UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI GENOVA
Dipartimento di Farmacia
Scuola di Scienze Mediche e Farmaceutiche
Corso di Laurea specialistica in Farmacia
L’evoluzione del ruolo degli astrociti e il loro contributo nella
patogenesi della Sclerosi Laterale Amiotrofica
Candidato:
Relatore
Bianca de Marchis
Dott.ssa Bonifacino Tiziana
Indice
1. La Fisiologia dell’astroglia ... 4
1.1 Definizione e funzione degli astrociti... 4
1.2 Cenni storici ... 5
1.3 Le principali funzioni fisiologiche degli astrociti ... 7
1.3.1 Omeostasi di ioni e di molecole ... 8
1.3.2 Regolazione della connettività sinaptica e della trasmissione sinaptica ... 19
1.3.3. Gli astrociti regolano la microcircolazione cerebrale: il concetto di unità neurovascolare. ... 25
1.3.4. Astrociti e funzioni cognitive superiori. ... 26
2. Il ruolo degli astrociti nelle patologie neurodegenerative ... 29
2.1 Gli astrociti nelle malattie neurodegenerative ... 29
2.2 La gliosi reattiva ... 29
2.3 Il ruolo degli astrociti nel morbo di Alzheimer ... 30
2.3.1 Tossicità mediata dagli astrociti nel morbo di Alzheimer ... 31
2.4 Il ruolo degli astrociti nella malattia di Huntington ... 31
2.4.1 Tossicità mediata dagli astrociti nella malattia di Huntington... 32
2.5 Il ruolo degli astrociti nel morbo di Parkinson ... 33
2.5.1 Tossicità mediata dagli astrociti nel morbo di Parkinson ... 34
2.6 Osservazioni generali del ruolo degli astrociti nelle patologie neurodegenerative ... 35
3. Il ruolo multidimensionale degli astrociti nella sclerosi laterale amiotrofica ... 37
3.1 La Sclerosi Laterale Amiotrofica: la patologia ... 37
3.2 Neurodegenerazione nella SLA: un fenomeno che coinvolge più tipi cellulari ... 38
3.3 Astrogliosi nella SLA ... 39
3.4 Contributo degli astrociti nei modelli sperimentali della SLA ... 41
3.5 Meccanismi di neurotossicità mediata dagli astrociti nella SLA ... 43
3.5.1 Eccitotossicità ... 44
3.5.2 La disfunzione metabolica neuronale ... 46
3.5.3 Stress ossidativo e disfunzione mitocondriale ... 46
3.5.4 I recettori dei segnali di morte ... 47
3.5.5 Segnalazione relativa a TNFα... 48
3.5.6 Segnalazione Fas/FasL ... 48
3.5.7 Segnalazione LIGHT/LT-βR ... 49
3.5.8 Segnalazione NFG/p75 NTR ... 49
4. Potenziale terapeutico degli astrociti nella SLA ... 54
4.1 Target molecolari per ridurre la tossicità mediata da astrociti ... 54
4.2 Il processo di Drug discovery ... 56
4.3 Terapie di sostituzione cellulare ... 57
4.4 Supporto trofico potenziato ... 60
5. Conclusioni ... 61
1. La Fisiologia dell’astroglia
1.1 Definizione e funzione degli astrociti
Nel 1856 Rudolf Virchow coniò il termine neuroglia per descrivere gli elementi che riempiono lo spazio non occupato dai neuroni nel sistema nervoso centrale (SNC) (Kettenmann e Verkhratsky, 2008). La neuroglia può essere ulteriormente suddivisa in macroglia e microglia. La macroglia deriva dall'ectoderma e comprende astrociti (o cellule astrogliali), oligodendrociti e progenitori NG2-positivi. La microglia, ossia i macrofagi residenti nel SNC, ha invece un'origine mesodermica. Il rapporto tra glia e neuroni varia a seconda della regione del SNC e delle specie studiate. Tuttavia, il concetto tradizionale secondo cui le cellule gliali superano di gran lunga le cellule neuronali non sembra essere vero; il cervello umano contiene circa lo stesso numero di cellule gliali e neuronali (Pelvig et al., 2008; Sun et al., 2017; Bartheld et al., 2016).
