Tecniche Isotopiche

La distribuzione di isotopi stabili in biomolecole è controllata da processi di frazionamento biotici e abiotici che vengono utilizzati per rivelare adulterazioni di vino, come lo zuccheraggio o l’aggiunta di acqua, o può essere usato per trarre informazioni sulla sua origine geografica.

Le analisi sul rapporto (D/H)1 sono effettuate attraverso NMR Site-specific Natural

Isotopic Fractionation (SNIF®), mentre i rapporti 18O/16O e 13C/12C sono misurati con lo spettrometro di massa a rapporto isotopico (IRMS) (Rossmann et al., 1996). La corrispondenza delle caratteristiche del vino con la sua etichetta viene poi valutata mediante comparazioni uni variate con una banca dati di campioni autentici, ufficialmente istituito dall'UE dal 1991 (CE, 1991a, b). Tuttavia, il confronto mediante analisi multivariata è stato dimostrato di essere superiore agli approcci univariati a causa della sua maggiore sensibilità e specificità (Dordevic et al., 2012).

3.3.4.1. Rapporto 13C /12C

Il più importante frazionamento biotico è quello di carbonio e idrogeno che si svolge durante la fotosintesi e la biosintesi di zucchero e il relativo etanolo.

Il 13C /12C dell'etanolo è influenzato dalla origine botanica dello zucchero fermentato, ed è più alto per le piante a cilclo C4 (ad esempio la canna e mais) che per quelle a ciclo C3

(ad esempio uva e barbabietole) (Dordevic et al., 2013).

Le normative europee (CE, 1990 1997, 2003) stabiliscono che il rapporto D/H nel gruppo metile dell’ etanolo (identificato con la notazione (D/H)1) è il metodo di

elezione per ottenere informazioni circa l'origine botanica dello zucchero fermentato. Valori tipici del rapporto (D/H)1 per le barbabietole, il vino e zuccheri di canna sono

91,5-93,5 ppm, 98-104 e 109-112 ppm, rispettivamente.

Il rapporto 13C/12C, spesso espressa come δ13C dal riferimento Pee Dee Belemnite (standard PDB che per definizione avere un valore δ13C di 0), è fondamentale in caso

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di adulterazioni di vino con zuccheri o di etanolo da mais e canna, perché fortemente influenzato solo da piante C4.

Riguardo all’uso di δ13C per identificare l’origine geografica del vino Dordevic e coautori (2013), hanno analizzato 5220 campioni di vino italiano raccolti per la costruzione del database di vino dell'UE nel periodo 2000-2010. I modelli di classificazione univariata sono stati caratterizzati da una sensibilità del 97,9%, ma solo il 35,2% di specificità, che è stato migliorato del 20% tramite la costruzione di modelli multivariati.

Un esempio recente della caratterizzazione dell’origine geografica con isotopi viene dal gruppo argentino di Di Paola-Naranjo et al., (2011) i quali hanno studiato 51 vini rossi autentici provenienti dalle regioni di Mendoza, San Juan e Cordoba i prodotti nel 2007 e nel 2008. Il δ13C ha mostrato i valori più bassi per la regione con più alta media di precipitazioni annuale, ma sono stati collegati anche ad altri diversi inputs sul suolo (es. il contenuto di sostanze organiche da piante C4 e C3).

3.3.4.2. Rapporto 18O/16O

Il razionale della applicazione di questo rapporto come marker di autenticità del vino è nel fatto che durante la maturazione delle uve il differente frazionamento dell’acqua nelle uve rende il rapporto 18O/16O dell’acqua dell’uva superiore a quella dell'acqua della terra trasportata attraverso le radici nei frutti.

L'applicazione principale del rapporto 18O/16O è l'identificazione di aggiunte di acqua di rubinetto o di pozzo nel mosto d'uva. Ad esempio per i campioni del Vino Italiano raccolti per la banca dati dell’UE nel periodo 2000-2010, l’ intervallo di confidenza al 95% per δ18O aveva come limiti -1.3 e 8.9, mentre l’acqua di falda -5 per le regioni meridionali e -9 per le settentrionali (Dordevic et al., 2013).

Il rapporto 18O/16O insieme al rapporto D/H del gruppo etilenico dell’ etanolo, identificato con la notazione (D/H)2 sono legati alle condizioni climatiche durante la

maturazione delle uve e, a sua volta, all’anno della vendemmia. La ragione di questa osservazione è nel più alto tasso di evaporazione dell'acqua nei climi caldi, che causa un arricchimento di 18O durante la maturazione delle uve. Il valore δ18O dell'acqua nel vino, che riflette il rapporto rispetto ad uno standard internazionale, Vienna standard Media Ocean Water (VSMOW), è particolarmente indicativa per l'origine geografica

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del vino. In climi caldi e secchi, come l'Australia, il Sud Africa e il sud della Spagna, si osservano valori elevati di δ18O (7.5, 8.5 e 6.0, rispettivamente), considerando che il Cile è mitigato dal clima costiero (δ18O = 3,5), e che l’Argentina è influenzata dal freddo clima continentale delle Ande che non favorisce tale arricchimento (δ18O = -1.0), rispetto all'Europa (δ18O = -0.5 / + 3.0) (Fauhl-Hassek, 2009).

