UNIVERSITA` DI PISA
DIPARTIMENTO DI SCIENZE AGRARIE, ALIMENTARI E AGRO-AMBIENTALI
Corso di Laurea in Biosicurezza e Qualità degli Alimenti
Composizione in acidi grassi dei fosfolipidi del cervello di maiale
in relazione all’alimentazione
RELATORE: CANDIDATO: Prof Andrea Serra Carlotta Evani
ANNO ACCADEMICO 2017-18
SOMMARIO
1 PARTE GENERALE 5 1.1 I LIPIDI 5 1.1.1 I TRIGLICERIDI 5 1.1.2 I FOSFOLIPIDI 6 1.1.2.1 Struttura 7 1.1.2.1.1 Glicerofosfolipidi 7 1.1.2.1.2 Sfingolipidi 8 1.1.3 IL COLESTEROLO 9 1.2 LA DIGESTIONE DEI LIPIDI NEL SUINO 10 1.2.1 DIGESTIONE A LIVELLO DEL CAVO ORALE 11 1.2.2 DIGESTIONE GASTRICA 11 1.2.3 I SALI BILIARI E L’EMULSIONE 11 1.2.4 IL RUOLO DEL PANCREAS 14 1.2.4.1 Lipasi pancreatica 14 1.2.4.2 Colesterolo esterasi 15 1.2.4.3 La fosfolipasi A2 15 1.3 L’ASSORBIMENTO DEI LIPIDI 17 1.3.1 L’ASSORBIMENTO DEGLI ACIDI GRASSI 17 1.3.2 L’ASSORBIMENTO DEL COLESTEROLO 19 1.4 LA SINTESI EX-NOVO DEGLI ACIDI GRASSI 22 1.4.1 IL TRASPORTO DEGLI ACIDI GRASSI E DEL COLESTEROLO 22 1.5 LA SINTESI EX-NOVO DEI LIPIDI 24 1.5.1 ACIDI GRASSI 24 1.5.2 SINTESI DEL COLESTEROLO 29 1.6 CENNI DI ANATOMIA E FISIOLOGIA DEL CERVELLO DEL SUINO 32 1.7 IL METABOLISMO LIPIDICO NEL CERVELLO 35 1.7.1 SINTESI, ASSORBIMENTO E TRASPORTO DEL COLESTEROLO 35 1.7.2 SINTESI, ASSORBIMENTO E TRASPORTO DEGLI ACIDI GRASSI 37 1.8 LA COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSI E I DISTURBI CEREBRALI NELL’UOMO 42 2 PARTE SPERIMENTALE 47 2.1 OBIETTIVO 47 2.2 MATERIALI E METODI 48 2.2.1 DETERMINAZIONE DELLA COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSI 51 2.2.2 DETERMINAZIONE DEL COLESTEROLO DEI SUOI PRODOTTI DI OSSIDAZIONE (COPS) 52 2.2.3 DETERMINAZIONE DEI FOSFOLIPIDI E DELLE FRAZIONI LIPIDICHE 54 2.2.4 SEPARAZIONE DELLE CLASSI DI FOSFOLIPIDI MEDIANTE CROMATOGRAFIA SU STRATO SOTTILE (TLC) 55 2.2.5 TRANS-ESTERIFICAZIONE DELLE CLASSI DI FOSFOLIPIDI 582.3 ANALISI STATISTICA DEI DATI 59
2.4 RISULTATI 60
2.4.2 COMPOSIZIONE IN ACIDI GRASSI DELLE CLASSI DI FOSFOLIPIDI DEL CERVELLO 65 2.5 CONCLUSIONI 75 3 BIBLOGRAFIA 77
A mio nonno, malato di Alzheimer, e mia nonna, donna indistruttibile.
Ai miei genitori che mi hanno permesso di arrivare fin qui.
Alle mie amiche Giulia, Greta, Jasmeen e Federica.
A Fabio che c’è stato, c’è e ci sarà sempre.
1 PARTE GENERALE
1.1 I LIPIDI I lipidi sono sostanze idrofobe e lipofile e per questo risultano difficili da digerire. Le categorie lipidiche principali assunte con la dieta sono i trigliceridi, i fosfolipidi e colesterolo.1.1.1 I trigliceridi
I trigliceridi, che costituiscono quasi la totalità dell’apporto lipidico della dieta (90%), sono formati da una molecola di glicerolo esterificata a tre acidi grassi, la maggior parte a catena lunga (16-20 atomi di carbonio), legati in modo non casuale. Il loro apporto energetico è notevolmente più alto (9 kcal/g), di quello dei carboidrati e degli amminoacidi, ma per essere utilizzati devono essere idrolizzati in glicerolo ed acidi grassi;
1.1.2 I fosfolipidi
I fosfolipidi, sono presenti soprattutto a livello delle membrane biologiche ed hanno una struttura caratteristica che presenta una testa polare idrofila ed una coda idrofoba. Sono formati da una molecola di glicerolo unita a due acidi grassi in posizione pos-1 e pos-2, e ad un acido ortofosforico (H3PO4) in posizione pos-3. I fosfolipidi sono sostanze organiche anfipatiche che contribuisco alla struttura di base delle membrane cellulari formando un doppio strato lipidico, con le catene di acidi grassi idrofobiche rivolte verso l'interno ed i gruppi idrofili all'esterno.
Figura 2 - Struttura di un fosfolipide (lecitina)
Oltre al ruolo strutturale, fosfolipidi come il fosfatidilinositolo, hanno funzioni specifiche agendo come fonte di inositolo trifosfato e diacilglicerolo, che sono prodotti come messaggeri intracellulari secondari in risposta ad ormoni ad azione rapida e a neurotrasmettitori (Bender, 2004). Partecipano inoltre alla formazione delle lipoproteine e degli eicosanoidi e fungono da segnale o da cofattori per diverse reazioni.
Il loro assorbimento si realizza nell’intestino. La presenza di acidi grassi polinsaturi esterificati in posizione 2 del glicerolo all’interno del fosfolipide apporta una maggiore
fluidità della membrana rispetto all’esterificazione con acidi grassi saturi o isomeri trans degli acidi grassi polinsaturi. 1.1.2.1 Struttura I fosfolipidi sono lipidi contenenti un gruppo fosfato. In base alla loro struttura si possono suddividere in glicerofosfolipidi e sfigofosfolipidi. 1.1.2.1.1 Glicerofosfolipidi La loro struttura principale è caratterizzata da una molecola di glicerolo esterificato in posizione 1 e 2 ad un acido grasso (di solito a lunga catena insatura); in posizione 3 viene invece esterificato a fosfato (Singh et al., 2017). Il fosfato, a sua volta può legarsi a diversi composti, tra cui la serina, l'etanolamina, la colina, l'inositolo ecc…
Un fosfolipide che manca del gruppo esterificato dal fosfato viene definito acido fosfatidico, mentre quelli completi in base alla molecola che legano sono detti fosfatidilserina, fosfatidiletanolammina, fosfatidilcolina (lecitina), fosfatidilinositolo, ecc..
Figura 3 - Struttura generale dei glicerofosfolipidi
1.1.2.1.2 Sfingolipidi
Questi composti contengono un amminoalcool a 18 atomi di carbonio con doppio legame trans, la sfingosina, al posto del glicerolo. Essa si sostituisce al glicerolo per il legame estere al fosfato ed inoltre forma composti chiamati ceramidi (unità di base) legando a sé, attraverso legame amminico, un acido grasso. Il gruppo fosfato può essere a sua volta legato ad un amminoalcol, come ad esempio la colina con produzione di sfingomielina, particolarmente presente a livello delle membrane plasmatiche. In base alle diverse teste polari che può presentare, possono essere a loro volta suddivisi in: sfingomieline, glicolipidi neutri (cerebrosidi), gangliosidi. Le sfingomieline sono i costituenti fondamentali di mielina a livello cerebrale, deputata all’isolamento neuronale. Esse possiedono come testa polare molecole di fosfoetanolammina e fosfocolina. Figura 4 - Struttura di una sfingomielina
I glicolipidi neutri presentano un unico zucchero legato ad un ceramide ed in base ad esso possono collocarsi in due differenti distretti: quelli costituiti da galattosio si ritrovano all’interno di membrane plasmatiche nel tessuto cerebrale, mentre quelli legati al glucosio nei tessuti diversi da quello nervoso.
