La biopsia tissutale

Attualmente, nella pratica clinica la biopsia è una procedura essenziale nei pazienti oncologici, in quanto fondamentale per fornire informazioni cruciali sulla diagnosi, la prognosi e per predire la risposta o la resistenza ad una terapia. Per decenni la biopsia è stata e continua ad essere lo standard di diagnosi. In particolare, l’analisi bioptica rappresenta l’unica opzione per determinare il tessuto dal quale si è originata la neoplasia e lo stadio di malattia del paziente. Con l’avvento delle terapie target, oggi è essenziale valutare le alterazioni molecolari suscettibili a tali farmaci e le resistenze ai trattamenti farmacologici congiuntamente agli aspetti istologici noti. Dal punto di vista clinico, la biopsia consiste nel prelievo di una porzione o di un frammento di tessuto da un paziente. La biopsia polmonare consiste nel prelevare e nell’analizzare in laboratorio un piccolo campione di tessuto polmonare, proveniente da un individuo con sospetta malattia di tumore al polmone. Esistono tre modalità differenti di prelievo: la biopsia broncoscopia, l’agobiopsia polmonare e la biopsia polmonare “a cielo aperto”. I primi due metodi sono esami ambulatoriali minimamente invasivi, ma purtroppo poco specifici. La biopsia polmonare “a cielo aperto” è invece un intervento chirurgico vero e proprio, le cui possibili complicanze sono controbilanciate da una grande specificità. Il tessuto prelevato viene processato e analizzato al microscopio al fine di escludere o confermare un

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sospetto di malattia. In particolare, per consentire l’allestimento di preparati osservabili al microscopio, il tessuto viene prima fissato in formalina e quindi incluso in paraffina. Il tessuto così ottenuto può essere tagliato in fettine dello spessore di 2-4 micron, montato su un vetrino porta-oggetti e colorato. Infine, il medico patologo valuta il vetrino al microscopio e formula la diagnosi.

Sebbene il tessuto tumorale FFPE sia ad oggi il “gold standard” per l’analisi molecolare, esistono delle limitazioni in termini di acquisizione ed utilità.

Gli svantaggi della biopsia sono: ➢ metodo invasivo;

➢ alcune lesioni sono clinicamente inaccessibili;

➢ la tecnica può causare l'accidentale migrazione di cellule tumorali dal sito primario, permettendo a queste di diffondere in altre aree del corpo. Infatti, il tumore deve essere perforato dalle quattro alle sei volte per ottenere un sufficiente ammontare di tessuto per la diagnosi; ciò può causare la rottura del tumore e il diffondersi delle cellule tumorali lungo il tracciato dell'ago, nel sistema linfatico o in quello sanguigno.

Oltre alle problematiche relative all’acquisizione tissutale, anche la conservazione e l’eterogeneità tumorale rappresentano elementi a sfavore nell’uso della biopsia tumorale per l’analisi molecolare:

➢ conservazione: la formalina in cui viene immerso il tessuto può degradare il DNA a tal punto da renderlo inutilizzabile per analizzare la presenza di mutazioni, in questo caso risulta impossibile fare una diagnosi. In aggiunta a ciò, la formaldeide reagisce con il DNA e le proteine per formare intermedi idrossimetili producendo molecole di DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-proteine legate covalentemente tramite ponti metilenici. Inoltre, la formaldeide genera reazioni di ossidazione,

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deaminazione e la formazione di derivati di base ciclici. Queste modificazioni chimiche date dall’utilizzo della formaldeide potenzialmente potrebbero inficiare sul risultato dei test molecolari usati in pratica clinica attraverso sia l’inibizione della manipolazione enzimatica del DNA sia determinando cambiamenti di basi nucleotidiche che potrebbero essere confuse come mutazioni genetiche quando sono semplicemente artefatti. Il tipo più comune di artefatto è rappresentato dalle sostituzioni C:G>T:A causate dalla deaminazione della base citosina136,137_. Tuttavia, è stato osservato che il trattamento del DNA “artefatto” con l’enzima uracil-DNA glicosilasi (UDG) (che rimuove il nucleotide uracile deaminato attraverso l’idrolisi N-glicosidico tra la base uracile e lo zucchero fosfato) prima dell’analisi molecolare, ovvero durante la fase di estrazione, riduce sensibilmente gli artefatti C:G>T:A138_{. Ad oggi esistono in commercio molto kit che utilizzano} all’interno della procedura di estrazione l’enzima UDG per ridurre il numero di artefatti C:G>T:A. Inoltre, il metilene porta alla frammentazione del DNA che rende problematico l’analisi tramite tecniche di biologia molecolare di sequenze di DNA più lunghe di 100-200 paia di basi.

➢ eterogeneità: l’incapacità di cogliere l’eterogeneità tumorale è senza dubbio il limite maggiore della biopsia. Aree diverse dello stesso tumore possono mostrare profili genetici diversi, come anche le varie metastasi all’interno di uno stesso paziente. Quindi prelevare una sezione di tessuto da un tumore isolato non consente di valutarne l’eterogeneità e per farlo occorrerebbero biopsie multiple e ripetute nel tempo139_.

Al fine di superare le limitazioni della biopsia, sono state studiate delle tecniche meno invasive, capaci di identificare l’eterogeneità tumorale ed i cambiamenti molecolari a cui vanno incontro le cellule neoplastiche in seguito a trattamento farmacologico. Quindi,

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sebbene ad oggi il “gold standard” per effettuare indagini molecolari sia la biopsia tissutale, le tecniche attualmente utilizzate per la biopsia sono invasive e nel caso di pazienti con NSCLC producono spesso un numero di cellule o sezioni tissutali troppo esiguo per una analisi approfondita. Inoltre, per molti pazienti non è possibile eseguire biopsie ripetute a causa dell’età o di eventuali comorbidità. Recentemente per i pazienti con cancro polmonare avanzato, una biopsia liquida non invadente rappresenta una efficace alternativa alla biopsia del tessuto (Figura 16). Infatti all’interno di quello che viene definito come biopsia liquida, ritroviamo oltre alle cellule tumorali circolanti (CTC) e agli esosomi contenenti acidi nucleici, il DNA tumorale circolante (ctDNA) presente nei liquidi corporei, quali plasma/siero, di persone affette da neoplasie maligne, che potrebbe costituire una valida alternativa alle ripetute biopsie e potrebbe rappresentare un importante aiuto per monitorare i cambiamenti molecolari del tumore in corso di trattamento140_.

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