I miRNA come biomarcatori

I miRNA (Turchinovich, et al., 2018) sono biomarcatori non invasivi del sangue che sono noti per la loro stabilità nel siero e rendono perciò fattibile sia la procedura della raccolta sangue e della separazione del siero che gli step successivi di quantificazione dei biomarcatori stessi. Inoltre, a differenza delle proteine, gli acidi nucleici possono essere rilevati mediante la reazione a catena della polimerasi (PCR) che implica un'amplificazione esponenziale dello stampo originale; quindi, i miRNA circolanti potrebbero fornire una sensibilità molto più alta rispetto ai biomarcatori proteici. I miRNA potrebbero avere un impiego nella NAFLD.

Alcuni profili dei miRNA circolanti possono riflettere vari eventi istopatologici che si verificano nel fegato e hanno un potere predittivo altamente affidabile per distinguere la semplice steatosi dalla NASH. Sorprendentemente, dopo la morte delle cellule parentali, i miRNA rimangono stabili nello spazio extracellulare ricco di nucleasi per periodi prolungati prevalentemente a causa della loro associazione con le proteine della famiglia Ago (Arroyo et al., 2011; Turchinovich et al., 2011; Turchinovich and Burwinkel, 2012) . Con il risultato che miRNA sono stati ripetutamente rilevati in tutti i tipi di liquidi biologici umani, tra cui sangue, urina, lacrime, latte materno, liquido amniotico, liquido cerebrospinale, saliva e sperma (Turchinovich et al., 2012). Numerose ricerche hanno confermato che i miRNA circolanti extracellulari riflettono il benessere del corpo e

73 possono essere utilizzati per monitorare i processi patofisiologici che si verificano in alcuni organi e tessuti (Cortez et al., 2011; Etheridge et al., 2011; Sayed e Abdellatif, 2011). A differenza delle proteine, gli acidi nucleici (compresi i miRNA) possono essere determinati con l’aiuto di una PCR che implica un'amplificazione di molte milioni di volte del modello originale. A causa di ciò, la rilevazione dei miRNA circolanti può essere raggiunta con un grado di sensibilità molto più elevato rispetto a quello dei biomarcatori proteici. Studi che dimostrano la notevole capacità diagnostica dei miRNA circolanti hanno iniziato a comparire poco dopo la loro scoperta nel 2008.

Studi sull'uomo condotti da Zhang et al. (2010) in relazione alle epatopatie hanno evidenziato che il cambiamento dei livelli di miR-122 nel sangue può essere rilevato molto prima rispetto all'aumento dell'attività dell'amminotransferasi epatica. Inoltre, i cambiamenti del miR-122 erano correlati con lo stato istologico del fegato umano ed erano specifici per il danno epatico. Xu et al. (2011) hanno successivamente dimostrato che i livelli sierici medi di miR-21, miR-122 e miR-223 sono significativamente più alti nei pazienti con epatite cronica e HCC rispetto a quelli nei controlli sani. Diversi studi precedenti si erano focalizzati sulla discriminazione dei vari stadi della NAFLD analizzando i profili di espressione dei miRNA nel parenchima epatico (Guo et al., 2016; Soronen et al., 2016; Latorre et al., 2017). Tuttavia, solo alcuni gruppi di ricerca hanno finora studiato i cambiamenti, associati alla NAFLD, dello spettro dei miRNA extracellulari presenti nel sangue umano (Cermelli et al., 2011; Yamada et al., 2013; Miyaaki et al., 2014; Tan et al. , 2014; Becker et al., 2015; Pirola et al., 2015; Akuta et al., 2016; Liu et al., 2016; Raitoharju et al., 2016; Salvoza et al., 2016; Thompson et al., 2017). Tutti questi lavori suggeriscono fortemente che i miRNA circolanti possono essere utilizzati come biomarkers più sensibili e specifici del danno epatico rispetto ai test biochimici attualmente in uso basati sulla misurazione dell'attività delle transaminasi sieriche. Ad esempio, analizzando il profilo di un numero globale di 84 miRNA diversi nel siero, Pirola et al. (2015) hanno identificato sei specie di miRNA circolanti che sono sovraregolate più di 2 volte in individui con semplice steatosi o con NASH. Becker et al. (2015) hanno mostrato che i livelli sierici di miR-122, miR-192 e miR-21 sono strettamente correlati ai livelli di vari noti biomarcatori di NASH ed ad isolati parametri