1.1.3 Il colesterolo
Il colesterolo ed i suoi esteri, assunti con la dieta, hanno esclusivamente origine animale, a differenza di trigliceridi e fosfolipidi che invece possono provenire anche da alimenti di origine vegetale. Nell’intestino l’85-90% del colesterolo si presenta sotto forma non esterificata ed è l’unica forma che viene assorbita. Figura 5 - Struttura del colesterolo Molecole come i trigliceridi sono ottime per quanto riguarda il deposito energetico, ma risultano di difficile digestione a causa della loro idrofobicità. La digestione lipidica ha inizio nel cavo orale e prosegue nello stomaco, ma la digestione lipidica vera e propria avviene nell’intestino tenue (Iqbal J. et al., 2009).
1.2 La digestione dei lipidi nel suino
Il suino possiede caratteristiche anatomiche e strutturali del tratto gastroenterico molto simili a quelle dell’uomo e dei roditori (Saikali S. et al., 2010).
La digestione è un processo piuttosto complesso che comprende differenti trattamenti chimici, fisici e meccanici e che permette la scissione e il successivo assorbimento di tutte quelle molecole complesse che altrimenti non potrebbero essere assimilabili come tali.
Gli enzimi coinvolti nella digestione dei trigliceridi sono le lipasi: proteine che effettuano un’idrolisi parziale dei trigliceridi; scindono i legami estere con liberazione di acidi grassi liberi e glicerolo. Le lipasi implicate nel processo digestivo sono quelle presenti nella saliva e secrete dalle ghiandole buccali, quelle gastriche e, le più importanti, quelle pancreatiche. Altri enzimi che prendono parte al processo sono le fosfolipasi e la colesterolo-esterasi.
Figura 6 - Lipasi linguale, L. gastrica, L. pancreatica e Colesterolo esterasi
1.2.1 Digestione a livello del cavo orale
L’azione meccanica della masticazione permette di ridurre il cibo in tante piccole particelle in modo da aumentare la superficie di contatto con la lipasi linguale (Hamosh et al., 1975). L’enzima viene prodotto nella zona posteriore della lingua dalle ghiandole sierose linguali (Iqbal J. et al., 2009). L’azione enzimatica avviene a livello della pos-3 all’interno del triacilglicerolo in modo selettivo per la lunghezza della catena carboniosa dell’acido grasso liberato (non maggiore di 18C). La lipasi linguale ha un’azione più lenta rispetto alla lipasi pancreatica e agisce in un ambiente acquoso, dove le sostanze lipidiche tendono a formare aggregati insolubili e a limitare l’azione dell’enzima. 1.2.2 Digestione gastrica Nello stomaco avviene la secrezione di lipasi gastrica da parte di specifiche cellule delle ghiandole presenti sul fondo dello stomaco (Armand M., 2007). L’enzima riesce a resistere a pH abbastanza bassi (pH<6), ma resta comunque attivo anche a valori meno acidi. Idrolizza i trigliceridi naturalmente emulsionati per lo più in posizione pos-3, liberando acidi grassi liberi a corta catena e diacilgliceroli (Staggers J.E. et al., 1981). Favorisce quindi l’emulsione e contribuisce alla dispersione delle goccioline lipidiche (Tso P. et al., 2000).
1.2.3 I sali biliari e l’emulsione
Il chimo acido che fuoriesce dallo stomaco, contiene lipidi praticamente integri, e giunge all’intestino. I trigliceridi sono sostanze idrofobe e bisogna quindi fare in modo che gli enzimi digestivi, dispersi nel mezzo acquoso, possano adeguatamente legarsi ad
essi. Ciò è possibile grazie all’azione emulsionante dei sali biliari.
La bile è un liquido viscoso secreto dagli epatociti del fegato che viene riversata nel duodeno attraverso il coledoco. La bile è composta per la maggior parte da acqua, e, quindi, da una piccola quantità di sali di acidi biliari, pigmenti biliari, colesterolo, lecitine e ioni.
I sali biliari sono composti essenzialmente da quattro acidi principali: l’acido colico e chenodeossicolico, detti primari, che si formano nel fegato a partire dal colesterolo, e gli acidi deossicolico e litocolico (secondari), che si formano nell'intestino per trasformazione dei primi due ad opera di enzimi batterici.
Figura 7 - Acidi principali che costituiscono la bile
Nel periodo postprandiale, a livello del duodeno e del digiuno viene stimolata la secrezione di colecistochinina-pancreozimina (CCK-PZ), ormone della mucosa duodenale che stimola la contrazione della cistifellea e il rilascio della bile (Hamosh, 1990; Little et al., 2007).
L’azione dei sali biliari avviene quindi secondo i seguenti passaggi:
- neutralizzare l’acidità gastrica (pH 2), e rendere attivi gli enzimi intestinali che operano ad un pH ottimale intorno a 7;
- abbassare la tensione superficiale acqua/trigliceridi in modo da favorire l’emulsione;
- suddividere la componente lipidica in tante piccole goccioline, aumentando così la superficie di contatto per l’enzima lipasi (Bauer et al., 2005);
- formare micelle idrosolubili in combinazione con i prodotti dell’idrolisi (lecitine, acidi grassi, 2-monogliceridi) capaci di incorporare anche composti insolubili come il colesterolo e di essere assorbite;
- favorire la formazione di chilomicroni, stimolando l’esterificazione degli acidi grassi in trigliceridi.
Una volta assorbita la componente lipidica, la maggior parte dei sali biliari vengono ricondotti al fegato attraverso la vena porta, in modo da poter essere riutilizzati successivamente.
1.2.4 Il ruolo del Pancreas
Contemporaneamente alla bile, la secrezione di colecistochinina, va a stimolare anche la produzione di succhi pancreatici secreti dal pancreas esocrino e riversati nel duodeno tramite il dotto di Wirsung. Le idrolasi pacreatiche comprendono: l’enzima lipasi, la colesterol-esterasi e la fosfolipasi A2.
1.2.4.1 Lipasi pancreatica
La lipasi pancreatica, permette la digestione della maggior parte dei trigliceridi assunti con la dieta scindendoli in 1,2–diacilgliceroli e 2–acilgliceroli, con idrolisi preferenziale in posizione pos-1 e pos-3 (Bauer et al., 2005).
La maggior parte dei 2-monogliceridi accumulati a valle del duodeno e contenenti acidi grassi a lunga catena possono essere direttamente assorbiti. In percentuale minore, possono invece subire l'azione di un’isomerasi, come avviene per quelli contenenti acidi grassi a corta catena, che sposta l'acido grasso rimasto esterificato dalla posizione 2 alla posizione 1 per completare la digestione ad opera della lipasi. In questo modo si genera glicerolo libero che viene, anch'esso, assorbito per diffusione e acidi grassi liberi che, in base al pH e alla presenza di ioni calcio, vengono saponificati e non sono assimilati a livello intestinale.
Tutto si svolge grazie alla presenza di un coenzima nel succo pancreatico, la colipasi, che attiva la lipasi secreta in forma inattiva (prolipasi). Questa molecola è una piccola proteina, secreta dal pancreas in forma inattiva (procolipasi), che permette l’ancoraggio dell’enzima al lipide. La sua attivazione avviene in presenza di tripsina (Tso et al., 2000; Rosati et al., 2003).
I sali biliari e i fosfolipidi presenti nell’intestino vanno a circondare le goccioline lipidiche conferendogli carica negativa che attrae la colipasi, permettendo così l’adesione dell’enzima. L’insieme dei processi a carico dei trigliceridi fanno sì che essi si trasformino in una sospensione di piccoli aggregati chiamati micelle globulari miste. Queste sono costituite da un nucleo non polare di triacilgliceroli e di esteri del colesterolo, con un rivestimento anfifilico di proteine, fosfolipidi e colesterolo (Tso et al., 2000; Bender, 2004)
1.2.4.2 Colesterolo esterasi
Nel succo pancreatico possiamo trovare anche la colesterolo-esterasi, sempre secreta dal pancreas esocrino. L’enzima viene attivato dalla presenza dei sali biliari, in particolare di sali triidrossilici, che provocano una variazione conformazionale tale da attivare la proteina. La colesterolo-esterasi va ad agire su quella quota di colesterolo, assunta dalla dieta, esterificata ad acidi grassi, poiché la frazione presente di colesterolo in forma libera viene direttamente assorbita a livello intestinale. La sua funzione è quindi quella di scindere il legame presente tra le due molecole. Il colesterolo libero viene solubilizzato poi nelle micelle globulari miste.
1.2.4.3 La fosfolipasi A2
La digestione dei fosfolipidi è catalizzata dalle fosfolipasi, in particolare dalla fosfolipasi A2 pancreatica (PLA2). L’enzima è presente nel succo pancreatico in forma di proenzima, detto profosfolipasi A2, ed attivato come per la colipasi dalla presenza di tripsina nel lumen intestinale. Catalizza in modo specifico il distacco idrolitico dai fosfolipidi dell’acido grasso in posizione pos-2, formando i lisofosfolipidi.
