Piattaforme di NGS

In seguito ai metodi di sequenziamento di 1° generazione, i metodi di 2° e 3° generazione, detti sequenziamenti di nuova generazione (NGS), sono stati i primi metodi di sequenziamento parallelo e massivo introdotti nel mercato che hanno permesso di abbattere notevolmente i tempi di lavoro ed i costi. Esistono diversi metodi di NGS di 2° generazione che si basano su processi biochimici differenti, ma esistono tuttavia delle linee guida comuni sulla procedura. Il primo passo consiste infatti nella preparazione di una libreria (“library”) di DNA che solitamente si ottiene per frammentazione del DNA di interesse; ai frammenti così ottenuti vengono aggiunti degli adattatori (“adaptors”), ovvero delle sequenze specifiche di poche basi, necessarie ad ancorare ed immobilizzare i frammenti sul supporto dove avverrà la successiva amplificazione e sequenziamento. La fase successiva è l’amplificazione mediante PCR necessaria per aumentare il numero di copie di ogni singolo frammento di DNA (generazione di cluster); la PCR può avvenire o in emulsione o in soluzione; le copie clonali di ogni frammento prendono il nome di clusters. La generazione dei cluster è un passaggio cruciale in quanto, poiché la velocità di crescita e sequenziamento dei frammenti deve essere la stessa, è necessario limitare la lunghezza delle singole “reads”. Terminata la fase di amplificazione, segue il sequenziamento vero e

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proprio e l’immagazzinamento ed analisi dei dati. Le caratteristiche che differenziano le tecnologie NGS di 2° generazione sono principalmente due: la tecnica di amplificazione clonale dei frammenti e la chimica utilizzata nel processo di sequenziamento. Da questi due parametri principali ne derivano poi degli altri: lunghezza delle “reads”, tempi di corsa, megabasi sequenziate, accuratezza dei dati grezzi, costo per campione e costo iniziale della tecnologia.

Il primo sistema a fare la sua comparsa nel mercato nel 2005 è stato il 454 prodotto dalla Life Sciences - Roche. Questo sistema prevede l'amplificazione clonale dei frammenti attraverso una particolare tecnica chiamata PCR in emulsione (“Emulsion PCR”). Essa consiste nella preparazione di un'emulsione di acqua e olio in cui le microbolle d'acqua svolgono l'azione di microreattori per le reazioni di PCR. In soluzione acquosa vengono preventivamente dispensati tutti i reagenti per la reazione di amplificazione unitamente a delle biglie di supporto (“beads”) su cui si legano i frammenti di DNA. Quando i reagenti sono presenti in quantità bilanciate, tra loro e rispetto ai volumi di acqua e olio, secondo la legge della distribuzione di Poisson, essi si distribuiranno in maniera tale che ogni microreattore contenga un frammento di DNA, la polimerasi, i reagenti necessari per l'amplificazione e una biglia di supporto. Sottoposti a delle variazioni cicliche di temperatura, come avviene in una normale reazione di PCR, i microreattori daranno luogo alla produzione di migliaia di frammenti clonali che, grazie a delle sequenze specifiche complementari a delle corte sequenze adese alle biglie, andranno a ricoprirne l'intera superficie (Figura 20).

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Figura 20: PCR in emulsione. (Tratto da: Metzker ML et al. Nat Rev Genet. 2010; 11:31-46).

Il sequenziamento della Roche 454 viene effettuato attraverso il metodo del pirosequenziamento (Figura 21), che si basa sulla determinazione della presenza del pirofosfato che viene rilasciato al momento della formazione di un nuovo legame fosfodiesterico nella catena nascente del DNA. Il pirofosfato funge da substrato per una luciferasi causando, immediatamente dopo l'incorporazione di un nucleotide, una emissione di energia luminosa che viene rilevata da un sensore. I punti di forza mostrati dal 454 Roche sono la velocità di processamento e la lunghezza delle “reads” prodotte, superiore rispetto agli altri sistemi di NGS (oltre 700bp).

Figura 21: Rilevazione del segnale nel pirosequenziamento della piattaforma 454

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Un'altra tecnologia NGS è quella proposta dalla Illumina Inc. che ha sviluppato un sistema di sequenziamento basato sull'utilizzo di terminatori fluorescenti reversibili. L'amplificazione clonale avviene attraverso la metodica detta "bridge PCR". In una prima reazione, vengono legati ai frammenti da amplificare delle sequenze di riconoscimento universali dette adattatori. I frammenti successivamente vengono distribuiti su un supporto rigido a cui si legano grazie alla presenza di sequenze complementari agli adattatori, ancorate alla superficie. Ciascun frammento viene clonato attraverso la formazione delle caratteristiche "strutture a ponte", che danno luogo alla costituzione dei "cluster", microaree circoscritte del supporto nelle quali sono presenti i frammenti clonati da un unico templato di partenza (Figura 22).