74 patofisiologici che riflettono la gravità della NASH, tra cui il grado di steatosi, la degenerazione balloniforme, l’infiammazione lobulare e la fibrosi. È probabile che diversi miRNA svolgano ruoli distinti in diversi stadi dello sviluppo della NAFLD, o che sia in atto una più intricata interazione tra i miRNA, le proteine solubili ed i vari processi patofisiologici associati alla NAFLD (Makarova et al., 2016; Galatenko et al., 2018). Pertanto, dal punto di vista diagnostico e di stratificazione, i miRNA circolanti dovrebbero essere combinati in un pannello diagnostico basato sulla loro capacità di riflettere singole componenti fisiopatologiche, che si intrecciano nella NAFLD, e permettano perciò di definire il decorso e l'esito della malattia in un dato individuo. Inoltre, le concentrazioni dei singoli miRNA nel siero potrebbero non essere colineari con il pattern temporale di deterioramento del parenchima epatico. Tuttavia, va puntualizzato, che nonostante i grandi progressi verso l'accettazione clinica di questi biomarcatori, l'utilità diagnostica dei miRNA circolanti per più patologie umane rimane ancora da testare e validare.

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4.4 BIOMARCATORI METABOLICI

4.4.1 Diagnosi di NAFL

Ci sono diversi indici e punteggi che sono stati sviluppati per valutare la steatosi epatica. L'indice di fegato steatosico (fatty liver index o FLI) (Wong et al.2018) comprende il BMI, la circonferenza della vita ed i livelli sierici di trigliceridi e GT. Come riscontrato dall’ecografia il FLI ha una precisione moderata nella diagnosi del fegato steatosico. In uno studio di popolazione in Italia, il FLI era correlato con l'insulino-resistenza ed era predittivo della mortalità oncologica correlata ad ogni tipo di cancro.

L’equazione per calcolare il FLI (Bedogni et al. 2006) è la seguente:

FLI = (e0,953 × log[trigliceridi] + 0,139 × BMI + 0,718 × log[GT] + 0,053 × circonferenza vita – 15,745)/(1 + e0,953 × loge

(trigliceridi) + 0,139 × BMI + 0,718 × log (GT) + 0,053 × circonferenza della vita - 15,77

) × 100

L'indice di steatosi epatica (hepatic steatosis index o HSI) (Wong et al.2018) è stato ottenuto e convalidato in una grande coorte di più di 10.000 individui sottoposti a controlli sanitari. L'HSI comprende cinque componenti (rapporto AST/ALT sieriche, BMI, sesso e presenza di diabete mellito) ed ha una moderata accuratezza per rilevare il fegato steatosico come poi viene determinato dall'ecografia. L’HSI può essere calcolato utilizzando l’equazione seguente:

HSI = 8 × ALT/AST + BMI (+2, se diabete di tipo 2; +2, se femmina) (Fedchuk et al.

2014).

La limitazione fondamentale di entrambi questi indici di statosi, FLI e HSI (Wong et al.2018), è l'uso di uno standard di riferimento subottimale, poiché la diagnosi di fegato steatosico mediante ultrasonografia può dipendere dall'operatore ed è insensibile ad una steatosi lieve. Uno standard di riferimento più sensibile e quantitativo per stimare il contenuto di grassi nel fegato - la spettroscopia di risonanza magnetica protonica (1H- MRS) - è stato utilizzato per ricavare il punteggio di steatosi epatica nella NAFLD (NAFLD-LFS). L’algoritmo per il calcolo del punteggio include la presenza della sindrome metabolica e del diabete mellito di tipo 2, la concentrazione di insulina a digiuno, i livelli sierici di AST e il rapporto AST/ALT.

76 Qui di seguito viene riportata l’equazione per il calcolo del NAFLD-LFS:

NAFLD-LFS =  2,89 + 1,18 × sindrome metabolica (si=1 / no=0) + 0,45 × diabete di tipo 2 (si=2 / no=0) + 0,15 × [insulina] (mU/L) + 0,04 × AST (U/L)  0,94 × AST/ALT (Fedchuk et al. 2014).

