ID PAZIENTE TRASLOCAZIONE VALUTATA MEDIANTE FISH

1 ALK positivo

2 ALK positivo

3 ALK positivo

4 ALK positivo

5 ALK positivo

CTRL Negativo ALK-RET-ROS1 negativo

CTRL Positivo (Lot.RD14110301) ?

9.1.2 Estrazione RNA, controllo di qualità dell’RNA e retrotrascrizione in cDNA

L’RNA dei tessuti FFPE è stato isolato mediante l’utilizzo del kit “RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit” (ThermoFisher Scientific, Wilmington, DE, USA) seguendo il manuale d’istruzione del kit. L’RNA è stato estratto per ciascun campione partendo da una sezione di 10 μm. In particolare la procedura prevede i seguenti step (vedi Figura 30): - Aggiunta di 1 mL di xylene alla provetta contenenti le sezioni del tessuto tumorale FFPE,

vortex e centrifugare brevemente; - Incubare 50°C per 3 minuti;

100

- Rimuovere lo xylene senza disturbare il pellet sul fondo della provetta; - Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto (100%) alla provetta e vortex; - Centrifugare provetta per 2 minuti alla massima velocità a Ta; - Rimuovere etanolo dalla provetta senza disturbare il pellet;

- Aggiungere alla provetta 1 mL di etanolo assoluto (100%) alla provetta e vortex; - Centrifugare provetta per 2 minuti alla massima velocità a Ta;

- Rimuovere etanolo dalla provetta senza disturbare il pellet;

- Ricentrifugare la provetta brevemente alla massima velocità a Ta per rimuovere eventuale etanolo;

- Asciugare il pellet mettendo provetta in speedvac a 37-40 °C per 15 minuti; - Aggiungere 100 µL di Digestion Buffer e 4 µL di Protease (presenti nel Kit); - Vortex campione gentilmente e centrifugare brevemente;

- Incubare a 50°C in un fornetto tutta la notte (O/N) il campione; - Incubare il campione a 80°C per 12 minuti;

- Aggiungere al campione ( ̴100 µL di volume) 120 µL di Isolation Additive (contenuto nel kit) e 275 µL di etanolo al 100%;

- Pipettare gentilmente e trasferire 700 µL del campione sul filtro della colonnina fornita nel kit;

- Centrifugare a Ta la colonnina a 10 000 rpm per 30 secondi; - Scartare il flow-trought e riutilizzare stesso collection tube;

- Aggiungere 700 µL di Wash 1 (contenuto nel kit) sul filtro della colonnina, centrifugare a Ta per 30 secondi a 10 000 rpm;

- Scartare il flow-trought e riutilizzare stesso collection tube;

- Aggiungere 500 µL di Wash 2/3 (contenuto nel kit) sul filtro della colonnina, centrifugare a Ta per 30 secondi a 10 000 rpm;

101

- Scartare il flow-trought e riutilizzare stesso collection tube;

- Aggiungere sul filtro della colonnina 60 µL di mix (10 x DNase Buffer + 50 µL di H20)

- Incubare 30 minuti a Ta;

- Aggiungere 700 µL di Wash 1 (contenuto nel kit) sul filtro della colonnina; - Incubare 1 minuto a Ta;

- Centrifugare a Ta 30 secondi a 10 000 rpm, scartare il flow-trought e riutilizzare stesso collection tube;

- Aggiungere 500 µL di Wash 2/3 (contenuto nel kit) sul filtro della colonnina, centrifugare a Ta per 30 secondi a 10 000 rpm;

- Scartare il flow-trought e riutilizzare stesso collection tube;

- Aggiungere 500 µL di Wash 2/3 (contenuto nel kit) sul filtro della colonnina, centrifugare a Ta per 30 secondi a 10 000 rpm;

- Scartare il flow-trought e trasferire il filtro in un nuovo collection tube (contenuto nel kit) - Ri-centrifugare a Ta per 1 minuto a 10 000 rpm per togliere liquido residuo dal filtro

della colonnina;

- Trasferire il filtro in una nuova provetta;

- Aggiungere 60 µL di H20 al filtro della colonnina;

- Incubare a Ta per 1 minuto;

- Centrifugare a Ta alla massima velocità per 1 minuto, eliminare filtro della colonnina e tenere eluato presente nella provetta.

102

Figura 30: Overview della procedura di

estrazione dell’RNA da tessuto FFPE.