Figura 8 - Azione dell’enzima Colesterolo esterasi
La maggior parte dei fosfolipidi idrolizzati sono di origine biliare e solo una piccola parte deriva dall’alimentazione. Nella bile i fosfolipidi si possono ritrovare racchiusi nelle micelle globulari miste insieme al colesterolo e ai sali biliari; nel lumen intestinale, invece, si posizioneranno tra l’emulsione lipidica e le micelle, preferendo quest’ultime. Nelle micelle miste il fosfolipide, ad esempio la fosfatidilcolina, funge da substrato, dando come prodotti della reazione un acido grasso libero e lisofosfatidilcolina, un lisofosfolipide. (Tso et al., 2000).
Nel succo pancreatico è presente anche una fosfolipasi A1, che idrolizza l’acido grasso esterificato in posizione pos-1.
Una terza, ma minima, attività fosfolipasica viene svolta da un enzima di membrana dell’enterocita situato a livello dell’orletto a spazzola della mucosa intestinale: la fosfolipasi B o retinil-estere idrolasi. La vitamina A, che viene assunta con l’alimentazione, è presente infatti in forma di retinil-estere e su questa andrà ad agire l’enzima (Iqbal et al., 2009).
1.3 L’assorbimento dei lipidi
1.3.1 L’Assorbimento degli acidi grassi
L’assorbimento degli acidi grassi liberi e dei monogliceridi, risultati dalla digestione lipidica, avviene a livello del digiuno. Il meccanismo con cui entrano all’interno degli enterociti può avvenire sia per diffusione passiva che per traslocazione. (Abumrad et al.,1993; Masson et al., 2010). L’assunzione mediante traslocazione facilitata comporta la presenza sulla membrana di specifiche proteine deputate al trasporto di acidi grassi (Abumrad et al., 1993; Jia et al., 2007; Masson et al., 2010): - FATP (Fatty Acid Transport Protein) - CD-36 (o FAT Fatty Acic translocases) - FABP (Fatty Acid Binding Protein) All’interno della cellula intestinale vengono trasportati da una FABP citosolica fino al reticolo endoplasmatico, dove vengono attivati in Acil-CoA e successivamente esterificati ai monogliceridi presenti per la resintesi dei trigliceridi. La resintesi, che avviene all'interno degli enterociti, consuma energia e permette di ottenere molecole differenti da quelle inizialmente assunte con la dieta.
Si ha quindi la formazione dei chilomicroni (Fielding et al., 2008): complessi micellari lipoproteici costituiti esternamente da colesterolo libero, fosfolipidi e proteine idrofile, che racchiudono internamente molecole idrofobe come trigliceridi e colesterolo esterificato.
Questi aggregati vengono utilizzati per il trasporto di molecole idrofobe che devono giungere al fegato attraversando mezzi acquosi come linfa o sangue.
Figura 9 - Struttura di un chilomicrone
Oltre ai chilomicroni nelle cellule intestinali si ha la formazione di aggregati che presentano una percentuale proteica maggiore: le lipoproteine a bassissima densità (VLDL).
Chilomicroni e VLDL entrano nei vasi linfatici (Fielding et al., 2008) e vengono riversati nella vena succlavia raggiungendo poi il fegato, dove avverranno i maggiori processi di interesse metabolico.
Gli acidi grassi a media catena (8-10 C) subiscono un assorbimento diverso rispetto a quelli contenenti acidi a lunga catena.
Non vengono esterificati, come detto in precedenza, ma vengono legati all’albumina e trasferiti ai vasi mesenterici, passando poi nella vena porta, e trasportati infine al fegato. Qui vengono smistati e riversati nel torrente ematico sottoforma di lipoproteine. 1.3.2 L’Assorbimento del colesterolo Circa la metà del colesterolo assunto giornalmente viene assorbito, mentre la quota restante viene secreta ed espulsa con le feci (Turley et al., 2003; Bays, 2002; Catapano et al., 2004). La percentuale di assorbimento varia in relazione alla quantità di colesterolo che arriva all’intestino: maggiore è la sua presenza minore sarà la quota assorbita (Ostlund, 2002). Oltre al colesterolo, negli alimenti esistono steroli di tipo vegetale (fitosteroli), il cui assorbimento è differenziato e nettamente inferiore a quello del colesterolo (Ostlund, 2002a; Altmann et al., 2004).
Il colesterolo costituisce circa il 20-25% della componente lipidica delle membrane plasmatiche della maggior parte delle cellule, mentre i fosfolipidi, la sfingomielina ed i glicolipidi occupano solo una piccola percentuale di esse. La loro distribuzione nella membrana plasmatica, tuttavia, non è uniforme. La concentrazione di colesterolo deve però essere strettamente regolata, poiché questa molecola svolge un ruolo particolarmente importante per quanto riguarda le caratteristiche di permeabilità e fluidità della membrana stessa, oltre a avere numerose altre funzioni.
L’assorbimento, ritenuto a lungo come una semplice diffusione passiva, è risultato essere invece un processo minuziosamente regolato e particolarmente attivo.
Fase fondamentale per questo processo si ha durante l’idrolisi pancreatica, quando il colesterolo viene incorporato nelle micelle miste. In questo modo il colesterolo, reso solubile, può attraversare la membrana enterocitica (Hofmann e Borgstroem, 1964). Esistono tre tipi di meccanismi utili per l’assorbimento: le proteine Niemann-Pick C1 Like 1 (NPC1L1), SR-BI, CD-36 e LDLR (Altmann et al., 2004; Davis et al., 2004).
Le proteine transmembrana NPC1L1 sono deputante all’assorbimento specifico e selettivo di colesterolo biliare e colesterolo proveniente dalle micelle miste dell’intestino, che viene in parte utilizzato per il metabolismo delle cellule e in parte immagazzinato in lipoproteine; anche i fotosteroli sono assorbiti grazie a questo traportatore (Dietschy et al., 2004; Jia et al., 2011). L’NPC1L1 è una proteina politopica costituita da 13 domini, di cui 5 sono sensibili agli steroli (SSD). Figura 10 - Assorbimento ed escrezione di colesterolo
Una volta entrato all’interno della cellula, parte di esso viene poi reimmesso nel lumen intestinale insieme alla maggior parte dei fitosteroli mediante l’azione di proteine
trasportatrici ABCG5 e ABCG8, maggiormente affini agli steroli vegetali (Berge et al., 2000; Lee et al., 2001; Repa et al., 2002; Hui e Howless, 2005).
Questi sono in realtà degli emi-trasportatori e cioè, per poter funzionare, hanno bisogno di formare un eterodimero accoppiandosi tra di loro (Graf et al., 2002).
SR-B1 e CD-36 sono invece recettori di membrana situati negli enterociti e che contribuiscono all’assorbimento del colesterolo (Cai et al., 2004; Nauli et al., 2006). Nel citoplasma dell’enterocita, parte del colesterolo assorbito può essere esterificato attraverso una reazione catalizzata dall’enzima intracellulare acilcolesterolo-aciltrasferasi (ACAT2) in modo da poter successivamente prendere parte alla formazione dei chilomicroni (Catapano, 2004; Turley, 2008).
1.4 La sintesi ex-novo degli acidi grassi
1.4.1 Il trasporto degli acidi grassi e del colesterolo
Oltre ai chilomicroni si ha la formazione di altri complessi lipoproteici: le lipoproteine plasmatiche, caratterizzate da una struttura simile ai chilomicroni stessi, ma diversa conformazione chimica.
In base alla loro densità, riferita al diverso contenuto lipidico, e alla loro composizione, si suddividono in 4 diverse classi: le liproproteine a bassissima densità (Very Low Density Lipoproteins - VLDL); le liproproteine a media densità (Intermediate Density Lipoproteins - IDL); le liproproteine a bassa densità (Low Density Lipoproteins - LDL); le liproproteine ad elevata densità (High Density Lipoproteins – HDL).
Le proteine idrofile che sono presenti in questi aggregati sono definite apoproteine (Apo) (Gotto et al., 1986).
Il ruolo delle apoproteine è molteplice: oltre a costituire le proteine plasmatiche sopracitate, fungono da cofattori enzimatici, permettendo il loro riconoscimento, e interagendo con recettori specifici situati sulle membrane cellulari.
Tra le lipoproteine stesse e tra le lipoproteine e le membrane cellulari ci può essere uno scambio di componenti grazie a legami covalenti che legano la porzione lipidica a quella proteica.
Questo avviene, ad esempio, tra chilomicroni (ApoB-48) e HDL (ApoA-I), che scambiano apoproteine in modo da permettere ai primi di poter interagire con la lipoprotein-lipasi (LPL), enzima presente nel tessuto muscolare e adiposo, deputato all’idrolisi dei trigliceridi, contenuti nei chilomicroni. L’azione enzimatica permette quindi
la liberazione di acidi grassi e glicerolo. Gli acidi grassi liberati vengono utilizzati per la produzione di energia attraverso la loro ossidazione o esterificati a glicerolo per la sintesi di nuovi TG a livello del reticolo.