Il punteggio di steatosi epatica nella NAFLD (Wong et al.2018) ha una precisione molto buona per diagnosticare il fegato steatosico, che è definito come un contenuto di grasso nel fegato ≥ 5,56%. L'inclusione nella formula del livello dell’insulina sierica, che non è un test di routine, può limitare il suo più ampio uso clinico. Per predire la steatosi epatica sono anche disponibili tests con parametri più specializzati. Lo SteatoTest (Biopredictive, Paris, France) è stato costruito utilizzando una combinazione delle sei componenti dei FibroTest- ActiTest. Questo test prende in considerazione i livelli sierici di bilirubina totale, di GT, di α2-macroglobulina (α2m), di aptoglobina, di ALT e di apolipoproteina AI, più BMI e livelli sierici di colesterolo totale, di trigliceridi e di glucosio normalizzati per l’età e per il sesso.

Lo SteatoTest ha una precisione moderata nel predire la steatosi epatica verificata poi dalla biopsia. A parte il costo dei test biochimici, vi è un costo aggiuntivo per il calcolo dei punteggi utilizzando la formula brevettata dello SteatoTest. Nell'ultimo decennio, la disponibilità delle cartelle cliniche elettroniche ha facilitato gli studi epidemiologici su larga scala. Tuttavia, sebbene i dati demografici e di laboratorio in tali registri siano robusti, spesso mancano osservazioni cliniche e misurazioni antropometriche. Per facilitare la ricerca nel registro, è stato sviluppato il punteggio del picco della NAFLD (Yip et al.2017) utilizzando un metodo di tipo statistico basato su parametri di laboratorio quali livelli sierici di ALT, di colesterolo HDL, di trigliceridi, di emoglobina A1c (HbA1c) e la conta dei leucociti e dati di comorbilità (e presenza di ipertensione). Usando 1H-MRS come standard di riferimento, il punteggio del picco della NAFLD ha una buona precisione generale e un eccellente valore predittivo negativo del 96% per escludere la NAFLD. Tuttavia questi indici sono meno accurati nel valutare le variazioni del grasso epatico nel tempo (Keating et al. 2017). La tabella 2 illustra un sommario dei tests attualmente disponibili per la valutazione e l’approccio diagnostico della NAFLD.

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Tabella 2 Test per la diagnosi di NAFLD (Wong et al. 2018).

Test Valore predittivo positivo leggermente inferiore (69%) Non può distinguere i gradi di steatosi ALT, HDL-C, TG, HbA1c, WBC ed ipertensione Punteggio del picco della NAFLD FibroTest- ActiTest non disponibili in tutte le regioni, quindi limitata disponibilità; costo elevato Non può distinguere i gradi di steatosi I sei componenti di FibroTest- ActiTest più BMI, colesterolo, TG e glicemia normalizzati per età e per sesso SteatoTest L’insulina è un test non di routine, quindi di limitata disponibilità Poco specializzato per prevedere la steatosi epatica SM, DM di tipo 2, insulina sierica a digiuno, AST sierica a digiuno e rapporto AST/ALT Gold stardard subottimale (basato solo su ultrasonografia) Non può distinguere i gradi di steatosi Rapporto AST/ALT, BMI, sesso femminile e DM Punteggio di steatosi epatica nella NAFLD Indice di steatosi epatica (HSI) Gold stardard subottimale (basato solo su ultrasonografia) Non può distinguere i gradi di steatosi BMI, circonferenza vita, TG e GT Indice di fegato steatosico (FLI) Limitazioni Accuratezza Descrizione

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4.4.2 Diagnosi di NASH

La patogenesi del danno epatico nella NASH è complessa (Wong et al.2018) e coinvolge numerose alterazioni ormonali, cellulari e molecolari. Questa complessità ha portato all'esame di una moltitudine di potenziali biomarcatori di NASH che riflettono i percorsi patologici sottostanti, tra cui apoptosi epatocellulare, infiammazione, stress ossidativo e segnalazione anomala di adipochina. I livelli sierici di amminotransferasi rimangono il parametro del sangue più comunemente usato per la valutazione di una patologia epatica cronica, compresa la NASH; tuttavia, i livelli di ALT isolati sono poco predittivi della NASH e si correlano meglio con i livelli di trigliceridi epatici.

