sono normalmente mutuamente esclusive. Tuttavia la presenza di mutazioni a carico del gene

KRAS causa una resistenza intrinseca agli EGFR-TKIs. Lo sviluppo di terapie rivolte verso

alterazioni in KRAS è stato notevolmente frustrante, nonostante molti candidati terapeutici siano stati identificati in analisi in vitro. Selumetinib, un inibitore di MEK1 /

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MEK2, è stato studiato in combinazione con docetaxel in seconda linea in pazienti NSCLC in stadio avanzato positivi in uno studio di fase II vs solo docetaxel70. L'aggiunta di selumetinib a docetaxel ha migliorato la sopravvivenza libera da progressione in tali pazienti (5.3 mesi con selumetinib più docetaxel vs 2.1 mesi con placebo più docetaxel; HR 0.58 [80% CI 0.42-0. 79]; p = 0.014)70. Tuttavia, si sono verificati eventi avversi di grado 3 o superiore nell'82% dei pazienti nel braccio con selumetinib. Inoltre, la valutazione dell'attività clinica di inibitori di MEK (trametinib e selumetinib) attende i risultati di trials di fase III. Ci sono molti tipi diversi di mutazioni di KRAS che potrebbero attivare differenti vie di segnalazione a valle. Un inibitore specifico per la mutazione p.Gly12Cys di KRAS è in fase di sviluppo e ha mostrato un certo potenziale71. Test genetici che permettano di identificare la presenza di mutazioni nel gene KRAS risultano quindi importanti per identificare pazienti che potrebbero non beneficiare di EGFR-TKI in pazienti EGFR positivi ed evitare così ulteriori test diagnostici molecolari (NCCN Guidelines Version 5.201716) 72.

4.3 ALK

Un altro proto-oncogene che codifica per un recettore tirosina chinasi transmembrana è il gene ALK. Fisiologicamente, contribuisce allo sviluppo del sistema nervoso embrionale e la sua espressione decresce dopo la nascita, dove risulta debolmente presente nelle cellule nervose ed endoteliali. A livello cellulare, ALK regola le vie del segnale canoniche che sono condivise con altri recettori tirosina chinasi, sostenendo processi quali la proliferazione e la sopravvivenza cellulare. I riarrangiamenti a carico del gene ALK sono un altro esempio scoperto recentemente di alterazioni “driver” in alcuni tipi di tumore. Negli NSCLC, l’attivazione della segnalazione di ALK avviene in seguito alla fusione oncogenica fra il gene ALK e vari geni partner, dando così origine a proteine di fusione. In particolare, il riarrangiamento EML4 (echinoderm microtubule-associated protein-like4) - ALK gioca

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un ruolo fondamentale nello sviluppo del tumore polmonare in circa il 3-5% dei pazienti con NSCLC. La fusione EML4-ALK risulta da un’inversione a livello del braccio corto del cromosoma 2, che fonde porzioni differenti del gene EML4 con una porzione del gene

ALK. Infatti, sono state caratterizzate almeno 9 differenti varianti di fusione EML4-ALK

negli NSCLC (Figura 12). Tale riarrangiamento genera una chinasi chimerica costitutivamente attiva. La traslocazione di ALK si presenta più comunemente in un sottoinsieme di pazienti non fumatori, di giovane età e con diagnosi di adenocarcinoma73 -76. Altri partner di fusione di ALK sono TFG e KIF5B74,75.

Figura 12: (A) Distribuzione delle diverse varianti del gene di fusione di EML4-ALK descritte

fino ad oggi. (B) Frequenza delle diverse varianti EML4-ALK nel NSCLC. (Tratto da: Morán T

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I risultati di due studi randomizzati di fase III che hanno confrontato crizotinib, un inibitore delle tirosine chinasi di ALK, MET e ROS1, rispetto alla chemioterapia standard, come prima linea o seconda linea di trattamento nei pazienti con tumore del polmone

ALK-positivi, hanno mostrato una maggiore sopravvivenza libera da progressione nel

gruppo crizotinib, portando all’approvazione del farmaco da parte del FDA, EMA ed in Giappone sia in prima che in seconda linea77,78. Tuttavia, l'acquisizione di resistenza al crizotinib è inevitabile nei pazienti con NSCLC che presentano un gene di fusione di ALK. Uno dei principali meccanismi di resistenza è l’acquisizione di una mutazione secondaria nel gene ALK; molte mutazioni resistenti sono stati identificate ad oggi (1151Tins, L1152R, C1156Y, I1171T, F1174L, V1180L, L1196M, G1202R, S1206Y e G1296A)79.