Indipendentemente dall'effettivo rapporto glia - neuroni nel cervello umano (Gabi et al., 2016; Sherwood et al., 2006), gli astrociti costituiscono una grande porzione della popolazione di cellule gliali del SNC e svolgono una grande quantità di funzioni essenziali. L’astroglia, definita anche come astrociti, è una classe di cellule neurali di origine ectodermica e neuroepiteliale che mantiene l'omeostasi e provvede alla difesa del sistema nervoso centrale. Gli astrociti presentano forma e funzione variabile, dimostrando una notevole plasticità adattativa, che caratterizza il mantenimento funzionale del SNC sia durante lo sviluppo che durante l’invecchiamento. Queste cellule sono finemente integrate nelle reti neurali ed agiscono a seconda del tessuto neurale in cui si trovano. Gli astrociti controllano l'omeostasi del SNC dal molecolare fino a un intero organo: trasportano ioni e protoni principali, rimuovono e catabolizzano i neurotrasmettitori, rilasciano i precursori dei neurotrasmettitori e gli scavengers delle specie reattive dell'ossigeno. Queste cellule danno inoltre luogo alla neurotrasmissione, rifornendo i neuroni con precursori di neurotrasmettitori e controllando l'omeostasi cellulare attraverso la neurogenesi embrionale (che si verifica dalla glia radiale) e la neurogenesi adulta (che coinvolge astrociti staminali di nicchie neurogenetiche). Gli astrociti sono coinvolti nella regolazione dell'omeostasi metabolica attraverso la sintesi del glicogeno e la fornitura ai neuroni di substrati energetici. Definiscono inoltre la citoarchitettura della materia grigia piastrellando quest'ultima, formando contatti con la vascolarizzazione su tutta la superficie del cervello. Le estremità vascolari rilasciano sostanze vasoattive contribuendo così all'iperemia funzionale. Gli astrociti controllano la barriera emato-encefalica e agiscono come chemosensori, contribuendo così all'omeostasi sistemica (regolazione del bilancio energetico, del
pH del sangue e della concentrazione di sodio). Infine, gli astrociti (insieme alle microglia) rappresentano il principale sistema difensivo del SNC.
Queste numerose funzioni degli astrociti sono di vitale importanza per il corretto funzionamento, sviluppo e adattamento del SNC.
1.2 Cenni storici
Rudolph Virchow ha introdotto il concetto di neuroglia nel 1826 – 1827 definendola come vero tessuto connettivo del cervello, senza fare grosse considerazioni sulla sua natura cellulare. Virchow si riferiva alla neuroglia come una specie di massa intermedia, nella quale gli elementi del sistema nervoso “sono incorporati".
Il primo caso di cellule neurali, che è stato successivamente classificato come glia, è stato, tuttavia, prodotto qualche tempo prima rispetto alla riflessione di Virchow. Si trattava di una cellula gliale radiale della retina, la cellula Müller, descritta da Heinrich Müller nel 1851 (Müller, 1851). Queste cellule furono successivamente caratterizzate nei minimi dettagli da Max Schulze (Schulze, 1859). Nel 1857 Karl Bergmann (Bergmann, 1857) scoprì le cellule gliali radiali del cervelletto, oggi conosciute come cellule gliali di Bergmann. La glia parenchimale ha ricevuto molta attenzione dai neuroscienziati del XIX secolo: sono state pubblicate numerose descrizioni dettagliate di queste cellule sotto molti nomi diversi.
La neuroglia parenchimale è stata chiamata “Bindesubstanzzelle” (cellule leganti o cellule connettivali) da Otto Deiters (Deiters, 1865) o “Fasernetz sternförmiger Zellen” (cellule stellate formanti una rete di fibre) da Leopold Besser (Besser, 1866). Carl Frommann (Frommann, 1867) è stato il primo ad attribuire la connotazione “colla” alla glia “Leim erfüllten Interstitien” (interstizio riempito di colla); Albert von Kölliker (Kölliker, 1896) ha chiamato le cellule gliali “Sternförmige Zellen” (cellule a forma di stella), Eduard Rindfleisch (Rindfleisch, 1873) le ha chiamate “Stützcelle” o “Neurogliazellen” (cellule di supporto o cellule neurogliali), Victor Butzke (Butzke, 1871) le ha chiamate “Gliakörperchen” (corpi gliali), Moritz Jastrowitz (Jastrowitz , 1870; Jastrowitz, 1872) le chiamavano “Spinnenähnliche Gliazellen” o “Spinnezellen” (cellule gliali di ragno o cellule di ragno), Gustaf Magnus Retzius (Retzius,1894) le chiamava invece “Gliäcyten Sternzellen” (gliociti o cellule stellari).