La morte dell'epatocita attraverso l'apoptosi o la necroptosi è aumentata in NASH rispetto alla semplice steatosi e porta al rilascio di frammenti di citocheratina 18 (CK18, noto anche come KRT18). CK18 è la principale proteina dei filamenti intermedi all'interno degli epatociti ed è scissa durante l'inizio della morte cellulare con conseguente rilascio extracellulare. I livelli sierici sia dei frammenti di CK18 che della proteina CK18 intatta possono essere misurati con saggi ELISA a sandwich che utilizzano anticorpi M30 ed M65. Mentre M30 misura la CK18 proteolizzata dalle caspasi che viene prodotta durante l’apoptosi, M65 misura sia la CK18 proteolizzata dalle caspasi che la CK18 intatta che viene rilasciata dalle cellule che vanno incontro a necrosi. Nei pazienti con NAFLD, i livelli di M30 sono correlati all'infiammazione epatica e al ballooning e mostrano nel tempo un andamento parallelo al miglioramento istologico. (Vuppalanchi et al. 2014). Tuttavia alcuni studi (Wong et al.2018) hanno suggerito che questo biomarcatore non è sufficientemente accurato per l'uso clinico. Per aumentare l'utilità diagnostica, la CK18 è stata combinata con livelli sierici di FAS11 (sFAS), antigene di superficie che media l'apoptosi, e che è coinvolto nell'attivazione della via dell'apoptosi estrinseca negli epatociti. Uno studio abbastanza limitato (Tamimi et al. 2011) ha dimostrato che la combinazione dei livelli di M30 e di sFAS ha un'accuratezza ragionevole ad eccellente; tuttavia, sono richiesti ulteriori studi di convalida.

L'infiammazione è una delle caratteristiche istologiche della NASH, e quindi i livelli sierici di molti marcatori e mediatori dell'infiammazione, tra cui la proteina C-reattiva (CRP),

11

79 TNF, IL-6 e IL-8, proteina antagonista del recettore IL-1 (IL-1RA ) e chemochina-CXC-10 (CXCL10), sono stati esaminati come markers diagnostici. Poiché la NASH è associata ad uno stato metabolico infiammatorio sottostante, questi markers potrebbero non essere specifici per l'infiammazione epatica (Wong et al.2018). In particolare, uno studio su 648 pazienti con NAFLD sottoposti a biopsia, che ha testato l'utilità diagnostica di 32 biomarcatori plasmatici, inclusi molti markers infiammatori, ha rilevato che i livelli di IL- 8, IL-1R solubile tipo 1 (IL-1R1), l'inibitore 1 totale dell’attivatore del plasminogeno (PAI1) ed il PAI1 attivato (aPAI1) erano associati alla NASH (Ajmera et al. 2017).

Tuttavia, solo aPAI1 è rimasto predittivo di NASH dopo aggiustamento per i fattori clinici e metabolici. L’aPAI1 è un inibitore della fibrinolisi e potrebbe collegare la NASH con un aumento del rischio cardiovascolare attraverso il suo effetto sulla coagulazione. È improbabile che aPAI1 sia sufficientemente diagnostico da solo e si attendono ulteriori studi che esaminino la sua utilità diagnostica in combinazione con altri marcatori.

Lo stress ossidativo è uno dei principali meccanismi patogenetici del danno epatico nella NASH e porta all'ossidazione dei lipidi e alla generazione di prodotti sierici che possono essere misurati. Studi lipidomici che utilizzano la spettroscopia di massa hanno trovato prodotti di ossidazione lipidica associati alla NASH, compresi i prodotti di ossidazione dell'acido arachidonico [acido 11-idrossieicosatetraenoico (11-HETE)] e prodotti di ossidazione dell'acido linoleico [acidi 9- e 13-idrossioctadecadienoici (9- e 13-HODE) ed acidi 9- e 13-oxo-ottadecadienoici (9– e 13-oxo-ODE] (Puri et al. 2009, Feldstein et al. 2010). La combinazione del rapporto acido linoleico/13-HODE più età, BMI e AST forma il punteggio oxNASH, che è stato validato per l’abilità di fornire ragionevole accuratezza diagnostica per la NASH. Tuttavia, il costo e la necessità di attrezzature specializzate e di trattamento dei campioni attualmente limitano la diffusa applicazione dei prodotti dell’ossidazione lipidica come strumento diagnostico per la NASH.