Per superare queste mutazioni secondarie, sono stati sviluppati diversi inibitori di nuova generazione contro ALK. Questi agenti, tra cui ceritinib, alectinib, brigatinib (AP26113, ARIAD; Cambridge), X-396 (Xcovery, Palm Beach Gardens) e lorlatinib (PF-06.463.922, Pfizer; New York), hanno diversi vantaggi potenziali rispetto a crizotinib tra cui una maggiore specificità (ad esempio, non inibiscono i geni MET e ROS1), una maggiore sensibilità, maggiore capacità di attraversare la barriera emato-encefalica e differenti spettri di attività contro mutazioni di resistenza al crizotinib79-87. Tutti questi agenti furono inizialmente valutati in pazienti con progressione di malattia in seguito a trattamento con crizotinib mostrando una elevata attività in questa popolazione con una risposta in almeno il 39% dei pazienti ed una mediana di sopravvivenza libera da progressione di circa 5.7 mesi (Tabella 3). Questi dati hanno portato alla approvazione da parte della FDA di ceritinib ed alectinib per l'uso in seguito a progressione con crizotinib (l'EMA ha approvato ceritinib mentre alectinib è stato approvato in Giappone). Entrambi questi farmaci hanno inoltre riportato risposte in pazienti con metastasi cerebrali o metastasi leptomeningee. Questi agenti orali sono ben tollerati ed i principali effetti indesiderati

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sono gastrointestinali ed anomalie sulla funzionalità epatica. I risultati di un trial di fase II sull’utilizzo di brigatinib in pazienti con NSCLC ALK-positivi sono stati aggiornati nel 2016; i ricercatori hanno riportato una risposta globale nel 72% dei pazienti (95% CI 60-82%), una sopravvivenza mediana libera da progressione di 13.2 mesi (95% CI 9.2 non raggiunto) ed attività sul sistema nervoso centrale88. La tossicità con brigatinib è stata lieve e consisteva principalmente in anomalie nella funzionalità gastrointestinale ed epatica. Esistono pochi dati circa l'uso di inibitori di ALK in prima linea. In un trial di fase II sull’uso di alectinib in prima linea, i ricercatori in Giappone hanno riportato una risposta globale nel 93% dei pazienti ed una sopravvivenza mediana libera da progressione di più di 29 mesi; la sopravvivenza globale mediana al momento non è stata raggiunta89. Questi risultati incoraggianti hanno portato a due studi randomizzati di fase III confrontando alectinib con crizotinib come trattamento in prima linea. Nel primo di questi studi, che è stato fatto in Giappone (trial J-ALEX), le proporzioni di pazienti che hanno raggiunto una risposta o una risposta del sistema nervoso centrale sono stati significativamente più alti nel gruppo alectinib rispetto al gruppo crizotinib (risposta globale di 76.7% (95% CI 68.5-84.9) nei pazienti nel gruppo alectinib vs 68.9% (60.0-77.9) dei pazienti nel gruppo crizotinib); inoltre, la sopravvivenza libera da progressione è stata significativamente più elevata con alectinib rispetto che con crizotinib (> 24 mesi vs 10.2 mesi, HR 0.34; 99.68% CI 0.17-0.70, p < 0.0001)82. Un secondo studio randomizzato (ALEX) con un disegno simile è stato completato, ma i risultati non sono ancora stati riportati. I primi risultati con brigatinib come trattamento di prima linea sono incoraggianti ed uno studio randomizzato che confronta brigatinib contro crizotinib è in corso. Tuttavia, prima di determinare se questi nuovi inibitori di ALK possano essere usati in prima linea o in seconda linea di trattamento dopo che i pazienti acquisiscono resistenza a crizotinib, è necessario attendere i dati completi e pubblicati per includere la sopravvivenza globale, i tassi e l'esito sulle

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metastasi del sistema nervoso centrale, la sopravvivenza libera da progressione, la percentuale di pazienti che hanno raggiunto la risposta e la tossicità. Dal momento che queste terapie non sono curative, lo sviluppo di combinazioni razionali è tanto importante per gli inibitori della tirosina chinasi ALK come lo è per gli inibitori tirosina chinasi di EGFR. Un meccanismo comunemente riferito alla resistenza è la riattivazione della “pathway” RAS e quindi l’uso di combinazioni di inibitori delle tirosine chinasi di ALK e MEK potrebbe essere utile90. I farmaci diretti contro ALK e le loro fasi di sviluppo sono riportate in Tabella 4. Trattamento precedente con crizotinib Numero di pazienti Percentuale con risposta totale (%) Progressione libera da malattia (mesi) Risposta totale sul sistema nervoso centrale (%) CERITINIB Kim et al (2016)80 Si 163 55% 6.9 Si (50%) Mok et al (2015)91 Si 140 39% 5.7 Si (30%) Felip et al (2015)92 No 124 64% 11.1 Si (58%) ALECTINIB Ou et al (2016)81 Si 122 45% 8.9 Si (57%) Nokihara et al (2016)82 No 103 88% >21 Si Seto et al (2013)83 No 46 94% >29 Si BRIGATINIB (AP26113) Langer et al (2016)88 Si 71 72% 13.2 Si (53%) Langer et al (2016)88 No 8 100% >24 NR LORLATINIB (PF-06463922) Shaw et al (2015)85 Si 34 NR NR Si (36%) Solomon et al (2016)84 Si 52 50% NR Si (44%)