Dopo la perdita di trigliceridi, i chilomicroni “svuotati” tornano al fegato dove, per azione di un secondo enzima, l’esterasi lisosomiale, si ha l’idrolisi degli esteri di colesterolo con rilascio conseguente di acidi grassi e colesterolo libero. I residui di superficie vanno invece a costituire le HDL. Il fegato quindi riveste un ruolo importante in queste fasi: oltre a quanto riportato in precedenza, a livello epatico vengono sintetizzate anche le VLDL (ApoB100, ApoC, ApoE). In queste la componente lipidica è caratterizzata da trigliceridi originati per lipogenesi a partire da composti preformati (Bergen et al., 2005). Analogamente ai chilomicroni, le VLDL una volta entrate in circolo, scambiano con le HDL le apoproteine necessarie per l’azione della LPL e quindi per la liberazione dei trigliceridi in esse contenuti.
Quest’ultime, prive di TG, cedono alle HDL le componenti superficiali in cambio di colesterolo esterificato. Si trasformano cosı̀, in un primo momento, in IDL e successivamente in LDL, deputate al trasporto di colesterolo esterificato nei tessuti (Voet et al.).
Le LDL (ApoB100) aderiscono ed entrano nelle cellule tissutali per endocitosi grazie alla presenza di un recettore glicoproteico a livello delle pieghe della membrana che permette il loro ingresso. Una volta entrate nella cellula, vengono attaccate da diversi enzimi, specifici per ogni componente.
Si ha quindi rilascio di colesterolo libero e acidi grassi ad opera della colesterolo-esterasi, l’idrolisi dei trigliceridi in acidi grassi e glicerolo e la liberazione degli amminoacidi dalle lipoproteine presenti.
In base al colesterolo presente possono essere inibiti sia la sua produzione endogena, che l’ingresso di LDL nelle cellule. In caso di valori troppo alti, l’eccesso di colesterolo viene riportato al fegato tramite le HDL. Al fegato il colesterolo libero viene esterificato di nuovo ed immesso nelle VLDL. 1.5 La sintesi ex-novo dei lipidi 1.5.1 Acidi grassi Oltre ad utilizzare la sostanza lipidica proveniente da intestino e fegato, è possibile sintetizzarla de novo a partire da molecole di glucosio o, in caso di bilancio energico negativo, di aminoacidi proveniente dall’idrolisi delle proteine.
La sintesi dei grassi è a carico di specifiche cellule appartenenti al tessuto adiposo, ma anche nel fegato e a livello della ghiandola mammaria, dove avviene una polimerizzazione del glucosio presente con consecutiva produzione di glicogeno. Il glicogeno prodotto viene così utilizzato in modi diversi in base alle esigenze dell’organismo.
Diversi sono i siti in cui avviene questo processo: per quanto riguarda la maggior parte degli animali, come il pollo, ma anche suinetti fino allo svezzamento, la lipogenesi avviene principalmente a carico del fegato, cosa che, invece, nel suino adulto non avviene (Dodson et al., 2010)
L’intensità della neosintesi viene determinata in particolare dallo stato nutrizionale dell’animale; l’amido introdotto nel suino con gli alimenti viene utilizzato come fonte di glucosio da parte del tessuto adiposo, dove vengono sintetizzati circa l’80% dei lipidi presenti.
Il cambiamento nell’alimentazione del suino durante le diverse fasi della crescita determina l’aumento di enzimi deputati alla lipogenesi all’interno del tessuto adiposo (O'Hea et al., 1999).
La sintesi lipidica negli adipociti avviene nel citoplasma della cellula ad opera di due determinati enzimi: l’Acetil-CoA-Carbossilasi (ACC) e la sintasi degli acidi grassi (FAS).
L’ACC è un polipeptide multifuzionale caratterizzato da tre subunità; una di queste contiene biotina che, legata alla lisina, funge da trasportatore di CO2.
L’enzima esiste in due forme distinte (ACC1 e ACC2) e viene codificato da geni separati in base al tessuto d’azione. L’ACC1 è un enzima citosolico e viene prodotta nel fegato e nel tessuto adiposo e regola, di fatto, la sintesi degli acidi grassi e quindi dei lipidi; la ACC2 si trova sulla superficie dei mitocondri in quei tessuti dove si ha la β-ossidazione acilica (fegato, muscolo scheletrico, cuore) e regola pertanto l’ossidazione e quindi il catabolismo dei lipidi e degli acidi grassi.
L’acetil-CoA, utilizzato per la produzione di acidi grassi, deriva esclusivamente dalla decarbossilazione di piruvato presente all’interno del mitocondrio e derivante dal catabolismo degli zuccheri. L’acetil-CoA non può passare liberamente la membrana del mitocondrio. Questo avviene attraverso la condensazione con ossalacetato (OAA) con produzione di citrato, il quale può attraversare la membrana e raggiungere il citosol; qui
avviene la reazione inversa catalizzata da una citrato-liasi che libera nuovamente OAA e acetil-CoA. A questo punto l’acetil-CoA può prendere parte alla neosintesi di acidi grassi utilizzando il NADPH prodotto dalla reazione.
L’acetil-CoA viene trasformato in un primo passaggio dall’ACC, il primo enzima chiave del processo, in malonil-CoA che richiede ATP, Mg2+ e biotina come coenzima, mediante l’addizione di una molecola di C02 derivata dal bicarbonato (Stefani et al., 2011).
Dopo la sua formazione entra in gioco il secondo enzima chiave: la FAS. Questo enzima è un complesso proteico multifunzionale appartenente alla famiglia delle transferasi. Analisi genetiche e biochimiche hanno identificano nella FAS due subunità differenti disposte in un complesso, α6β6; tali sub-unità contengono proteine trasportatrici di acili (ACP), β–cheto–ACP riduttasi, enzima condensante, l’aciltransacilasi, la β–idrossiacil–ACP deidratasi, la malonil transacilasi e β–enoil–ACP riduttasi (Smith et al, 2003). Tutti questi enzimi concorrono alla neoformazione lipidica ripetendosi ciclicamente fino alla formazione di catene carboniose contenenti 16 atomi di C (palmitato).
La piccola proteina trasportatrice di acili (ACP) contiene un gruppo prostetico 4-fosfopanteteina legato ad un residuo di serina e che funge da ancoraggio per il gruppo acetilico.
L’acetil-trasferasi e la malonil-CoA transacilasi permettono il trasferimento del gruppo acilico sull’ACP: il gruppo acetilico dell’acetil-CoA si lega preferenzialmente al residuo di cisteina, mentre il malonato del malonil-CoA al gruppo –SH della proteina di trasporto.
La prima reazione del ciclo è una condensazione che si ha tra acetil-ACP e malonil-ACP con produzione di acetoacetil-ACP con rilascio di CO2 e del gruppo –SH.
Seguono poi due reazioni di riduzione a carico del gruppo acile legato all’ACP NADPH dipendenti e una deidratasi che portano alla formazione del prodotto del primo ciclo di reazioni: il butirril-ACP, acido grasso saturo con quattro atomi di carbonio.
Nel ciclo successivo il gruppo butirrico legato alla cisteina condenserà con il malonil-ACP legato al gruppo –SH con eliminazione di CO2. Al termine del secondo ciclo si avrà quindi la formazione di un acile saturo a sei carboni.
La serie di reazioni viene ripetuta per un totale di sette cicli, fino alla formazione di palmitoil-ACP (C 16:0), che si stacca dal complesso e libera acido palmitico.
Il prodotto di questa serie di reazioni può comunque subire l’azione enzimatica di elongasi e desaturasi, localizzate a livello della membrana del reticolo endoplasmatico liscio.
Le elongasi sono responsabili dell’allungamento della catena grazie all’apporto di due unità carboniose all’acido grasso, mentre le desaturasi inseriscono doppi legami, mai oltre il carbonio in posizione 9. Per questo motivo acidi grassi come l’acido linoleico (AL- C18:2 cis9, cis12) e l’acido alfa-linolenico (ALA- C18:3 cis9, cis12, cis 15) sono definiti acidi grassi essenziali e devono essere introdotti attraverso la dieta.
Una volta immessi nell’organismo anch’essi fungono da base per la produzione di nuovi acidi grassi polinsaturi a lunga catena (ω3- ω6).
Figura 11 - Biosintesi dei PUFA ω-6 ed ω-3
Diversi processi enzimatici possono determinare un allungamento della catena di carbonio (elongasi) e la formazione di desaturazioni (desaturasi) su AL e ALA.