Una serie di ormoni coinvolti nel metabolismo dei lipidi e del glucosio sono alterati nella NASH, comprese le adipochine [adiponectina, leptina, resistina, visfatina (nota anche come NAMPT)], la proteina 4 che lega il retinolo (RBP4), la proteina 4 che lega gli acidi grassi (FABP4) e gli ormoni derivati dal fegato, incluso il fattore 21 di crescita dei fibroblasti (FGF21). Questi ormoni potrebbero essere coinvolti nella patogenesi del danno

80 epatico; tuttavia, i livelli sierici potrebbero anche riflettere le anormalità metaboliche associate come l'adiposità viscerale e quindi potrebbero non essere specifici per la NASH. Di conseguenza, ci sono studi contrastanti riguardo l'associazione indipendente tra adipochine e NASH (Wong et al.2018). Al contrario, una meta-analisi pubblicata nel 2017 (He et al. 2017) ha dimostrato un'associazione coerente tra i livelli sierici di FGF21 e la NASH. Tuttavia, questo biomarcatore è solo modestamente sensibile e specifico, con valori aggregati rispettivamente del 62% e del 78%. La ferritina è considerata una proteina della fase acuta ed è comunemente aumentata nei pazienti con NAFLD e sindrome metabolica. Studi precedenti (Kowdley et al. 2012) hanno dimostrato un'associazione tra iperferritinemia e fibrosi avanzata in pazienti con NAFLD. L'aggiunta di biomarcatori di fibrosi non prioritari e/o specifici potrebbe anche aumentare l'accuratezza diagnostica di questo biomarcatore per la NASH. A causa della modesta accuratezza dei singoli marcatori della NASH, sono state esaminate combinazioni di marcatori per aumentare la loro complessiva utilità diagnostica. NASH Test (Biopredictive) è un algoritmo brevettato costituito da una combinazione di età, sesso, altezza, peso e livelli sierici di trigliceridi, colesterolo, α2m, apolipoproteina AI, aptoglobina, GT, ALT, AST e bilirubina totale. Successivamente è stato sviluppato il NASH Diagnostic Panel (comprendente presenza di diabete mellito, sesso, BMI e livelli sierici di trigliceridi, di frammenti di CK18 e di CK18 totale), che può diagnosticare la NASH con una certa precisione. Entrambi questi pannelli sono stati sviluppati in un numero piuttosto piccolo di pazienti con obesità, e quindi è necessaria un'ulteriore convalida. In un approccio diverso, un altro pannello che utilizza la combinazione dei livelli sierici di CK18 e di FGF21 ha prodotto valori di specificità e sensibilità elevati in più del 90% delle NASH quando si applicavano valori di cut-off ottimali, ma questo era al costo di valori indeterminati in ~ 70% di pazienti (Wong et al.2018). I livelli sierici di CK18 sono stati associati anche con i livelli sierici di catepsina D (CTSD), un biomarcatore proteico (tabella 3).

81 Biomarcatori

del sangue e pannelli

Tabella 3 Biomarcatori sanguigni della NASH (Wong et al. 2018).

Markers di apoptosi

Svantaggi Vantaggi

Candidati

La maggior parte sono dosabili mediante saggi commercializzati, FGF21 dinamica rispetto ai cambiamenti nel tempo della NAFLD nel tempo

Analisi commerciale disponibile, dinamica rispetto ai cambiamenti nel tempo della

NAFLD

Interpretazione diversa negli adulti e nei bambini, validazione limitata Precisione limitata dall'isolamento, validato principalmente solo nelle popolazioni bariatriche Servono ulteriori validazioni, richiedono la spettroscopia di massa Precisione da buona a eccellente in piccoli studi

Non validati come marker diagnostici, potrebbero essere influenzati dall'infiammazione sistemica Precisione limitata dall’isolamento, cut-off ottimali incerti, scarsa sensibilità

Correlato con l'attività infiammatoria della NASH, i test per la maggior parte dei marcatori sono disponibili in commercio CK18 totale e frammenti, sFAS, CK18 è il biomarcatore del sangue più

validato, saggi disponibili in commercio, correlato con il miglioramento istologico nel tempo

Catepsina D Adiponectina, Leptina, Resistina, Visfatina, RBP4, FABP4, FGF21 11-HETE, 9- HODE, 13- HODE, 13- oxo- ODE, LA−13-HODE (oxNASH score), 11,12- diHETrE CRP, TNF, IL-8, CXCL10 Frammenti della CK18, CK18 totale, sFAS Enzimi lisosomiali Ormoni e adipocitochine Prodotti dell’ ossidazione lipidica Markers infiammatori