Poiché la posizione della vigna gioca un ruolo importante nel determinare le condizioni climatiche durante la maturazione delle uve, i rapporti (D/H) 2, 18O/16O e, in misura

minore, 13C/12C possono determinare l’origine geografica dei vini.

A tale proposito va notato che la determinazione con questi parametri dell'anno di produzione di una data denominazione risulti più affidabile della distinzione tra denominazioni diverse ed inoltre l’effetti dell’annata di raccolta sul frazionamento isotopico rendono difficile l’uso di questo parametro per la distinzione tra denominazioni a lungo termine (Charlton et al., 2010).

L’introduzione del regolamento europeo 606/2009 (CE, 2009a), che permette la riduzione della concentrazione di etanolo fino al 2% vol/vol ha creato un problema nell’uso di questa tecnica. Infatti le procedure che consentono di ottenere tale scopo possono alterare i rapporti isotopici stabili nel vino, compromettendo la loro relazione con annata, provenienza geografica e verifica di adulterazioni. Recentemente, Fedrizzi et al. (2013) hanno studiato il problema, e una riduzione del 2% di etanolo ha causato una diminuzione di 0,9 ‰ nel δ18O nel vino Sangiovese, rispetto a una riduzione di solo 0,3 ‰ nei vini Chianti.

3.3.4.3. L’approccio metabolomico

A partire dagli anni Novanta, l'applicazione diffusa di tecniche per la ricerca metabolomica ha aperto una serie di possibilità per l'autenticazione di uva, mosto e vino. Questo approccio si concentra sulla serie completa dei metaboliti che pesano meno di 1500 Da nell’'uva, nel mosto o nel vino.

La grande maggioranza dei lavori in questo campo sono concentrati su caratteristiche come vitigno, origine e annata, e si basano su un pool di molecole coinvolte nello stesso ciclo metabolico, dando origine ad una indagine di profiling metabolico, la cui analisi non può che essere poi che effettuata tramite tecniche multivariate. Questo approccio

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appare particolarmente utile per la comprensione profonda del processo di vinificazione e per individuarne i punti di miglioramento.

Laghi et al., 2014 hanno osservato il profilo metabolomico tramite 1H NMR di vini Sangiovese da agricoltura biologica della regione Emilia-Romagna nel 2010-2012. L'annata è risultata avere l’ effetto maggiore sul profilo metabolomico con l'acido idrossifenil-piruvico e l’ alcool feniletilico caratterizzati dalla maggiore variabilità. Un'alternativa alle indagini sui profili metabolici sono rappresentati dall'approccio con il fingerprint metabolico per l'intero spettro NMR con l'applicazione di tecniche statistiche multivariata, che rientra nei metodi un-targeted.

Il vantaggio principale di questo approccio è, oltre alla mancanza di una fase di quantificazione intermedia, la possibilità di sfruttare le informazioni proposte da tutte le molecole che danno una segnale NMR, compresi quelli che non possono essere quantificati o neanche identificati. Un'applicazione interessante di 1H NMR per indagini con fingerprinting è la possibilità di discriminare vini monovarietali da miscele e, in questa ultima situazione, identificare la loro composizione. In un lavoro su quattro vini italiani: Montepulciano d'Abruzzo, Sangiovese, Cabernet e Merlot, mescolati in percentuali dal 10 al 70%, la LDA ha permesso la distinzione tra vini puri e miscelati, mentre la ANN l'identificazione della percentuale presente nelle miscele, con un10% di precisione (Imparato et al., 2011).

In un altro studio campioni di Lambrusco dolce e secco sono stati analizzati con 1H NMR, accoppiato con PLS-DA, attraverso un approccio fingerprinting, al fine di individuare le peculiarità di tre fonti varietali (Sorbara, Salamino di Santa Croce e Grasparossa di Castelvetro) con una specificità superiore al 72,3% (Papotti et al., 2013). Il limite principale del NMR è rappresentato dalla scarsa sensibilità rispetto alle altre tecniche spettrometriche. Quando si studia il vino tramite 1H NMR è pratica abbastanza comune includere uno step di una liofilizzazione, in modo da ridurre l'influenza delle due molecole prevalentemente presenti nel vino, cioè acqua ed etanolo. Questo porta ad un aumento del numero di molecole quantificabili (Hong, 2011), ma questa procedura favorisce la evaporazione o la precipitazione anche di molte molecole.

72 3.4. Verifica del latte da agricoltura biologica

Da un punto di vista analitico, l’autenticazione dei prodotti alimentari da agricoltura biologica è un problema difficile che è stato al centro della attenzione della comunità scientifica mondiale, come testimoniano le attività del gruppo di lavoro sulla autenticità finanziato dalla UE del progetto “AuthenticFood Core Organics”, e numerosi studi scientifici che si sono succeduti negli anni passati.

Revisioni molto dettagliate della letteratura sono disponibili sulle differenze tra prodotti biologici e convenzionali da un punto di vista nutrizionale (Lairon, 2010; Dangour et al., 2009; Brandt et al., 2011; Hunter et al., 2011)

Mentre la sola revisione delle strategie di analisi che possono essere impiegate per l'autenticazione dei prodotti biologici è quella di Capuano et al., 2013. Nel dettaglio sono riportate solo le tecniche utili per la verifica della autenticità del latte e dei prodotti caseari prodotti da allevamenti con metodo biologico.