Tra gli LC-PUFA ω-3 avremo principalmente la formazione di Acido Eicosapentaenoico (EPA- 20:5 n-3) e Docosaesaenoico (DHA- 22:6 n-3), mentre tra gli ω6 i più importanti sono l'Acido Gamma-linolenico (GLA- 18:3 n-6), l'Acido Diomogammalinolenico (DGLA -20:3 n-6), e l'Acido Arachidonico (AA- 20:4 n-6).
Questi processi di trasformazione vengono catalizzati dai medesimi enzimi e per questo si instaura una forte competizione tra le due famiglie di PUFA.
1.5.2 Sintesi del Colesterolo Nei mammiferi il colesterolo rappresenta un lipide importante che assume, tra le numerose funzioni, anche quella di mantenere integre le membrane cellulari delle quali regola anche la permeabilità e il mantenimento della integrità. Il colesterolo viene prodotto nella maggior parte dei tessuti, ma principalmente a livello del fegato, a livello del reticolo endoplasmatico liscio (REL) e della mucosa intestinale. La sintesi del colesterolo avviene anche nelle ghiandole endocrine deputate alla produzione di ormoni steroidei (gonadi e surreni).
Il colesterolo endogeno, così come avviene per la sintesi degli acidi grassi, viene prodotto partendo da molecole di acetil-CoA e NADPH, ma mediante una serie di complesse reazioni (Block,1965).
La prima reazione ha luogo nel citosol e interessa una molecola di acetil-CoA ed una di acetoacetil-CoA con formazione di 3-idrossimetil-glutaril-CoA (HMG-CoA) per mezzo di uno specifico enzima, l’HMG sintasi. L’ HMG-CoA viene poi ridotto a mevalonato per azione della HMG-CoA reduttasi (McLean, 2012)
In un secondo step il mevalonato viene trasformato in isopentenil pirofosfato (IPP), isomerizzato in parte in dimetilallil pirofosfato (DMP-5C), attraverso due reazioni che consumano 3ATP e liberano CO2.
Questi due composti possono interagire tra di loro attraverso una serie di condensazioni per originare per prima cosa geranil pirofosfato (GPP-10C), che a sua volta, reagendo con un’ulteriore molecola di dimetilallil pirofosfato porta alla produzione di farnesil pirofosfato (FPP- 15C). Negli ultimi step della via sintetica del colesterolo si ha l’unione di due molecole di FPP catalizzata dall’enzima squalene sintasi (SQS) con formazione di squalene (30C). Questo ultimo passaggio è proprio della sintesi del colesterolo a differenza di quelli precedentemente esposti che possono essere utilizzati per la neosintesi di isoprenoidi.
Le fasi successive avvengono sul REL a carico delle molecole di squalene prodotte su cui vengono effettuate rispettivamente una riduzione (NADPH dipendente) e una ciclizzazione, con formazione di intermedi (latosterolo e desmosterolo), che andranno a produrre colesterolo (27C). Nella specie suina il colesterolo viene sintetizzato soprattutto nel fegato, nel tessuto adiposo e nella mucosa intestinale (Romsos et al., 1971).
1.6 Cenni di anatomia e fisiologia del cervello del suino
Il cervello del suino presenta caratteristiche anatomiche e funzionali affini a quello dell’uomo tanto da renderlo un modello sempre più utilizzato nel campo delle neuroscienze. I suini sono stati infatti ampiamente utilizzati come modello in ricerche biomediche cardiovascolari, metabolica e per i trapianti (Larsen et al., 2004)
Il principale vantaggio dei suini nella ricerca sulle neuroscienze rimane la dimensione del cervello, che è abbastanza simile a quello dell’uomo per anatomia, sviluppo e crescita, ma anche per le convoluzioni corticali (forma e numero di neuroni neocorticali); il cervello del maiale poi sembra assai simile a quello dell’uomo in termini anche istologici e di vascolarizzazione (Lind et al., 2007). La superficie corticale suina presenta una struttura girentiforme con vascolarizzazione accomunabile a quella dell’uomo (Lind et al., 2007; Saikali et al., 2010; Swindle et al., 2012).
Figura 13 - Confronto anatomico tra cervello umano e suino
Le analogie riguardano anche le regioni cerebrali dell’ippocampo (Holm et al., 1989), dei nuclei sottocorticali e diencefalici (Larsen et al., 2004) e le strutture del tronco cerebrale (Ostergaard et al., 1992).
L'aspetto globale del cervello dei maiali differisce leggermente da quella del primate poiché la curvatura del telencefalo è meno pronunciata e il polo anteriore è meno sviluppato. Visto dall'alto, il cervello del maiale ha un allungamento di forma ovale con gli emisferi che sono più larghi al punto terzo posteriore e il polo occipitale maggiore del polo frontale. Oltre a questo il sistema olfattivo è molto più sviluppato e occupa una grande
porzione della parte anteriore del cervello. Anche se il sulci cerebrale e il giroscopio del maiale sono stati descritti in numerosi studi (Dellman e McClure, 1975; Craner e Ray, 1991a e 1991b; Jarvinen et al., 1998; Okada et al., 1999; Jelsing et al., 2006; Lind et al., 2007), c'è stato solo un numero limitato di studi anatomici e istologici che descrivono il complesso struttura e organizzazione cellulare della neocorteccia nel maiale; anche se alcuni autori (Campbell,1905; Stephan, 1951) sostengono che ci siano discrepanze tra i risultati.
1.7 Il metabolismo lipidico nel cervello
I lipidi presenti nel cervello sono costituiti principalmente da glicerol-fosfolipidi, sfingolipidi e colesterolo. 1.7.1 Sintesi, assorbimento e trasporto del colesterolo Il cervello è l’organo che contiene la percentuale più alta di colesterolo in assoluto, per lo più in forma non esterificata (Björkhem et al., 2004). Il metabolismo lipidico e in particolare del colesterolo ha una origine particolarmente complessa che deriva da più vie. Le lipoproteine trasportatrici permettono lo scambio continuo di steroli attraverso il circolo ematico, però la presenza della barriera ematoencefalica (BEE) del tessuto cerebrale sembra impedire lo scambio di lipoproteine e colesterolo (Lütjohann et al., 1996). Questa particolare barriera funge da protezione per il tessuto cerebrale ed è formata da cellule endoteliali intimamente connesse (tight junction); l’epitelio risulta pertanto particolarmente compatto e privo di fenestrature che rende particolarmente difficile il passaggio delle sostanze (Rubin et al., 1999; Renkin., 1977).
Diversi studi effettuati sul cervello mediante l’utilizzo di acqua deuterata hanno sostenuto l’ipotesi che, a livello cerebrale, ci sia una sintesi indipendente per quanto riguarda il colesterolo (Waelsch et al., 1940; Jurevics e Morell, 1995).
La sintesi di per sé risulta la medesima che si ha anche negli altri distretti e viene svolta principalmente a livello del REL dove, una volta sintetizzato, viene trasferito alla membrana plasmatica (DeGrella e Simoni, 1982).
Il metabolismo del colesterolo è sostenuto da due tipi di cellule presenti a livello cerebrale: le cellule gliali, che provvedono alla produzione di colesterolo, e i neuroni, che
lo utilizzano. Il colesterolo è una molecola di grande importanza poiché prende parte alla formazione di numerose strutture che vanno a formare il tessuto cerebrale; in particolare i neuroni utilizzano lo sterolo per la costruzione di membrane degli assoni e dendriti (Giritz et al., 2005; Fester et al., 2009). Fondamentale è la sua presenza in oligodendrociti per la formazione della guaina mielinica necessaria al funzionamento del sistema nervoso (Snipes e Suter, 1997), infatti sembra che il colesterolo richiesto per la formazione di mielina risulti di origine endogena. Si presuppone che, nelle prime fasi della crescita quando si ha una maggiore produzione di mielina, questa sintesi avvenga proprio all’interno degli oligodendrociti, mentre solo una piccola parte venga sintetizzata dai neuroni. Col procedere della crescita, il pool di mielina prodotta tende a diminuire e quindi di conseguenza anche la sintesi di colesterolo subisce un rallentamento importante (Dietschy et al., 2004; Thelen et al., 2006). Studi condotti su topi hanno mostrato infatti come a livello embrionale vengano prodotti alti quantitativi di colesterolo in contrapposizione a quanto avviene in età adulta (Tansey e Shechter, 2001). Studi recenti effettuati per mezzo di marcatori radioattivi hanno dimostrato delle differenze per quanto riguarda i precursori del colesterolo presenti a livello di astrociti e neuroni. Nei neuroni la conversione di lanosterolo in colesterolo mediante l’enzima 24-deidrocolesterolo reduttasi risulta particolarmente bassa ed è data da un basso livello enzimatico presente (Nieweg et al., 2009), che fa supporre che i neuroni necessitino di un apporto di colesterolo di origine diversa.