82

4.4.3 Diagnosi di fibrosi

La maggior parte dei biomarcatori non prioritari di fibrosi non misura direttamente la fibrogenesi o la fibrinolisi. Spesso rappresentano processi biologici associati a fattori di rischio di fibrosi e sono comunemente eseguiti e poco costosi. Tuttavia, tali biomarcatori indiretti sono in genere meno precisi dei biomarcatori che misurano direttamente la fibrogenesi o la fibrinolisi. Per compensare la ridotta precisione, la maggior parte degli investigatori usa un pannello di biomarcatori. Nel complesso, sebbene questi pannelli abbiano una precisione modesta, molti, ai cut-off proposti, hanno valori predittivi negativi di oltre il 90% escludendo la fibrosi o la cirrosi avanzata. Sono, tuttavia, meno affidabili di altri metodi per discriminare tra gli stadi della fibrosi. Il rapporto AST/ALT e l’indice del rapporto AST/piastrine (APRI) sono stati derivati inizialmente da coorti di epatite C cronica. Sono semplici da calcolare, ma hanno una bassa precisione nella diagnosi di fibrosi avanzata e cirrosi nei pazienti con NAFLD. L'indice di Fibrosis-4 (FIB-4) comprende età, AST, ALT e conta piastrinica ed è calcolato con una formula più complicata; ha una moderata accuratezza, che è paragonabile a quella del punteggio della fibrosi della NAFLD (Wong et al.2018). Il punteggio della fibrosi della NAFLD è stato derivato e validato specificatamente nei pazienti con NAFLD sottoposti a biopsia (Angulo et al. 2007). La formula comprende età, BMI, presenza di glucosio a digiuno alterato o diabete mellito, rapporto AST/ALT, conta piastrinica e livelli di albumina sierica. Anche il punteggio BARD (calcolato da BMI, rapporto AST/ALT e presenza di diabete mellito) è stato derivato da una grande coorte americana di NAFLD. Gli studi di validazione

La maggior parte della validazione è stata effettuata nelle popolazioni bariatriche, alto costo, variazione sconosciuta o dinamica ai cambiamenti dell’istologia Disponibile in commercio, da moderato ad alto grado di precisione, affidabile NASHTest NASH pannello diagnostico Pannelli combinati

83 successiva hanno dimostrato una moderata accuratezza del puntenggio BARD nella rilevazione della fibrosi allo stadio F3 (Harrison et al. 2008). Sebbene questi punteggi siano meno precisi rispetto ai marker di fibrosi specifici, hanno un'elevata applicabilità, poiché i componenti sono tutti prontamente disponibili per i medici. Sebbene alcuni punteggi richiedano calcoli complessi, la disponibilità di calcolatori online e corrispondenti app ha reso questo ostacolo meno rilevante. Inoltre, questi punteggi hanno un alto valore predittivo negativo nell'escludere la fibrosi avanzata e gli eventi epatici correlati e sono quindi strumenti di screening ragionevoli, in particolare quando non sono disponibili test più sofisticati (Tabella 4).

I marcatori specifici di fibrosi, invece, riflettono fibrogenesi e/o fibrinolisi. Sebbene vi sia una sovrapposizione di valori tra gli stadi della fibrosi, alcuni pannelli brevettati (come ad esempio FibroTest e FibroMeter) forniscono l'esatto stadio della fibrosi previsto nel rapporto. La fibrosi epatica si sviluppa attraverso la deposizione epatica di matrice extracellulare (ECM), di cui l'acido ialuronico (HA), un polisaccaride non proteoglicanico, è una componente importante. Altri componenti principali dell'ECM comprendono i proteoglicani (come l’eparan solfato, il condroitin solfato ed il cheratan solfato), il collagene, l’elastina, la fibronectina e la laminina. Il peptide amminoterminale del procollagene III (PIIINP) nel siero è derivato dalla sintesi di nuovo collagene di tipo III o dalla degradazione delle fibrille di collagene di tipo III esistenti; i livelli di PIIINP da soli non sono un buon marker diagnostico per la fibrosi epatica nella NAFLD o nell’epatopatia alcolica (Wong et al.2018). Un ELISA competitivo per l’epitopo specifico del PIIINP, cioè Pro-C3, riflette la vera formazione del collagene di tipo III, poiché misura il propeptide scisso dalla molecola di collagene intatta ed è specifico per il collagene epatico (Nielsen et al. 2013). I livelli elevati nel siero di Pro-C3 sono correlati con i componenti chiave della