La quantità dell’RNA di tutti i campioni è stata misurata mediante valutazione di 2 µL di RNA estratto utilizzando il “Qubit® 2.0 Fluorometer” (Invitrogen) ed il kit “Qubit® RNA BR Assay Kit” (Invitrogen). La qualità/purezza dell’RNA, intesa come assenza di contaminanti, è stata valutata utilizzando lo spettrofotometro “NanoDrop ND-1000” (ThermoFisher Scientific) per misurare l'intero spettro di assorbimento (220-750 nm) e calcolare il

103

rapporto di assorbanza sia a 260/280 che a 260/230. Infine, lo stato di frammentazione dell’RNA (RIN) e la concentrazione ottenuta è stata valutata mediante lo strumento “2200 TapeStation” utilizzando il kit "RNA ScreenTape®" (Agilent Technologies).

Infine, l’RNA estratto da ciascun campione è stato retrotrascritto in cDNA mediante il kit “Superscript VILO cDNA Synthesis Kit” (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). In particolare, 2 µL di RNA (ovvero 12 ng totali di RNA estratto) sono stati denaturati a 80°C per 10 minuti e retrotrascritti aggiungendo la mix di reazione come riportato in Figura 31.

Figura 31: Mix di reazione della retrotrascrizione dell’RNA in cDNA.

9.1.3 NGS del cDNA

Tutti i campioni di cDNA sono stati amplificati (preparazione delle “libraries”) utilizzando il pannello “Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Lung Cancer Research Panel” (ThermoFisher Scientific) che permette di identificare più di 70 trascritti di fusione che coinvolgono i geni ALK, RET, ROS1 e NTRK1 conosciuti per essere implicati nel carcinoma polmonare. Le “libraries” sono state preparate utilizzando il kit “Ion AmpliSeq™ Library Kits 2.0” (ThermoFisher Scientific) seguendo il manuale di istruzione della ditta (Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation; Publication Part Number MAN0006735; Revision B.0).

104

In particolare, per ogni reazione di amplificazione sono stati utilizzati campioni di cDNA ad una concentrazione di 1 ng/μL.

La prima fase consiste nell’allestire una PCR per il pool di primer utilizzando la seguente miscela di reazione:

• 5x Ion Ampliseq HiFi Master Mix: 4μL • 2x Ion Ampliseq Primer Pool: 4μL

• cDNA (1ng/ul): 10μL

• Acqua sterile: 2μL

• Volume finale: 20μL

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Il numero dei cicli è settato in base alle coppie di primer per pool e alla qualità dell’RNA utilizzato (FFPE RNA).

Gli ampliconi ottenuti in questa fase, vengono trattati con il reagente FuPa che digerisce e fosforila le estremità degli ampliconi. Al prodotto di PCR viene infatti aggiunto 2 μL del reagente FuPa. A questo punto avviene la reazione di ligazione che consiste nel legare alle estremità degli ampliconi generati, mediante la DNA ligasi, due adattori: P1 e A (che saranno necessari per la fase della PCR in emulsione). L’adattatore P1, è necessario per il legame dei singoli ampliconi alle sfere, mentre, l’adattatore A per il legame dei primer. Il sistema permette di assegnare a ciascun campione di DNA un codice identificativo o barcode (che è associato all’adattatore A) consentendo quindi l’analisi di più campioni in un’unica corsa di sequenziamento. La reazione di ligasi prevede che al prodotto di PCR venga aggiunta la seguente miscela di reazione:

• Switch Solution: 2μL

• Ion P1 Adapter (1μL) + Ion Xpress™ Barcode X (1μL): 2μL

• DNA Ligase: 2μL

• Prodotto di PCR: 22μL

• Volume finale: 28μL

A questo punto al prodotto viene effettuata la seguente reazione termica: TEMPERATURA TEMPO

22°C 30 minuti 72°C 60 minuti

10°C ~

La miscela di reazione contenente gli ampliconi è sottoposta a una fase di purificazione con le biglie “Agencourt® AMPure® XP reagent” (Beckman Coulter, Inc.), in grado di legare

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ampliconi con grandezza maggiori di 100bp, e tutto ciò che non si legherà alle biglie (primer, sali, nucleotidi, enzimi) sarà eliminato con due lavaggi in etanolo al 70%. Al termine della purificazione la “library” verrà eluita in 50 μL di buffer Low Te.

