7.1 RACCOLTA DEI CAMPIONI
In totale sono stati raccolti 44 prodotti ittici (pesci, molluschi cefalopodi, molluschi bivalvi e crostacei) di cui 23 prodotti freschi campionati sfusi presso la Piattaforma Deposito (PD) di un’azienda GDO e 21 (7 conserve, 11 articoli surgelati, 2 salati ed infine 1 prodotto fresco) acquistati presso diversi punti vendita della stessa catena commerciale. Tutti i prodotti sono stati trasferiti in laboratorio immediatamente dopo l’acquisto o il prelievo in PD. All’arrivo ciascun prodotto è stato registrato con un codice interno e fotografato. Tutte le informazioni relative alla denominazione del prodotto, provenienza, area di cattura/acquacoltura, riportate in etichetta, sulle confezioni e sui documenti di accompagnamento, sono state registrate e raccolte in tabella (Appendice, Tab.I).
Il numero totale di campioni da sottoporre ad analisi è stato standardizzato in funzione del numero di esemplari o porzioni che componevano i singoli prodotti. Nel caso di prodotti costituiti da 1-3 esemplari o porzioni il campionamento di tessuto è stato effettuato su tutte le aliquote; in presenza di un numero maggiore di aliquote il campionamento è stato condotto in modo casuale su 3 porzioni o esemplari distinti. Le aliquote di tessuto prelevate sono state successivamente stoccate a -20°C fino all'estrazione del DNA.
7.2. ESTRAZIONE DEL DNA TOTALE
Per 1-3 campioni di ciascun prodotto da analizzare l’estrazione del DNA è stata condotta attraverso l’applicazione del protocollo salting out proposto da Armani et al., 2011 e Armani
et al., 2014. La procedura è stata effettuata a partire da circa 150 mg di tessuto prelevato da
ogni aliquota, precedentemente scongelata a temperatura ambiente.
7.3 VALUTAZIONE QUALI-QUANTITATIVA E DELL’INTEGRITÀ DEL DNA ESTRATTO
La valutazione quali-quantitativa del DNA estratto dai campioni è stata effettuata con micro- spettrofotometro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fisher Scientific), misurandone l’assorbanza a 260 nm. Il grado di purezza del DNA è stato stimato in relazione ai rapporti di assorbanza A260/280 nm e A260/230 nm. In particolare, il rapporto A260/A280 è stato utilizzato per
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valutare la contaminazione da proteine, mentre il rapporto A260/A230 per valutare la presenza di alcuni acidi organici (fenoli, nucleotidi liberi) ed altri componenti come polipeptidi a basso peso molecolare, mucoproteine o mucopolisaccaridi.
Il valore ottimale per entrambi i parametri è stato settato, in accordo con le indicazioni del produttore, intorno a 2 (http://www.nanodrop.com/Library/T009-NanoDrop%201000-&- NanoDrop%208000-Nucleic-Acid-Purity-Ratios.pdf).
Per verificarne il livello di integrità, 1 μg di DNA totale estratto da ciascun campione è stato sottoposto quindi ad elettroforesi su gel d’agarosio 1% (GellyPhorLE® Euroclone, Life Sciences Division PV, Italia) precedentemente colorato con GelRedTM Nucleid Acid Gel Stain 10000X w. solution (Biotium, Hayward, CA, USA). La corsa elettroforetica è stata effettuata con un voltaggio di 200V, per 50 minuti. La visualizzazione del pattern elettroforetico è stata effettuata tramite transilluminazione UV. Il livello di frammentazione del DNA è stato valutato tramite comparazione con i marker molecolari Standard SharpMassTM 50 DNA ladder e SharpMassTM 1-DNA ladder (Euroclone, Life Sciences Division, PV, Italia).
7.4 SELEZIONE DEI PRIMERS, AMPLIFICAZIONE E SEQUENZIAMENTO La selezione dei target analitici, mitocondriali e nucleari, è stata effettuata in relazione alla tipologia di prodotto (pesce, cefalopode, mollusco bivalve o crostaceo) e al grado di frammentazione evidenziato attraverso l’elettroforesi.
I primers utilizzati (Tab.7.A), sotto elencati, sono distinti in due categorie in funzione della lunghezza dell’amplicone atteso.
Primers per l’ottenimento di un amplicone > di 500 pb:
Coppia COI-H (Handy et al., 2011), per l’ottenimento di un frammento di lunghezza pari a 655 pb del gene mitocondriale COI;
Coppia COI-M (Mikkelsen et al., 2006), per l’ottenimento di un frammento di lunghezza pari a 667 pb del gene mitocondriale COI.
Coppia 16S-P (Palumbi, 1996), per l'ottenimento di un frammento di lunghezza di circa 570 pb del gene mitocondriale 16S rRNA;
Coppia PK (Tsang et al., 2008), per l’ottenimento di un frammento di lunghezza pari a 595 pb del gene nucleare PEPCK.
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Primers per l’ottenimento di un frammento breve (minibarcode) < di 250 pb:
Coppia COI-A (Armani et al., 2015a), per l’ottenimento di un frammento di lunghezza pari a 135 pb del gene mitocondriale COI;
Coppia 16S-A (Armani et al., 2015b), per l’ottenimento di un frammento di circa 117 pb del gene mitocondriale 16S rRNA.