In accordo con altri studi, che mostrano la necessità nei neuroni di fonti secondarie di colesterolo (Handelmann et al., 1992; Mauch et al., 2001), può essere ipotizzato che
esista una down-regulation neuronale in età adulta data probabilmente dall’enorme dispendio di energia richiesto dalla sintesi endogena.
Restano comunque ancora sconosciuti molti aspetti della sintesi cerebrale di colesterolo.
1.7.2 Sintesi, assorbimento e trasporto degli acidi grassi
Gli acidi grassi polinsaturi essenziali (PUFA) ω3 e ω6 svolgono un importante ruolo per lo sviluppo cerebrale e non potendo esser sintetizzati de novo, devo essere assunti con la dieta. Il rapporto tra LA e ALA, in particolare, risulta essere di fondamentale importanza per quanto riguarda la conversione in LC-PUFA come EPA e DHA. Questi due acidi grassi, infatti, sono fondamentali per lo sviluppo cerebrale (Diwakar et al., 2008) A livello cerebrale si trovano alte concentrazioni lipidiche che costituiscono circa la metà del peso secco dell’organo, di cui il 35% risulta formato da PUFA (Benatti et al., 2004).
I PUFA, presenti nel circolo sanguigno, sono trasportati nel plasma sotto forma di acidi grassi liberi o esterificati in fosfolipidi, colesterolo e trigliceridi all’interno delle lipoproteine, oppure legati in modo covalente agli eritrociti o alle piastrine (Spector, 2001; Bazán, 1990; Brown, 1991; Staufenbiel, 1988).
Gli acidi grassi non esterificati, che presentano catene carboniose con numero di atomi di carbonio inferiore o pari a 22, circolano nel sangue legati all’albumina, mentre quelli di lunghezza maggiore si ritrovano in modo preferenziale nelle lipoproteine (Shafrir et al., 1965; Wosilait and Soler-Argilaga, 1975).
Grazie a studi effettuati sull’uomo e sui topi, sono stati descritti diversi meccanismi di ingresso a livello cerebrale dei PUFA (Lagarde et al., 2001), anche se, ad oggi, non sono stati ancora definitivamente accertati poiché le molecole, per passare all’interno del cervello, devono poter oltrepassare la barriera emato-encefalica e le membrane neuronali (Reese and Karnovsky, 1967).
Il passaggio della barriera è una semplice diffusione per quanto riguarda i PUFA non esterificati ed è regolato dalla concentrazione di albumina a cui sono legati (Ouellet et al., 2009; Hamilton, 2007; Hamilton et al., 2002; Noronha et al., 1989; Washizaki et al., 1991). Le lipoproteine che arrivano alla BEE, invece, possono subire un’idrolisi preventiva ad opera di una lipoprotein-lipasi (LPL) situata sulla superficie delle cellule endoteliali; gli acidi grassi in forma non esterificata liberati dall’enzima possono passare all’interno del cervello (Brecher and Kuan, 1979; Purdon et al., 1997; Spector, 2001). La velocità di incorporazione di acidi grassi come l’acido arachidonico (AA, 20:4 n-6) e l’acido docosaesaenoico (DHA, 22:6 n-3) all’interno di fosfolipidi cerebrali è particolarmente elevata (Chen et al., 2008). I PUFA n-6 e n-3 non esterificati rappresentano le fonti maggiori di PUFA nel cervello.
Altri studi hanno tuttavia fornito prove che supportano l’assorbimento preferenziale di PUFA esterificati. Le prove sono state effettuate prendendo in esame DHA esterificato alla lisofosfoatidilcolina (LPC), che risulta assorbito maggiormente rispetto a quello presente in forma non esterificata. L’assorbimento è favorito a livello dell’epitelio capillare cerebrale e degli astrociti, cosa che non avviene invece a livello di fegato, cuore e reni (Thies et al., 1994; Bernoud et al., 1999; Lagarde, 2001).
Questi studi sono stati inoltre confermati dalla scoperta della presenza di uno specifico trasportatore sodio-dipendete (Mfsd2a) trovato nel cervello di topolini appena nati e deputato all’ingresso specifico di DHA esterificato a LPC (Nguyen, et al., 2014).
Può essere inoltre utilizzato un ulteriore meccanismo di ingresso facilitato dalla presenza di proteine di trasporto che legano gli acidi grassi non esterificati e comprendono la proteina di membrana FATP (fatty acid transport protein) (Jia et al., 2007; Melton et al., 2011), la proteina transmembrana CD36 (Bastie et al., 2004; Drover et al., 2008) e la proteina periferica di membrana FABPpm (peripheral membrane fatty acid binding protein) (Luiken et al., 1999; Potter et al., 1987). Figura 14 - Sistemi di trasporto di acidi grassi esterificati e non esterificati all’interno della BEE
Gli acidi grassi non esterificati, una volta attraversata la barriera ed entrati nel tessuto cerebrale, seguono una via in cui vengono attivati ad acil-CoA ad opera di acil-CoA sintetasi.
In questo modo gli acidi grassi esterificati a Co-A formano un complesso che resta intrappolato all’interno del tessuto cerebrale (Semenkovich, 1997; Watkins, 1997).
Il trasporto intracellulare nell’uomo risulta particolarmente selettivo nei confronti degli acidi grassi, lasciando passare principalmente quelli essenziali (Pardridge and Mietus, 1980). All’interno del tessuto cerebrale sono riscontrabili diversi tipi di proteine di FABP (Owada Y., 2008): - Brain (B): privilegia il legame con n-3 ed in particolare con DHA; - Epidermal (E): ha massima espressione a livello embrionale e può essere utile per la rigenerazione di neuroni lesionati; - Heart (H): viene espresso in età adulta in grandi quantitativi ed è necessario per la differenziazione delle cellule.
Alcuni studi hanno proposto un modello matematico per la valutazione della percentuale di acidi grassi che passano dal plasma al cervello in forma acilata e dalla forma acilata all’incorporazione all’interno della struttura fosfolipidica, in relazione al tasso di turnover e di emivita nei fosfolipidi stessi. Queste relazioni sono nel seguente modello (Rapoport et al., 1997; Robinson et al., 1992):
dc*br,i / dt= k*ic*pl
dove: • i: tasso di incorporazione di acidi grassi dal plasma a compartimenti stabili lipidici nel cervello • k*i: (mLs-1g-1 o sec-1): coefficiente di incorporazione• c*pl: concentrazione di acidi grassi non esterificati nel plasma • c*br,i: concentrazione di i nel cervello
Gli stessi Autori hanno anche evidenziato che l’incorporazione di acidi grassi nei fosfolipidi del cervello, sembra essere indipendente dal flusso ematico che giunge al cervello, poiché solo specifici acidi grassi entrano in particolari posizioni nei diversi fosfolipidi (Rapoport, 2000).
I PUFA a lunga catena, oltre ad essere assorbiti dal sangue, possono essere sintetizzati nel cervello partendo dai loro precursori.
Il processo inizia a partire da una prima elongazione e desaturazione svolta dalle cellule endoteliali della BEE (Moore et al., 1990).
Anche gli astrociti contribuiscono al pool acidico producendo AA e DHA (Moore et al., 1991).
Durante lo sviluppo cerebrale è possibile assistere ad una conversione di ALA in DHA, anche se in percentuali molto basse (Dhopeshwarkar e Subramanian, 1976), e all’incorporazione dei PUFAs in fosfolipidi ad opera di un’ acil-transferasi (Green e Yavin, 1993; Yamashita et al., 1997).
Il contributo endogeno alla neosintesi risulta quindi ininfluente in relazione al pool acidico totale presente nell’organismo.
1.8 La composizione in acidi grassi e i disturbi cerebrali nell’uomo
Grazie ai numerosi studi effettuati sui maiali ad oggi è possibile affermare che questi animali possono essere utilizzati come modelli dei disturbi neurodegenerativi dell’uomo e possono riferire informazioni riguardati le varie patologie cerebrali (Holm et al., 2016; Eaton e Wishart, 2017); i suini possono essere quindi considerati simili all’uomo per quanto riguarda l'anatomia, la mielinizzazione delle cellule neuronali e le variazioni comportamentali.
Nel corso degli ultimi anni sono state analizzate molte condizioni patologiche neurodegenerative umane legate ai disturbi cerebrali e comportamentali, hanno evidenziato che lo stress ossidativo riveste un ruolo cruciale nel progresso e nello sviluppo delle diverse anomalie neuronali, attraverso la perdita di acidi grassi polinsaturi essenziali legati a lipidi di membrana; si presume che questo possa essere uno dei fattori che inneschi la progressione della patologia (Petursdottir et al., 2008).