Quindi, la dimensione delle “libraries” sono state quantificate e valutate mediante gli strumenti “Qubit® 2.0 Fluorometer” (Invitrogen) e “2200 Tapestation” (Agilent Technologies). In particolare, le dimensioni degli ampliconi amplificati durante la preparazione delle “libraries” sono state verificate mediante strumento “2200 Tapestation” (Agilent Technologies), mentre la loro concentrazione è stata valutata mediante “Qubit® 2.0 Fluorometer” utilizzando il kit “High sensitivity assay kit Qubit® dsDNA” (Invitrogen). Successivamente, ogni “library” è stata diluita con TE in maniera tale da ottenere una concentrazione di ~100pM. Le “libraries” diluite sono state combinate per poter essere sequenziate in un numero ridotto di chip e si è proceduto con la preparazione del templato. Il templato è stato ottenuto utilizzando il kit “Ion PGM Template OT2 200 KIT” (ThermoFisher Scientific) seguendo il manuale d’istruzione. Per la preparazione del templato è stato utilizzato lo strumento OneTouch™ (ThermoFisher Scientific) (Figura 24B) nel quale avviene la PCR in emulsione. Dopo il controllo della qualità del campione non arricchito mediante quantificazione con “Qubit® 2.0 Fluorometer” e kit “Ion Sphere Quality Control” (Invitrogen), si è proceduto con l’arricchimento del campione utilizzando lo strumento OneTouch™ ES (Figura 24A) (ThermoFisher Scientific) seguendo il manuale d’istruzione del kit “Ion PGM Template OT2 200 KIT” (ThermoFisher Scientific). Infine, il sequenziamento è stato eseguito sullo strumento Ion PGM (ThermoFisher Scientific) con il kit di sequenziamento “Ion PGM 200” (ThermoFisher Scientific), caricando i campioni barcodati su chip 314v.2 o 316v.2.

I dati di sequenziamento sono stati analizzati con l’Ion Torrent Software Suite v.4.2 (ThermoFisher Scientific) caricando i BAM files di ciascun campione sul software Ion

107

Reporter™ 4.2 impostato per l’analisi della presenza di fusioni usando l’applicazione “Fusions” e il “workflow” “AmpliSeq RNA Lung Fusion single sample”. Il software “IonReporter” è ottimizzato per l’analisi degli eventi di fusione mediante l’utilizzo del pannello “Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Lung Cancer Research Panel” (ThermoFisher Scientific) e riporta i risultati di 5 geni di controllo di espressione (MYC, LMNA, HMBS,

ITGB7 e TBP). I cinque geni di controllo di espressione sono incorporati nel pannello Ion

AmpliSeq™ per scopi di controllo di qualità. Se più geni di controllo di espressione vengono segnalati come assenti nella colonna “Detection” questo potrebbe indicare una corsa non riuscita o di bassa qualità. Inoltre, valori di sbilanciamento 3’/5’ dei 4 geni “driver” (ALK, RET, ROS1 e NTRK1) vengono riportati dal software. Questi ultimi misurano la differenza di espressione tra il 3' e il 5' di ciascun gene “driver”. I campioni che non contengono una fusione dovrebbero avere una simile espressione del 5'rispetto al 3' di ciascun gene “driver”, mentre i campioni che contengono una fusione sono spesso tenuti ad avere elevata espressione del 3'rispetto al 5’. Una fusione è presente se ci sono più di 20 “reads” che mappano su quel target.

9.2. RISULTATI

9.2.1 Controllo di qualità e quantità degli RNA ottenuti dai campioni FFPE

Gli RNA estratti dai tessuti FFPE hanno riportato una purezza molto elevata, ovvero assenza di contaminanti, riportando valori per i rapporti 260/280 maggiori di 1.7 mediante lettura allo spettrofotometro “NanoDrop ND-1000” (ThermoFisher Scientific). Nessuna invece correlazione tra i rapporti 260/230 e le prestazioni di sequenziamento sono stati indicati dalla ditta TermoFisher Scientific, mentre i rapporti 260/280 dovevano essere maggiori di 1.6.

