Metodi analitici per la determinazione delle ammine biogene

Vari metodi sono stati sviluppati per la determinazione qualitativa e quantitativa delle ammine biogene in varie matrici alimentari. Tutti questi metodi constano di tre fasi:

1. estrazione;

2. purificazione e concentrazione dell’estratto; 3. identificazione e determinazione degli analiti.

L’estrazione delle ammine, generalmente acida, rappresenta la fase critica del processo in quanto influisce negativamente sui recuperi analitici. Essa è necessaria a causa della complessità delle matrici, della presenza di composti interferenti e della presenza simultanea di più ammine biogene nella stessa matrice. La fase di estrazione deve essere il più selettiva e quantitativa possibile, riducendo al minimo le sostanze interferenti co- estratte. A partire da una matrice solida, l’estrazione prevede solitamente una omogeneizzazione in presenza di un acido diluito come l’acido perclorico, l’acido tricloroacetico, l’acido cloridrico, il metanolo e altri solventi organici.

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Lo step di purificazione si esegue, di seguito, per ridurre gli interferenti estratti e per ottenere un arricchimento della concentrazione dell’estratto. Questo processo è influenzato da diversi fattori come la natura della matrice, il pH dell’estratto, tipo di solventi usati nell’estrazione liquido-liquido e tipo di sale usato per la saturazione. I due processi di purificazione più utilizzati sono la ripartizione liquido-liquido e la ripartizione solido-liquido. La ripartizione liquido-liquido, che si effettua scegliendo diverse miscele di solventi organici, permette di allontanare gli interferenti idrofilici e trasferisce gli analiti in un solvente basso bollente facilmente eliminabile per evaporazione. Presenta però alcuni svantaggi come l’uso elevato di solvente organico, la possibile formazione di emulsioni e la difficile automatizzazione del processo.

La ripartizione solido-liquido (SPE : Solid-Phase-Extraction) si effettua scegliendo opportuni solidi adsorbenti che permettono di intrappolare gli interferenti dalla soluzione da analizzare. La scelta del materiale adsorbente è funzione del solvente in cui sono disciolte le ammine e dal tipo di sostanze interferenti da eliminare. Questa tecnica presenta diversi vantaggi come una ridotta manipolazione del campione e una notevole diminuzione dei volumi di solvente. I tipi di adsorbenti più utilizzati per le ammine biogene sono la silice chimicamente modificata con gruppi alchilici idrofobici a 8 o 18 atomi di Carbonio (C8 e C18 rispettivamente) o cartucce a scambio ionico.

Dopo aver concentrato il campione si passa alla fase di rivelazione che prevede l’uso di sistemi sensibili e selettivi.

I metodi di determinazione più utilizzati sono quelli cromatografici tra cui la cromatografia su strato sottile (TLC), la cromatografia a scambio ionico, la cromatografia gassosa (GC) e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) (Onal, 2013). Per quanto riguarda la cromatografia liquida si possono impiegare diversi tipi di rivelatori come l’UV-visibile, lo spettrofluorimetro e un rivelatore elettrochimico che richiedono una preventiva fase di derivatizzazione. La derivatizzazione pre- o post- colonna è necessaria nel caso vengano utilizzati rivelatori spettrofotometrici poiché non tutte le ammine hanno a disposizione gruppi cromofori. I più comuni derivatizzanti sono il dansil-cloruro (DNSCl), il dabsil-cloruro (DABSCl) e l’orto-ftalaldeide (OPA). Tra i diversi agenti derivatizzanti il dansil-cloruro viene utilizzato più frequentemente in quanto a differenza degli altri reagisce con tutti i tipi di ammine (primarie,secondarie e terziarie) formando derivati stabili (Charalampos 2008).

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Più recentemente, per eliminare la derivatizzazione, sono stati proposti metodi come l’elettroforesi capillare e tecniche ifenate come LC-MS (cromatografia liquida – spettrometria di massa) per la determinazione delle ammine biogene tramite iniezione diretta. La LC-MS permette di riconoscere la struttura chimica degli analiti, ha un’alta risoluzione ma richiede una strumentazione molto costosa e personale altamente specializzato.

Le tecniche GC e HPLC sono maggiormente utilizzate quando nella stessa matrice sono presenti più ammine biogene e quindi è necessario disporre di procedure analitiche che permettano la loro separazione ed identificazione nella stessa aliquota di estratto.

Tab. 4.4. Alcuni metodi HPLC per la determinazione delle ammine biogene

Ammine biogene Matrice Fase stazionaria

Fase mobile Derivatizzante/ Rivelatore

Reference

CAD PUT HIST TYR TRYP AGM ISO MET ETA

Vino rosso C 18 Acqua/ acetonitrile Cloruro di Dansile/ Fluorimetro Charalampos et al. 2007

CAD PUT HIST TYR 2-PHE ISO ETA SPD Vino rosso C 18 Acqua/ acetonitrile Cloruro di Dansile/ DAD Martuscelli et al. 2013

AGM, HIS, PEA, PUT, TRP, TYR Tonno in scatola HILIC UHPLC Formiato d’ammonio/ Acetonitrile MS Self et al. 2011 SPD, SPM, PUT, HIS, TYR, PEA

formaggi o C 18 Acqua/ acetonitrile Cloruro di Dansile/ UV λ = 254nm Restuccia et al (2011) PUT, HIS, TYR,

PEA, SPM, SPD, TRP Birra C18 Tampone acetato / acetonotrile 4-Chloro-3,5- dinitrobenzotri- fluoride (CNBF) UV λ = 254nm Tang et al., 2009

PUT, CAD, HIS, TYR, SPD, SPM Prosciutt o crudo C18 Acqua/acetornitr ile Cloruro di Dansile UV λ = 254nm Alfaia et al. (2004) PUT, HIS, TYR,

SPM, SPD, AGM, SYN, OCT succo di arancia C18 tampone acetato/acetonitr ile o-Phthalaldeide (OPA) fluorimetro Veira et l., 2007

In particolare, il metodo HPLC accoppiato con rivelatore UV è adatto per la separazione di composti non abbastanza volatili e termolabili, che quindi non possono essere separati con la GC. Importante è la scelta del rivelatore quando si utilizza il sistema HPLC. Il rivelatore UV è maggiormente utilizzato in quanto soddisfa esigenze di

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selettività, applicabilità e affidabilità, mentre il rivelatore fluorimetrico viene utilizzato principalmente nelle determinazioni delle singole ammine biogene essendo selettivo e sensibile a livello delle parti per bilione (ppb, µ g L-1 ). (Onal, 2013)

Un altro metodo che può essere utilizzato per la determinazione delle ammine biogene è la cromatografia su strato sottile (TLC). Si tratta di un metodo rapido, economico che presenta diversi vantaggi come la semplicità, la versatilità e l’applicabilità a un largo numero di campioni in poco tempo e bassi costi in termini di reagenti , ma non presenta una elevata sensibilità (Lapa-Guimaraes,2004).

Recentemente, ottimi risultati nella determinazione delle ammine biogene vengono raggiunti tramite la tecnica UPLC ( Ultra Performance Liquid Chromatography, che lavora con gli stessi principi della tecnica HPLC avendo però maggiore sensibilità, più alta risoluzione e permettendo analisi più veloci. Tuttavia questa è una strumentazione molto costosa quindi non disponibile per tutti i laboratori di analisi (Dadakova,2009).