della valutazione quali-quantitativa sul DNA estratto per le diverse categorie di prodotto

analizzato

8.2.2 FRAMMENTAZIONE DEL DNA

Per la quasi totalità dei campioni analizzati, l’elettroforesi del DNA totale ha confermato una buona qualità degli acidi nucleici estratti con un basso grado di frammentazione. L’unica eccezione è riferibile ai prodotti trasformati, in cui è stato messo in evidenza un livello di frammentazione medio-elevato con frammenti del DNA mai superiori a 500 pb (Fig.8.A).

Fig 8.A: Visualizzazione UV risultato elettroforesi

del DNA totale estratto dai GDO trasformati. 1. GDO 34; 2. GDO 35; 3. GDO 36; 4. GDO 37; 5. GDO 38; 6. GDO 39; 7. GDO 40; L. SharpMassTM

50 DNA ladder, EuroClone SPA; C. Controllo

(campione di DNA totale estratto da tessuto fresco di Thunnus albacares). Gel d’agarosio 1% pre stained con GelRed 10000x

La degradazione riscontrata può essere ricondotta all’utilizzo di temperature e pressioni elevate nelle fasi di lavorazione per l’ottenimento dei prodotti in conserva.

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Entrambi i fattori sono direttamente responsabili di fenomeni di depurinazione, idrolisi e ossidazione con conseguente frammentazione del DNA totale (Armani et al., 2015; Teletchea 2009).

8.2.3 EFFICIENZA DI AMPLIFICAZIONE ED OTTENIMENTO DEI TARGET PER IL SEQUENZIAMENTO

Tutti i campioni di DNA estratto sono stati amplificati con successo, ad eccezione del GDO 23 per il quale non è stato ottenuto alcun prodotto di PCR utilizzabile con nessuna delle coppie di primer selezionate per lo studio dei differenti target molecolari (Tab.8.C).

Categoria di prodotto Target > 500 pb Target <500pb

COI-H COI-M PK 16S-P COI-A 16S-A

Pesce fresco 32 Pesce congelato 14 Pesce salato 3 Pesce trasformato 14 3 M. cefalopodi freschi 19 M. cefalopodi congelati 1 3 M. bivalvi congelati 6 Crostacei congelati 3 3 TOTALE 49 26 3 6 14 3

Tab.8.C: Prodotti di PCR ottenuti con le diverse coppie di primer per le singole categorie.

Il gene COI è stato considerato il target d’elezione per l’amplificazione dei campioni di DNA appartenenti a tutte le categorie. A tal fine sono state selezionate due coppie di primer (Handy

et al., 2011; Mikkelsen et al., 2007) già proposte e verificate per l’amplificazione di

vertebrati ed invertebrati. In assenza di un prodotto di PCR inviabile al sequenziamento sono stati introdotti due target genici alternativi: 16S rRNA e PEPCK.

In particolare, un frammento del gene PEPCK, codificante per l’enzima fosfo-enol-piruvato carbossichinasi, è stato selezionato per l’amplificazione dei campioni di DNA estratti da crostacei, in quanto già verificato in studi precedenti come target discriminante di specie all’interno delle famiglie Penaeidae e Solenoceridae (Ma et al., 2009; Tsang et al., 2008).

Per il campione GDO 32 in cui il prodotto di PCR ottenuto dall’amplificazione del frammento PEPCK non è stato ritenuto utilizzabile per il successivo sequenziamento, l’analisi è stata ripetuta con la coppia di primer Palumbi, 1996 al fine di amplificare il frammento lungo del 16S rRNA.

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Dato l’elevato grado di frammentazione riscontrato durante l’elettroforesi del DNA totale, i campioni ottenuti dai prodotti trasformati sono stati amplificati utilizzando il protocollo mini

barcode. Anche in questo caso il gene COI è stato considerato il target d’elezione,

eventualmente sostituito con il 16S rRNA in assenza di un prodotto di PCR sequenziabile (GDO 34).

Per alcuni campioni estratti da molluschi bivalvi, cefalopodi e crostacei, a dispetto della buona qualità del DNA totale estratto, la concentrazione dei prodotti di PCR ottenuti con polimerasi standard è risultata inferiore al valore minimo richiesto per la reazione di sequenziamento.

Tale dato può essere ricondotto alla presenza di inibitori in grado di interferire con l’aggancio dell’enzima polimerasi sul sito di annealing dei primer e direttamente o indirettamente responsabili della sua inattivazione (Schrader et al., 2012; Radstrom et al., 2004).

Alcune molecole, come l’albumina serica bovina (Bovine Serum Albumin-BSA), DNA-

binding protein gp32, Di Metil Sulfossido (DMSO) e la Betaina, possono essere introdotte

nella miscela di reazione come facilitatori dell’attività polimerasica (Radstrom et al., 2005; Kreader, 1996). Allo scopo, nello studio, tutte le reazioni sono state implementate con 25 ng/μL di BSA.