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Per valutare lo stato di degradazione degli RNA tutti i campioni sono stati valutati mediante “2200 TapeStation” (Agilent Technologies) presentando RIN maggiori di 1.8. Inoltre, la quantità dell’RNA di tutti i campioni è stata misurata mediante “Qubit® 2.0 Fluorometer” (Invitrogen) con il kit “Qubit® RNA BR Assay Kit” (Invitrogen) riportando concentrazioni superiori ai 5 ng/μL (300 ng di RNA totali). Le concentrazioni e lo stato di degradazione dei campioni di RNA sono riportati in Tabella 17.

Tabella 17: Quantità e qualità dell’RNA estratto dai campioni FFPE.

ID Campione NanoDrop ND-1000 Qubit®2.0 Fluorometer 2200 TapeStation [ ] ng/μL 260/280 260/230 [ ]ng/μL [ ]ng/μL RIN 1 22.4 1.95 1.47 22.5 13.9 1.9 2 35.3 1.73 0.94 52 26.4 1.8 3 27.6 2.01 1.17 25.7 17.8 2.6 4 192 1.96 1.64 164 82.4 2.6 5 5.5 2.08 0.05 5.57 5.11 2.3 CTRL Negativo 240.2 1.96 1.86 356 350 1.9 CTRL Positivo (Lot.RD14110301) 37.9 2.11 1.52 43.4 34.8 1.8 9.2.2 NGS dei campioni

I risultati ottenuti dall’analisi di NGS utilizzando il pannello “Ion AmpliSeq™ RNA Fusion Lung Cancer Research Panel” (ThermoFisher Scientific) sull’Ion PGM mediante l’utilizzo del software Ion Reporter™ 4.2 ha riconfermato la presenza delle traslocazioni nel gene ALK dei 5 campioni precedentemente testati positivi mediante FISH. Il controllo positivo mandato dalla ditta ha riportato la presenza di due traslocazioni: una sul gene

109

particolare, il controllo positivo presentava un evento di fusione del gene ALK con EML4 e uno del gene RET con CCDC6. Il campione FFPE negativo per traslocazioni non ha presentato nessun evento di fusione. Inoltre, sia un numero di letture mappate per ciascun gene “driver” maggiore di 20 che la presenza dei 5 geni di controllo di espressione sono state ottenute per tutti i campioni analizzati. I risultati dell’NGS sono riportati in Figura 32.

Figura 32: Risultati ottenuti sulle traslocazioni mediante NGS.

In particolare, nella Figura 33 è riportata ad esempio il risultato dell’analisi su IonReporter del controllo positivo fornito dalla ditta.

110

10. DISCUSSIONE

Recentemente, le terapie a bersaglio molecolare o “target therapy” sono emerse come una promettente un'opzione terapeutica per un sottogruppo di pazienti in stadio avanzato affetti da NSCLC che presentano mutazioni attivanti in geni bersaglio di farmaci195_{. Attualmente, la valutazione della presenza di queste mutazioni attivanti è} eseguita su biopsie tumorali di tessuto FFPE nonostante la quantità di tessuto sia spesso limitata e la qualità del DNA estratto possa non essere sempre ottimale. Inoltre, poiché il numero dei geni a bersaglio farmacologico aumenta costantemente nel tempo vi è la necessità in un contesto clinico di validare nuove tecnologie altamente sensibili e di elevato “throughput”, come l’NGS. Ad oggi, diversi studi hanno indagato la capacità dell’NGS nell’effettuare analisi molecolari su molecole di acido nucleico estratte da campioni FFPE di diversi tipi di cancro196-198_{, incluso il NSCLC}199_.

Nel primo obiettivo della tesi (Obiettivo 1) viene definito un “workflow” ottimizzato, che utilizza un pannello di 22 geni associati al tumore del polmone, per eseguire correttamente l’analisi e l’individuazione di mutazioni attivanti partendo da campioni critici, come le biopsie FFPE e il cfDNA, assicurando una buona qualità e affidabilità dei dati di NGS ottenuti.

Il presente “workflow” include: 1) una corretta quantificazione e controllo di qualità del DNA di partenza; 2) un approccio WGA per incrementare in modo lineare il DNA ottenuto da campioni con basse quantità di DNA di partenza (< 1 ng); 3) protocolli di preparazione delle “libraries” specifici a seconda della tipologia di DNA di partenza (FFPE e cfDNA); 4) una robusta pipeline bioinformatica in modo da individuare correttamente sia SNV che indels (Figura 34). Similmente ad altri “workflow” di NGS200_{, il wokflow presentato è stato} in grado di rilevare sia SNVs che indel con una frequenza fino al 5% ottenendo ottime “performance” per i campioni FFPE (100% di specificità e PPV; 96% di sensibilità). Il

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“workflow” di NGS è stato valutato retrospettivamente sia sui DNA estratti da campioni SF e dai corrispettivi campioni FFPE, che sui cfDNA isolati dal plasma di 9 dei 12 pazienti operati NSCLC positivi per mutazioni a carico del gene KRAS o EGFR (precedentemente individuati mediante SS o tramite Real-Time PCR).