Figura 22: Amplificazione clonale mediante “Bridge PCR”. (Tratto da: Metzker ML et al. Nat Rev Genet. 2010; 11:31-46).

Il sequenziamento avviene attraverso l'utilizzo di nucleotidi con gruppi terminatori fluorescenti reversibili. Ad ogni ciclo del processo di sequenziamento (flows), sulla superficie del supporto su cui sono presenti i “cluster” viene riversata una miscela

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contenente i terminatori ed una DNA polimerasi modificata. Ad ogni “flow” si ha l'incorporazione di uno dei dNTP fluorescenti, la cui successiva emissione luminosa viene rilevata e convertita dal sistema in immagini globali dell'intera superficie del vetrino di supporto. In seguito, avviene il rilascio per via chimica dei gruppi terminatori che consente la prosecuzione del processo, con l'incorporamento di ulteriori nucleotidi e l'allungamento della sequenza. Il sistema proposto da Illumina è ad oggi il più diffuso tra le tecnologie NGS; questo grazie, sia all'elevata accuratezza dei dati prodotti attraverso questa tecnologia, sia alla disponibilità commerciale di sequenziatori dalle diverse caratteristiche, adattabili alle molteplici esigenze dei laboratori di ricerca. Per contro, questo sistema presenta costi, relativi all'acquisto iniziale, più elevati rispetto alle altre tecnologie disponibili.

Un'altra tecnologia utilizzata fino a pochi anni fa è il SOLiD® NextGeneration Sequencing proposto dalla Life Technologies. Questo sistema prevede un'amplificazione clonale del campione attraverso una PCR in emulsione, analogamente al 454 Roche, mediante l'utilizzo di “beads” di supporto, le quali, a differenza del 454, dopo l'amplificazione vengono distribuite ed immobilizzate su supporto solido. Il protocollo SOLiD si differenzia nel processo di sequenziamento per l'utilizzo di una ligasi e non di una polimerasi. Il sequenziamento, infatti, prevede l'utilizzo di ottameri marcati con fluorocromi, che si legano selettivamente alla sequenza stampo e il cui primo nucleotide viene ligato all'innesco. L'emissione luminosa viene registrata e in seguito viene eseguito un taglio tra il 5° e 6° nucleotide, che elimina il marcatore fluorescente e permette l'inserimento di un nuovo ottamero. La valutazione complessiva dei frammenti prodotti permette di ricostruire la sequenza del templato d'origine.

Nel 2011 viene pubblicato da J.M. Rothberg un lavoro nel quale viene descritto un nuovo modello di tecnologia di sequenziamento massivo, la Ion Torrent Technology (in

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particolare il sistema Ion PGM™ System - Personal Genome Machine)182_{. I sequenziatori} Ion Torrent sono sequenziatori “benchtop” ovvero una PGM (personal genome machines), un piccolo sequenziatore con un output inferiore alle grandi macchine adatto ai piccoli laboratori. Questi sequenziatori furono inizialmente prodotti dalla Ion Torrent, successivamente acquistati dalla Life Technologies e poi dalla ThermoFisher Scientific. Attualmente sono in commercio quattro diverse piattaforme della ThermoFisher Scientific ovvero l’Ion PGM, l’Ion S5, l’Ion S5 XLS5 e l’Ion Proton; tutte le piattaforme sfruttano la tecnologia del sequenziamento tramite semiconduttore. In pratica, il metodo si basa sulla rilevazione di ioni di idrogeno che vengono rilasciati durante la sintesi del DNA. Il flusso di lavoro di questa piattaforma è simile alle altre viste in precedenza (Figura 23).

Figura 23: Flusso di lavoro dei sequenziatori Ion torrent.

Anche il protocollo Ion Torrent prevede l'amplificazione clonale del campione attraverso PCR in emulsione ma il processo di sequenziamento presenta due aspetti essenziali che lo caratterizzano rispetto alle altre tecnologie:

➢ l'utilizzo dei semiconduttori come elemento strutturale di supporto in cui viene dispensato il campione per il sequenziamento (Ion Chips);

➢ l'impiego di un sistema di rilevamento basato non su reazioni ma su variazioni di potenziale.