Anche la dieta assume un ruolo molto importante; il rapporto che si ha tra gli acidi grassi delle serie n-6 e n-3, influisce in maniera importante sul metabolismo che porta alla formazione di eicosanoidi, sulla comunicazione che si ha tra le cellule e sulla modulazione enzimatica.
Tra gli eicosanoidi si trovano i prostanoidi ed i leucotrieni, che apportano risposte metaboliche differenti in base all’equilibrio esistente tra n-6/n-3; un eccessivo apporto di n-6 è stato considerato dannoso per la promozione di infiammazioni croniche, ischemie cardiache, diabete, artrite ed in particolare anche alterazioni cerebrali (Connor, 2000; James et al., 2000), mentre l’influenza degli n-3 è stata valutata essenziale in fase prenatale per l’accrescimento del feto e lo sviluppo del sistema nervoso dopo la nascita;
apporti deficitari di tali acidi grassi n-3 hanno evidenziato, in studi effettuati su topi, uno sviluppo di difetti a livello comportamentale (Birch et al., 2000; Yavin et al., 2001), disturbi bipolari, schizofrenia, deficit dell’attenzione, morbo di Parkinson e di Alzheimer.
Dagli studi svolti riguardanti queste patologie si è riscontrato che i PUFA possano svolgere un ruolo importante per le interazioni esistenti tra i lipidi e le proteine delle membrane cerebrali; in particolare DHA e AA risultano componenti fondamentali della barriera fosfolipidica.
I recettori, infatti, sono principalmente sostanze proteiche e la loro conformazione e funzionalità dipende molto dagli acidi grassi presenti in membrana (Mitchell et al., 1998; Sheila, 2007) che a loro volta variano anche in relazione all’ apporto dietetico (Simopoulos et al., 2000).
L’acido docosaesaenoico (DHA, 22: 6n-3) è un acido grasso che nel sistema nervoso si presenta in concentrazioni elevate rispetto agli altri acidi grassi ed è fondamentale per il suo funzionamento; un deficit di DHA in età di sviluppo infatti sembra infatti predisporre alla progressione di disturbi legati alla vista, al comportamento e mentali; sembra inoltre che l’ingresso del DHA nel tessuto nervoso sia particolarmente selettivo e indirizzato in maniera puntuale alla sintesi fosfolipidica.
Tra gli acidi grassi il DHA è quindi fondamentale per la sintesi fosfolipidica e per il ruolo che i fosfolipidi hanno nell’apoptosi cellulare: incrementano la presenza di un particolare fosfolipide, la fosfatidilserina (PS), che ha un ruolo protettivo in relazione alla morte delle cellule. Un abbassamento dei livelli di DHA nel tessuto porta quindi ad una conseguente riduzione di PS (Sheila, 2007; Kim et al., 2014).
Anche l’acido arachidonico assume un ruolo importante a livello del metabolismo de cervello; la sua diminuzione potrebbe ostacolare la produzione di importanti metaboliti attivi, quali prostaglandine e leucotrieni, che a loro volta potrebbero determinare cambiamenti funzionali propri della malattia di Alzheimer (Chuang et al., 2015).
Rispetto ad altri organi, il cervello ha un contenuto insolitamente elevato di lipidi e circa 2/3 di questi sono costituiti da fosfolipidi (PL) (Cullis et al., 1985). Modifiche anche minime nella composizione dei fosfolipidi possono incidere sulla loro funzionalità, modificando alcune importanti funzioni come la permeabilità e la fluidità della membrana.
Due delle principali componenti fosfolipidiche presenti nel cervello sono la fosfatidilcolina (PC) e la fosfatidiletanolammina (PE); queste presentano una composizione in acidi grassi peculiari: la PC contiene per lo più acidi grassi saturi e 18:1, mentre la PE è ricca in PUFA (30-40%), tra cui DHA (Pollet et al., 1978; Pettegrew et al., 2001; Sakai et al., 2007).
Studi effettuati su quattro diverse regioni cerebrali, in cui sono stati analizzati questi due particolari fosfolipidi, riportano che nel caso di malattie neurodegenerative come l’Alzheimer, si verificano delle variazioni della composizione in acidi grassi in in particolare della PE (Soderberg et al., 1991). In particolare, in pazienti affetti da Alzheimer, la composizione in acidi grassi della PE non presenta particolari modifiche degli acidi ma un importante aumento degli acidi grassi saturi C14:0, C16:0 e C18:0, e una contemporanea diminuzione degli acidi grassi polinsaturi C20:4, C22:4 e C22:6. Per
quanto riguarda invece PC, non avendo una composizione particolarmente ricca in PUFA, non vengono riscontrate grosse variazioni.
Non è ancora stata confermata la relazione esistente tra queste variazioni e la malattia stessa, ma è probabile che le alterazioni del rapporto tra acidi grassi saturi/polinsaturi possano influenzare la funzione cellulare, che a loro volta provoca alcune deficienze neuronali.
L’Alzheimer non può essere definito come un normale invecchiamento per diversi motivi; uno di questo è che la composizione in acidi grassi dei fosfolipidi (ed in particolare della PE) presenta delle profonde differenze rispetto ad un cervello “invecchiato sano” (Gottfries C.G., 1986). Ciò potrebbe essere dovuto a queste principali cause:
§ una modifica del sistema di desaturazione microsomiale con diminuzione dell'attività del NADH/citocromoB5 reduttasi, l'enzima iniziale comune a vari processi di desaturazione (Jeffcoat, 1979; Burgess et al., 2000);
§ una carenza di assorbimento che diminuisce la presenza di substrati appropriati come gli acidi grassi essenziali linoleico e linolenico la cui deplezione nel cervello spiegherebbe la perdita dei PUFA, che sono sintetizzati nell’organo a partire da questi due acidi (Spector, 1999);
§ un cambiamento nella composizione cellulare del cervello nei soggetti affetti da Alzheimer, che potrebbe coinvolgere la gliosi (processo di sviluppo degli astrociti in zone danneggiate del tessuto nervoso) o una riduzione del numero di dendriti.
2 PARTE SPERIMENTALE
2.1 OBIETTIVO
La relazione tra la composizione della dieta, in particolare sotto il profilo della composizione in acidi grassi, e il suo possibile trasferimento ai singoli tessuti è stato studiato in maniera ampia.
Sono molti gli studi che hanno investigato l’effetto dell’alimentazione degli animali sulla qualità nutrizionale dei prodotti de essi ottenuti, pochi invece, riguardano il metabolismo lipidico di un organo particolarmente complesso come il cervello. Il cervello del suino è paragonabile nella struttura anatomica e istologica a quello dell’uomo (Arbuckle et al., 2003) e può pertanto essere utilizzato efficacemente come modello per lo studio di alcune patologie legate, più o meno direttamente, all’alimentazione; tra queste l’obesità, il diabete, la dislessia, ed i morbi di Parkinson e Alzheimer. Alcune di queste patologie sono messe in relazione a modifiche della composizione dei lipidi del cervello e, in particolar modo, alla composizione dei fosfolipidi. In questo ambito, l’alimentazione potrebbe avere un ruolo non secondario. Assume quindi particolare importanza lo studio dei meccanismi che regolano la composizione dei lipidi del cervello in relazione a diversi regimi alimentari.
Esistono già alcuni studi effettuati su suini in accrescimento che affermano che la dieta può influire sulla composizione in acidi grassi del cervello. Tuttavia, per l’importanza della questione e per il fatto che gli studi in merito non sono molto numerosi, pare importante approfondire lo studio dell’argomento.
Questa ricerca ha voluto verificare il rapporto tra l’alimentazione e le frazioni fosfolipidiche del cervello del suino. L’indagine si è proposta come un contributo all’interpretazione dei meccanismi che regolano la sintesi dei fosfolipidi e del colesterolo del cervello in relazione all’alimentazione e, in particolare, sui meccanismi che regolano la digestione, l’assorbimento e il trasporto delle frazioni lipidiche dal sistema digerente alla barriera ematoencefalica nel suino. 2.2 MATERIALI E METODI
La sperimentazione è stata condotta in una azienda suinicola della provincia di Pisa, l’azienda Agricola Stassano presso Peccioli, località I Cedri. L’allevamento è strutturato secondo un ciclo produttivo di tipo "chiuso", con la presenza di tutte le fasi dell'allevamento, dalla riproduzione all'ingrasso.
Il periodo di prova ha avuto la durata di circa dieci mesi, nel corso dei quali è stato seguito l’intero ciclo di vita dei suini soggetti alla sperimentazione che ha avuto inizio nel mese di dicembre del 2016 e si è concluso nel mese di ottobre del 2017.