Un controllo di qualità pre-analitico per definire se il DNA sia idoneo per la sua applicazione in NGS è di fondamentale importanza in particolar modo quando viene eseguito su un DNA altamente degradato, come il DNA estratto da campioni FFPE. La maggior parte degli studi, intesi a definire le linee guida per il sequenziamento di campioni FFPE, si sono concentrati sul metodo corretto di quantificazione del DNA e non sul definirne una appropriata qualità200,201_{. Al contrario, il “workflow” presentato, che} prevede l’utilizzo di una PCR multiplex, ha permesso di definire il parametro AYR, indicativo dello stato di degradazione del DNA, che è altamente correlato con le metriche di qualità di sequenziamento, come l'uniformità e la copertura. In particolare, si è identificato una soglia di integrità per l’elaborazione del DNA estratto dai campioni FFPE stimato come AYR = 0.3 (corrispondente ad uno stato di frammentazione del DNA del 70%). Inoltre, sebbene il protocollo della ditta riguardo la preparazione delle “libraries” richieda 10 ng di DNA di partenza per i campioni FFPE, nello studio presentato si è dimostrato che DNA altamente degradati fino ad AYR = 0.3 possano essere sequenziati con successo raddoppiando la quantità di DNA di partenza (20 ng). In particolare, l’incremento del DNA di partenza ha aumentato il numero di ampliconi coperti almeno 500 volte (parametro che in contesto di tipo clinico è richiesto per l’utilizzo di qualsiasi pannello somatico di NGS)202_{. Tuttavia, sono stati identificati cinque ampliconi che in} maniera ricorrente non venivano sufficientemente coperti nei DNA dei campioni FFPE altamente degradati a causa di un alto contenuto di GC (> 60%) in tali ampliconi. Tuttavia, tale fenomeno è un bias proprio della tecnologia NGS, come già ampiamente riportato203_.

112

Uno dei punti critici dell'analisi NGS è quello di generare un elenco di varianti affidabili; quindi nello studio si è verificato se l'integrazione di due diverse pipeline bioinformatiche possa migliorare la chiamata delle SNVs con una maggiore sensibilità e precisione rispetto all’utilizzo di un singolo software. In particolare, si è confrontato la chiamata delle varianti mediante VC, il plug-in ION PGM con parametri predefiniti ottimizzati, rispetto a GATK uno dei software NGS più utilizzati. Entrambi i due software hanno mostrato risultati diversi nel rilevamento delle SNVs (100 SNVs rilevate da VC vs 103 da GATK; 95 SNVs in comune tra i due software). Le differenze nelle chiamate delle varianti tra i due software potrebbero essere dovute ai diversi allineamenti e algoritmi di chiamata204_{. Il software} GATK ha mostrato un tasso di errore molto elevato nella chiamata delle indel (circa 20 indel per campione, dati non mostrati) per cui è stato escluso nella chiamata delle indel. Una possibile spiegazione è che la pipeline GATK è stata sviluppata per l'analisi dei dati di NGS delle piattaforme Illumina, mentre la pipeline VC che è stata creata per l'analisi dei

dati FastQ generati dalle piattaforme Ion

(http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/best-practices).

In questo contesto, alcune evidenze sono state già precedentemente riportate in merito all'elevato tasso di varianti false positive rilevate da GATK con dati non Illumina-FastQ. In particolare, questi falsi positivi si riferiscono a piccole indel in regioni omopolimeriche dove la difficoltà di rilevare e determinare il genotipo di queste rimane una sfida a causa della propensione dell’enzima polimerasi di scivolare durante il processo di PCR portando a generare artefatti di sequenza che GATK non riesce a distinguere205_{. La validazione} mediante PS ha confermato tutte le varianti genetiche (mutazioni discordanti con una frequenza di mutazione > 5%) trovate discordanti mediante VC tra i campioni SF ed i corrispettivi campioni FFPE, dimostrando che la pipeline VC è ottimizzata per i dati Ion PGM. Quindi queste varianti trovate discordanti tra i campioni SF ed i corrispondenti