Target Reference Primer forward Primer reverse Pb
COI Mikkelsen et al., 2006 COIF-ALT ACAAATCAYAARGAYATYGG COIR-ALT TTCAGGRTGNCCRAARAAYCA 708/667 Handy et al., 2011 FISH_COILBC: TCAACYAATCAYAAAGATAT YGGCAC FISH_COIHBC ACTTCYGGGTGRCCRAARAATCA 703/650 Armani et al., 2015a FISH_COILBC (Handy et al., 2011) REV SHORT -1 GYATNACTATRAAGAAAATTATTAC 190/135 PEPCK Tsang et al., 2008 PEPCK FOR2 GCAAGACCAACCTGGCCATG ATGAC PEPCK REV3 CGGGYCTCCATGCTSAGCCARTG 645/595 16S rRNA Palumbi, 1996 16SarL CGCCTGTTTATCAAAAACAT 16Sbr CCGGTCTGAACTCAGATCACGT 612/570 * Armani et al., 2015b FOR16S-2 CTTMGGTTGGGGCGACC REV16S-2 CTGTTATCCCTAGGGTAACT 155/117*
Tab 7.A: Sequenze dei primer utilizzati nello studio per l’ottenimento dei target analitici
La reazione di amplificazione è stata condotta in 20 μl con:
2 μl di buffer 10x (5Prime, Gaithersburg, USA),
1,25 U di PerfectTaq DNA Polymerase (5Prime, Gaithersburg, USA),
dNTP in concentrazione finale pari a 200 μM
Bovine Serum Albumin (BSA) (BioLabs Inc., New England) ad una concentrazione finale di 25 ng/μL ,
Primer Forward e reverse in conc finale variabile da 200 a 300 nM (Tab 7.B),
100 ng di DNA totale
Acqua Sterile (5Prime, Gaithersburg, USA) per portare a volume la reazione. In assenza di un prodotto di PCR utilizzabile, per l’amplificazione dei campioni di DNA estratti da alcuni prodotti appartenenti alle categorie dei crostacei e dei molluschi (bivalvi e cefalopodi) l’enzima e il buffer di reazione standard sono stati sostituiti con un enzima KlenTaq LA (DNA Polymerase Technology, Inc; USA) e relativo buffer, lasciando invariate le concentrazioni degli altri reagenti.
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Le concentrazioni finali dei primer nella miscela di reazione ed i programmi di amplificazione per ciascuna coppia di primers utilizzata sono riportati in Tabella 7.B.
FRAMMENTO >500 pb FRAMMENTO <250 pb Target di
amplificazione (COI-H) (COI-M) 16S-P PK COI-A 16S-A
Conc. Primer Forward FISHCOILBC_tsa 250nM COIFALT 250 nM 16sar-L 200nM PEPCK for2 200nM FISHLBC 300nM FOR16S-2 100nM Conc. Primer Reverse FISHCOIHBC_tsa 250nM COIRALT 250 nM 16sbr-H 200nM PEPCK rev3 250nM REVshorta 300nM REV16S-2 100nM Attivazione dell’enzima 94°C / 3 minuti* Temperatura e tempo per ogni ciclo (40 cicli) 94° / 30 s 53° / 30 s 72° / 35 s 94° / 30 s 47° / 30 s 72° / 30 s 94° / 25 s 57,5° / 15 s 72° / 2 s 94° / 30 s 59° / 30 s 72° / 35 s 94° / 25 s 51° / 30 s 72° / 10 s 94° / 30 s 53° / 20 s 72° / 20 s Elongation finale 72°C / 10 minuti*
Tab.7.B: Protocolli di PCR e concentrazioni finali di ciascuna coppia di primer utilizzata.*= La prima e
l’ultima fase (attivazione dell’enzima ed elongation finale) sono state impostate sulla base delle istruzioni fornite dal produttore (5 Prime, Gaithersburg, USA).a=primer dotato di coda nucleotidica Steffen 1996.
La presenza degli prodotti di amplificazione attesi è stata verificata mediante corsa elettroforetica di 5 μl di prodotto di PCR su gel di agarosio al 2%, confrontando la lunghezza dei frammenti con la scala dell’indicatore Standard SharpMassTM 50-DNA (Euroclone, Life Sciences Division, PV, Italia).
I prodotti di PCR sono stati purificati con kit enzimatico EuroSAP (Euroclone SPA, Milano) e stoccati a -80°C fino all’invio ad un laboratorio esterno per il sequenziamento.
7.5 ANALISI DELLE SEQUENZE POST SEQUENZIAMENTO ED IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE
Le sequenze ottenute sono state analizzate con il programma ClustalW all’interno del software BioEdit 7.0.9.0 e corrette manualmente dopo un’analisi visiva. Successivamente sono state confrontate con quelle di campioni di riferimento disponibili attraverso l’applicazione dell’algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Tool) e della funzione BOLD ID’s accessibili sui portali NCBI e BOLD.
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Per l’analisi comparativa sul gene COI, i campioni sono stati considerati identificati a livello di specie nel caso in cui sia stato raggiunto un valore di identità di almeno il 98% (Barbuto et al., 2010).
Per il gene 16S rRNA, che presenta un maggior grado di conservazione interspecifica (minor tasso di mutazione genica), l’identificazione specie specifica è stata attribuita solo per valori d’identità pari al 99-100% (Armani et al., 2015).
La stessa soglia di cut-off è stata applicata anche per il gene PEPCK.
7.6 CONFRONTO DEI DATI MOLECOLARI CON LE INFORMAZIONI RIPORTATE IN ETICHETTA
I risultati ottenuti dall’analisi molecolare sono stati confrontati con le informazioni riportate in etichetta al fine di valutare il grado di mislabeling.
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