Oltre ai suddetti mucopolisaccaridi e mucoproteine presenti nel DNA estratto dai molluschi, altre molecole inibenti, potenzialmente responsabili della ridotta efficienza riscontrata in fase di amplificazione, potrebbero essere rappresentate da polifosfati, solfiti e correttori di acidità, comunemente utilizzati ed autorizzati come additivi nella preparazione di crostacei e molluschi surgelati (Parte E, Allegato Reg UE 1129/2011 che modifica l’allegato II del

Reg CE 1333/2008 relativo agli additivi alimentari). Tutte le tipologie di reagenti, inoltre,

date le caratteristiche di solubilità equivalenti a quelle degli acidi nucleici, tendono a precipitare e legarsi con il DNA in fase di estrazione, determinandone la parziale ossidazione o la parziale alterazione strutturale (Schrader et al., 2012).

Al fine di ottimizzare la reazione di PCR e superare gli effetti inibitori ed ossidativi di tali molecole, nello studio, per questi campioni, la Taq Polimerasi standard è stata sostituita con la OmniKlen Taq LA (DNA Polymerase Technology, Inc, USA), una polimerasi mutante specificamente formulata per l’amplificazione di campioni di DNA estratti da sangue, suolo e matrici complesse (http://www.klentaq.com/products/klentaq_la).

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8.3 ANALISI POST-SEQUENZIAMENTO ED IDENTIFICAZIONE MOLECOLARE DI SPECIE

Tutti i 101 prodotti di PCR (Tab.8.C) inviati al laboratorio esterno per il sequenziamento hanno restituito sequenze utilizzabili.

Le sequenze grezze ottenute sono state allineate, analizzate utilizzando il programma Clustal W in BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999) e corrette manualmente dopo analisi visiva per l’ottenimento della sequenza target finale. Per quanto riguarda il target COI la lunghezza media delle sequenze ottenute per il frammento lungo è stata di 620 pb con i primer COI-H e di 580 pb con i primer COI-M, corrispondenti rispettivamente al 95% e all’87% della lunghezza massima attesa. Per quanto riguarda il mini barcode nel 78% dei campioni è stata ottenuta una sequenza di 139 pb corrispondente alla lunghezza massima attesa. La sequenza completa (595 pb) è stata ottenuta anche per i prodotti di PCR amplificati con la coppia PK. Per quanto riguarda il target 16S rRNA, la lunghezza media delle sequenze ottenute sul frammento lungo (16S-P) è stata di 444 pb corrispondente al 78% dell’amplicone medio atteso. Infine, per il frammento corto le tre sequenze prodotte corrispondono al frammento completo (16S-A).

L’ottenimento di sequenze di lunghezza pari o non molto distante da quella dell’amplicone atteso ha confermato l’efficienza del protocollo utilizzato nella prima fase analitica.

Le sequenze finali sono state utilizzate per l’analisi di confronto con le sequenze di riferimento depositate in Genbank e BOLD, applicando rispettivamente l’algoritmo BLASTn e identification system (ID’s) al fine di identificare ciascun campione a livello molecolare.

L’analisi comparativa condotta sulle sequenze COI ha permesso l’identificazione specie specifica per il 93% (83/89) dei campioni analizzati ovvero del 94% (46/49) delle sequenze ottenute con il target COI-H, l’88% (23/26) delle sequenze ottenute con il COI M ed 100% (14/14) con il mini barcode COI-A.

L’analisi comparativa condotta sulle sequenze 16S rRNA ha permesso l’identificazione specie specifica per il 33% (3/9) dei campioni analizzati. In questo caso infatti per tutte le sequenze ottenute con il frammento target lungo (16S-P) non è stato raggiunto il valore soglia del 99-100% discriminante di specie. Tale dato è attribuibile alla mancanza di sequenze di riferimento depositate per le specie d’interesse. Al contrario, l’identificazione di specie con valori del 99-100% d’identità è stata raggiunta per tutte le sequenze ottenute con l’applicazione del protocollo mini barcode (16S-A).

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Infine tutte le sequenze (3/3) ottenute dall’amplificazione con la coppia PK hanno restituito valori d’identità del 100% permettendo il raggiungimento d’identificazione specie specifica inequivocabile.

Anche in assenza di un’identificazione specie specifica per 19 campioni analizzati appartenenti a 7 prodotti distinti, i dati molecolari raccolti sono stati ritenuti sufficientemente informativi per il successivo confronto con le informazioni riportate in etichetta e la valutazione delle non conformità.

8.4 CONFRONTO DEI DATI MOLECOLARI CON LE INFORMAZIONI RIPORTATE IN ETICHETTA

Per l’analisi di confronto, in funzione delle tipologie di prodotto raccolte in fase di campionamento, sono stati presi in considerazione le seguenti normative:

 Reg (UE) 1379/2013 relativo all'organizzazione comune dei mercati nel settore dei prodotti della pesca e dell'acquacoltura;

 Reg (CE) 1536/1992 che stabilisce norme comuni di commercializzazione per le conserve di tonno e di palamita;

 DM MIPAAF 31-01-2008 e successive modifiche relativo alle denominazioni in lingua italiana delle specie di interesse commerciale.

Dai risultati delle analisi effettuate si evincono 9 non conformità di etichettatura con sostituzione di specie o genere corrispondenti al 18,8% (19/101) dei campioni analizzati (Tab.8.D).

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