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Infatti, le microsfere, contenenti i frammenti di DNA che hanno subito amplificazione clonale mediante PCR in emulsione, vengono depositate sui pozzetti di un chip e sequenziati. Il sequenziamento consiste nel trattare il templato con una soluzione contenente un singolo dNTP e la polimerasi. In seguito alla reazione di legame di un dNTP da parte della polimerasi viene rilasciato uno ione H+ che porta successivamente ad un'alterazione del pH che viene registrata; su queste registrazioni viene elaborata la sequenza. Se vengono incorporati due nucleotidi, vi sarà una variazione di pH “doppia”. Il vantaggio principale dell'Ion Torrent è innanzitutto l'assenza di sistemi di rilevazione basati su fluorescenza che permette di ottenere una maggiore precisione, in particolare nelle zone di basi ripetute. Inoltre, con la piattaforma Ion PGM si riesce a lavorare con una quantità di DNA di partenza irrisoria (circa 10ng) sequenziando “reads” che vanno dai 35 ai 400bp ed in circa 16 ore è possibile analizzare 8 campioni in parallelo, rendendo questo sistema estremamente idoneo per l'utilizzo anche in urgenza. Un altro aspetto vantaggioso offerto dalla tecnologia Ion Torrent è la disponibilità di chip con capacità scalari che consente di modulare il sistema in base alle necessità sperimentali. In seguito allo sviluppo del PGM, la ditta ha sviluppato in ordine consecutivo l'Ion Proton™ Sequencer (maggior processività e quindi più appropriato per sequenziamento di esomi e genomi), l’S5 Ion S5 e l’Ion S5 XL.

Oltre al sequenziatore vero e proprio, due ulteriori strumenti sono necessari a monte del processo di sequenziamento vero e proprio (Figura 24A-B):

➢ OneTouch che svolge il compito di effettuare automaticamente la PCR in emulsione.

➢ OneTouch ES che viene utilizzato per l'arricchimento/purificazione del campione successivamente alla reazione di amplificazione clonale.

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L’Ion Chef è stato messo in commercio successivamente e consiste in un unico strumento che in automatico fornisce la preparazione della libreria, la preparazione del templato (ovvero PCR in emulsione ed arricchimento) ed il caricamento del chip sostituendo così i due strumenti OneTouch e OneTouch ES (Figura 24C).

Figura 24: (A) OneTouch ES; (B) OneTouch; (C) Ion Chef.

Nell’ultimo decennio sul commercio sono comparse le metodiche di NGS di 3° generazione, anche dette metodiche a singola molecola di DNA, poiché la caratteristica principale di queste metodiche è proprio quella di non avere necessità di una amplificazione del segmento da sequenziare, producendo una serie di vantaggi nell’utilizzazione. I vantaggi si possono riassumere in una netta riduzione dei tempi di risposta in quanto si riduce tutta la fase di preparazione del templato da sequenziare, nella possibilità di elaborare “reads” più lunghe al fine di riuscire a migliorare l’accuratezza del sequenziamento de novo, nella maggiore efficienza nella costruzione della sequenza perché vengono eliminati gli errori che potrebbero originarsi durante la fase di amplificazione e nella possibilità di utilizzare una piccola quantità di materiale di partenza, aspetto particolarmente utile nella pratica clinica. Le piattaforme attualmente in commercio per il sequenziamento di 3° generazione sono Pacific Biosciences Single Molecule Real-Time (SMRTTM) e la piattaforma Helicos Biosciences true Single Molecule

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Sequencing (tSMS). La piattaforma Helicos Biosciences true Single Molecule Sequencing (tSMS) ha molte delle caratteristiche del sequenziamento di 2° generazione ma si distingue da esse per la capacità di sequenziare direttamente l’RNA, mentre la piattaforma Pacific Biosciences Single Molecule Real-Time rappresenta una novità in quanto permette la rivelazione in tempo reale della sequenza, ma presenta tuttavia un’accuratezza minore ed un maggiore numero in percentuale di errori (> 5%).

In Tabella 10 alcune delle piattaforme NGS attualmente in commercio.

Platform Company Method Library/Template preparation

HiSeq 2000® Illumina Reversible dye Terminator; 4-color optical imaging (Sequencing by synthesis) Bridging amplification/solid-phase Myseq® Illumina MiniSeq Illumina NextSeq Illumina GS FLX+® Roche Pyrosequencing; pyrophosphate released at time of base incorporation Clonal amplification/emulsion PCR GS junior® Roche SOLiD 5500xl®

Life Technologies Ligation sequencing Clonal amplification/emulsion PCR Ion torrent PGM® ThermoFisher Scientific Ion sequencing; standard dNTP sequencing chemistry Clonal amplification/emulsion PCR Ion Proton® ThermoFisher Scientific Ion S5® ThermoFisher Scientific PacBio RS II® Pacific BioScience Single-molecule real- time sequencing; phospholinked fluorescent nucleotides PCR free/fragmentation only Oxford Nanopore Single molecule sequencing incorporating nanopore technology

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