113

campioni FFPE possono essere spiegati come una eterogeneità intra-tumorale, come già precedentemente osservato nel NSCLC139,206-208_{. Sebbene GATK non abbia escluso} nessuna variante SNV falsa positiva chiamata da VC, essa ha filtrato via tutti i SNVs discordanti SF/FFPE rilevati da VC con frequenze inferiori al 5%, confermando così la LOD definita nello studio. Le mutazioni somatiche nei geni EGFR e KRAS, precedentemente rilevate mediante SS o Real-Time PCR, sono state confermate da entrambi i software di chiamata delle varianti sia nei SF che nei FFPE, convalidando l'alta specificità del pannello NGS utilizzato per l'identificazione di queste mutazioni.

Grazie alla sua elevata sensibilità, l’NGS rappresenta un approccio ottimale per indagare anche il profilo mutazionale del cfDNA come approccio diagnostico non invasivo in grado di monitorare la progressione della malattia durante il trattamento. Infatti, una frazione del cfDNA deriva dalle cellule tumorali e viene chiamata ctDNA nei pazienti affetti da tumore144_{. Ad oggi, diversi studi hanno dimostrato la fattibilità di utilizzare il ctDNA come} potenziale marcatore tumorale in un numero limitato di pazienti con diversi tumori solidi; tuttavia, pochi studi sono stati eseguiti sul NSCLC209_{. Pertanto, in questo studio è stato} sviluppato anche un “workflow” ottimizzato per l’analisi mutazionale del cfDNA, combinando un approccio WGA per i campioni con input di cfDNA ridotti (< 1 ng) e un protocollo specifico per la preparazione della “library”, ottenendo un elevato numero di letture di buona qualità. Attualmente, sono stati sviluppati diversi approcci WGA, che differiscono nella chimica e complessità210-214_{. In questo studio è stato utilizzato un WGA} basato sulla tecnologia MDA che impiega la DNA polimerasi phi29 e primers random per amplificare il DNA senza ciclazioni termiche184,214_{. Diversi studi hanno rivelato che la} tecnologia MDA può amplificare il genoma con una maggiore uniformità, con una lunghezza maggiore e meno bias rispetto ai metodi WGA basati sulla PCR184,215-218_. Pertanto, il WGA basato su MDA è stato dimostrato essere il metodo migliore per

114

ottenere cfDNA di alta qualità per diverse applicazioni, come l'NGS. Un'altra importante limitazione nell’utilizzo dell'approccio WGA è la quantificazione corretta del DNA amplificato. Infatti, le tecniche WGA determinano la presenza di prodotti secondari non specifici ed i reagenti utilizzati possono influenzare la quantificazione del DNA mediante metodi fluorometrici216,219_{. Pertanto, si è deciso di eseguire la quantificazione del cfDNA} amplificato mediante WGA usando la tecnica Real-Time PCR; tale tecnica si è dimostrata esser il metodo più affidabile per la quantificazione220_{. I dati di sequenziamento ottenuti} dalla linea cellulare NCI-H1650 amplificata mediante WGA ha mostrato prestazioni analoghe rispetto alla linea cellulare standard non WGA, indipendentemente dall’input di DNA di partenza. Le varianti SNVS identificate mediante NGS hanno mostrato frequenze simili in tutti i campioni della linea cellulare NCI-H1650 amplificata mediante WGA, suggerendo così che questa tecnologia possa essere applicata al pannello di NGS utilizzato nello studio quando la quantità iniziale di cfDNA è limitata. Tuttavia, si deve tener conto che la tecnica WGA basata su MDA introduce alcune bias di amplificazione che si verificano principalmente in regioni omopolimeriche del DNA, come precedentemente osservato, portando ad una diminuzione della specificità del saggio184,221,222_{. D'altronde,} siccome l'applicazione del WGA è necessaria per produrre una quantità di DNA sufficiente per il successivo “workflow” di sequenziamento223_{, si è cercato di ridurre tutti i punti} critici. Il “workflow” ottimizzato e l'analisi di NGS sui cfDNA ha permesso di individuare in un solo campione di cfDNA lo stesso profilo di mutazione del tumore corrispondente.