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Target Farmaco Stato

ALK

Crizotinib Approvato

Alectinib Approvato

Ceritinib Approvato

Lorlatinib (PF-06463922) Fase 2

Brigatinib (AP26113) Fase 3

X-396 Fase 3

TSR-011 Fase 2

Entrectinib Fase 2

Tabella 4: Fasi di sviluppo di farmaci diretti contro ALK.

4.4 ROS1

Il gene ROS1 codifica per un recettore tirosina chinasi appartenente alla famiglia dei recettori insulinici. Approssimativamente, in circa l’1-2% dei pazienti con NSCLC riarrangiamenti cromosomici sono stati identificati fra il gene ROS1 ed i geni CD74,

SLC34A2/NaPi2b e FIG, con la formazione di prodotti di fusione che portano ad una

protratta attivazione del recettore tirosin-chinasi, che sembra essere fra le alterazioni “driver” caratterizzanti il processo di genesi e sviluppo del tumore polmonare (Figura 13A-B). I pazienti che presentano riarrangiamenti a carico del gene ROS1 sono giovani, spesso non fumatori e con caratteristiche cliniche simili ai pazienti NSCLC-ALK-positivi93. Ad oggi, 14 partner di fusione sono stati identificati nel NSCLC94. Crizotinib è stato recentemente approvato dalla FDA per i pazienti ROS1-positivi con NSCLC. Dei 50 pazienti, che sono stati in gran parte pre-trattati con chemioterapia, il 72% ha risposto a crizotinib, con una mediana di sopravvivenza libera da progressione di 19.2 mesi95. Uno studio retrospettivo europeo su 31 pazienti ha riportato risultati simili, anche se la sopravvivenza mediana libera da progressione è stata inferiore a 9.1 mesi96. Molti altri inibitori di ROS1 sono attualmente in corso di valutazione, tra cui ceritinib, cabozantinib,

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entrectinib (RxDx-101, Ignyta; San Diego) e lorlatinib. Uno studio su un caso di un paziente con NSCLC traslocato in ROS1 ha riportato che ceritinib mostrava un’attività antitumorale dopo progressione con crizotinib97. Ad oggi diversi trial sono in corso con l’utilizzo di farmaci diretti contro ROS1 (Tabella 5).

Figura 13A. Rappresentazione delle fusioni di ROS1 nel NSCLC in cui in grigio scuro

viene rappresentato il dominio tirosin chinasico (dominio TKI; grigio chiaro), in grigio medio il dominio transmembrana (TM; grigio medio) ed in grigio chiaro i domini coiled-coil (CC, grigio chiaro) di ROS1 (KDELR2-ROS1 non è mostrato). (Tratto da: Bubendorf L.

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Figura 13B. Frequenze dei diversi partner di fusione di ROS1. (Tratto

da: Bubendorf L. et al. Virchows Arch. 2016; 469:489-503).

TARGET AGENTE INVESTIGATO ID NUMERO

DEL TRIAL FASE

ROS1

Lorlatinib (PF-06463922) NCT01970865 I/II

Ceritinib (LDK378, SIGNATUREstudy) NCT02186821 II

Cabozantinib NCT01639508 II

Entrectinib (RXDX-101, STARTRK-1 study) NCT02097810 I

Entrectinib (RXDX-101, STARTRK-2 study) NCT02568267 II

Crizotinib (METROS study – Pretreated, metastatic) NCT02499614 II

Crizotinib (EUCROSS study – First line Europe) NCT02183870 II

Crizotinib (AcSè study – Safety Study) NCT02034981 II

Tabella 5: Trials clinici dei farmaci bersaglio di ROS1.

4.5 RET

Il proto-oncogene RET codifica per un recettore tirosina chinasi che lega il fattore neurotrofico di derivazione gliale e proteine simili, con la conseguente attivazione di un sistema intracellulare che promuove la sopravvivenza cellulare durante lo sviluppo

figura

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