La sperimentazione è stata condotta su 30 suini meticci Large White x Landrace, suddivisi dopo lo svezzamento, in 2 gruppi di 15 soggetti ciascuno; la formazione dei gruppi è stata fatta in modo da mantenere i gruppi uniformi per peso e sesso. Tutti i suinetti sono nati dal 10 al 18 dicembre 2016 e sono stati svezzati il 12/01/2017 quando è iniziata realmente la prova sperimentale.
I due gruppi di suinetti sono stati alimentati con due mangimi differenti, il gruppo sperimentale (S) è stato alimentato con una dieta contenente il panello di soia, mentre il gruppo di controllo (C) con una dieta contenente farina di estrazione di soia. Nella
Tabella 1 vengono riportate le % dei diversi componenti della razione nei due periodi di allevamento monitorati e suddivisi per gruppo.
Tabella 1. Razioni dei suini in prova
Gruppo Componenti fase di magronaggio (%) Fase di ingrasso (%) C (controllo) mais cereali misti crusca soia panello orzo favino F.E. soia 33.6 13.7 12.8 0.0 8.9 5.3 11.5 55 3.5 15.7 0 5 6 11.8 S (sperimentale) mais cereali misti crusca soia panello orzo favino F.E. soia 30.1 13.7 17.1 9.5 10.7 5.3 0.0 54 4 15 9 5 10 0
Gli animali sono stati sacrificati al raggiungimento del peso vivo di circa 150 kg presso il mattatoio di S. Miniato (PI).
Dopo la macellazione, le mezzene dei 27 soggetti sperimentali sono state trasferite per la sezionatura presso la Norcineria Falaschi (San Miniato), dove dopo 48 ore dalla macellazione sono state effettuati i campionamenti di muscolo longissimus dorsi per le analisi finalizzate alla determinazione della qualità della carne: composizione chimica centesimale (umidità, proteina grezza, estratto etereo, ceneri), e per le principali determinazioni biochimiche (composizione degli acidi grassi del grasso di copertura e del grasso intramuscolare, e il contenuto di colesterolo della carne).
Il cervello è stato prelevato da ogni mezzena di soggetti femmina; su questo sono stati determinati la composizione biochimica completa comprendente la valutazione degli acidi grassi, dei fosfolipidi con le sue frazioni e del colesterolo totale.
Sulla granella e sul panello di soia sono state effettuate le determinazioni analitiche chimiche: umidità, proteine grezze, proteine solubili, frazioni fibrose (NDF, ADF, ADL), estratto etereo; biochimiche: composizione degli acidi grassi; mentre sull’olio di soia oltre alla composizione degli acidi grassi abbiamo valutato anche il numero di perossidi e l’acidità libera.
Subito dopo la sezionatura i campioni sono stati trasferiti presso il laboratorio di Scienze Zootecniche del Dipartimento di Agronomia e Gestione dell’Agroecosistema. Allo scopo di minimizzare i fenomeni ossidativi, i campioni sono stati avvolti in alluminio, confezionati sottovuoto e stoccati a –20°C fino al momento delle determinazioni analitiche delle quali riporto le metodiche più importanti.
2.2.1
Determinazione della composizione in acidi grassi
La determinazione della composizione acidica è stata effettuata dopo trans-esterificazione base catalizzata a freddo con metilato sodico in soluzione metanolica 0.5N (Christie, 1982). La trans-esterificazione è stata effettuata direttamente sui campioni di cervello. Brevemente: circa 15 mg di cervello, accuratamente pesati sono stati dissolti in 30 mL di una soluzione di cloroformio/metanolo 2/1. Il campione è stato filtrato su carta da filtro rapida in un pallone a collo a smeriglio e portato a secco in rotavapor; quindi, aggiunto di 1 mL di agente metilante, è stato sottoposto a vigorosa agitazione e lasciato a sé per 15 min. Gli esteri metilici degli acidi grassi sono stati quindi estratti con 0.5 mL di esano contenente lo standard interno (l’estere metilico del C19:0). 1 microlitro di esteri metilici degli acidi grassi ottenuti come sopra riportato, è stato quindi iniettato in un gascromatografo dotato di rilevatore a ionizzazione di fiamma (FID) e di una colonna
capillare altamente polare di 100m di lunghezza, 0.25mm di diametro interno e di 0.25 μm di spessore della fase stazionaria. La determinazione della composizione in acidi grassi è stata effettuata in temperatura programmata (tabella 2). La temperatura dell’iniettore era di 270 °C, mentre quella del rilevatore di 300 °C; il gas di trasporto utilizzato era l’elio ad un flusso di 250 kPa misurato in testa alla colonna e l’iniezione, effettuata in modalità split, è avvenuta a pressione costante; il rapporto di splittaggio era fissato in 1/80.
Tabella 2. Temperatura programmata utilizzata per la determinazione della composizione in acidi grassi Stadio Temperatura (°C) Tempo isoterma (min) Gradiente (°C/min)
1 150 4 2 2 180 18 2 3 200 1 5 4 240 4
2.2.2
Determinazione del colesterolo dei suoi prodotti di ossidazione (COPs)
Dopo l’aggiunta di betulinolo come standard interno per il colesterolo, il campione di cervello accuratamente pesato è stato sottoposto a saponificazione a freddo utilizzando KOH in soluzione metanolica 1N. La saponificazione è stata fatta direttamente sul campione di cervello. 250 mg di cervello accuratamente pesati sono stati mantenuti nella soluzione saponificante in agitazione per tutta la notte in provette protette dalla luce per limitare i processi di foto-ossidazione. La mattina successiva il campione è stato sottoposto a 3 lavaggi consecutivi con acqua ed etere (per eliminare i saponi degli acidi grassi), con il quale veniva raccolto l’insaponificabile, che dopo esserestato raccolto in pallone tarato veniva portato a secco con evaporatore rotante e nuovamente pesato. Infine, la frazione insaponificabile è stata solubilizzata in 3 mL di esano:isopropanolo 4:1 (V/V).
Per eliminare il colesterolo in eccesso, una parte della frazione insaponificabile è stata sottoposta a separazione in fase solida utilizzando colonnine SPE-NH2.
Prima di effettuare la separazione il campione è stato parzialmente portato a secco in corrente d’azoto e caricato sulla colonnina previo condizionamento con 3 ml di esano. L’eluizione con tre diverse soluzioni eluenti a polarità crescente ha permesso di ottenere tre frazioni: la prima eluita con esano/etilacetato 95/5 vol./vol. viene scartata, la seconda eluita con esano/etilacetato 9/1 vol./vol. costituisce i fitosteroli, e la terza eluita utilizzando acetone rappresenta i COPs.
La parte di insaponificabile “purificata” dal colesterolo e la parte dell’insaponificabile non sottoposta ad SPE, sono state portate a secco sotto flusso d’azoto e sono state poi silanizzate utilizzando una miscela di piridina, esametildisilazano, trimetilclorosilano 5/2/1 vol./vol./vol. Il campione è stato nuovamente portato a secco e poi ripreso con 300 μl di esano.
Le determinazioni del colesterolo è stata effettuata in temperatura programmata (Tabella 3).
Tabella 3. Temperatura programmata utilizzata per la determinazione del contenuto in colesterolo e in COPs
Stadio Temperatura (°C) Tempo isoterma (min) Gradiente (°C/min)
1 250 0 1
2 270 0 10
2.2.3
Determinazione dei fosfolipidi e delle frazioni lipidiche
Un’aliquota dell’estratto lipidico totale è stata poi separata nella frazione polare (identificabile con i fosfolipidi) ed apolare (identificabile con i trigliceridi). L’estratto lipidico in ragione di 100 mg viene posto in vial tarata e successivamente seccata in corrente di azoto e diluita con 0.5 ml in cloroformio. Il campione preparato viene quindi iniettato nella cartuccia monouso del tipo Sep-Pak Cartridges della ditta Waters – Milford, Massachussetts- USA che separa le componenti lipidiche su colonna adottando il metodo Juaneda, Roquelin (1985).
La cartuccia contenente il campione viene eluita con 20 ml di cloroformio separando la prima frazione di Lipidi Neutri (LN); nella eluizione successiva con 5 ml di Cloroformio/Metanolo (49:1) vengono separati i monogliceridi (MG) e infine con l’aggiunta di 30 ml di Metanolo si ottengono i Fosfolipifi (PL). Le frazioni cosı̀ ottenute vengono portate a secco con rotovapor e dopo una notte in essiccatore le diverse frazioni vengono riprese dopo averle pesate, in cloroformio i PL e i MG, mentre in esano/isopropanolo (4:1 v/v) i LN.