Camillo Golgi (che ha sempre usato il termine neuroglia) è stato il primo a dimostrare che la glia rappresenta una popolazione cellulare distinta dalle cellule nervose, sebbene ritenesse anche che le cellule gliali e i neuroni potessero convertirsi gli uni negli altri. Golgi identificò la glia come cellule
rotonde con numerosi processi fini estesi in tutte le direzioni, molti dei quali diretti verso i vasi sanguigni (Golgi, 1870). Usando la tecnica di colorazione a base di cromo-argento (reazione nera), Golgi ha descritto una notevole diversità di cellule gliali nel cervello, ha inoltre descritto le reti gliali e ha identificato i vasi sanguigni di rivestimento delle estremità gliali (Golgi, 1870; Golgi,1885; Golgi, 1903).
La tecnica di impregnazione al cromo-argento è stata anche determinante per la visualizzazione e l'identificazione della glia radiale (Bentivoglio e Mazzarello, 1999). Il termine astrocita (astron = stella e kytos = vaso cavo, in seguito cellula a forma di stella) è stato introdotto da Michael von Lenhossék nel 1895 (Lenhossék, 1895). Profeticamente Lenhossék ha proposto di chiamare la glia parenchimale come spongiociti, essendo gli astrociti un sottotipo. Poco prima, Albert von Kölliker e William Lloyd Andriezen avevano già distinto la materia grigia da quella bianca; Andriezen aveva chiamato le cellule gliali della materia grigia materia protoplasmatica, quelle della materia bianca invece materia fibrosa. Il termine astrociti per indicare la neuroglia parenchimale è stata divulgata da Santiago Ramón y Cajal.
La maggior parte dei neuroscienziati del XIX e inizio del XX secolo [con la singolare eccezione di Carl Weigert, che pensava che la glia fosse necessaria solo per colmare le lacune tra i neuroni (1871)], assegnò numerose funzioni agli astrociti. Golgi, per esempio, definì la glia come deposito di materiale nutritivo (Golgi, 1885; Golgi 1903). Ernesto Lugaro aveva invece ipotizzato che i processi gliali molto fini fossero capaci penetrare le sinapsi e metabolizzarne le sostanze neuroattive (Lugaro, 1907).
Il ruolo attivo degli astrociti nel controllo del flusso di informazioni nel cervello è stato suggerito da Carl Ludwig Schleich, il quale aveva postulato che i processi astrogliali potessero controllare la trasmissione sinaptica (Schleich, 1894). Idee simili sono state sostenute da Ramon e Cajal, che pensavano che la diminuzione dei processi astrogliali permettesse il flusso di informazioni durante lo stato veglia, mentre l'espansione dei processi astrogliali bloccasse la connettività internauronale, inducendo così il sonno (Ramón e Cajal, 1895). Cajal ha anche suggerito il ruolo centrale degli astrociti nel controllo della vascolarizzazione del cervello e nella mediazione dell'iperemia funzionale: la contrazione/rilassamento dei processi perivascolari astrogliali potrebbe aumentare o diminuire il diametro dei capillari cerebrali, regolando così il flusso sanguigno (Ramòn e Cajal, 1895). Fernando de Castro, allievo di Cajal, ha proposto successivamente che le cellule neurogliali potrebbero rilasciare sostanze neuroattive e partecipare direttamente alla trasmissione neurale (De Castro, 1951). Robert Galambos, invece, considerava la neuroglia come un elemento centrale per le
funzioni cerebrali superiori, mentre i neuroni erano le cellule capaci di "eseguire semplicemente le istruzioni che le glia dava loro" (Galambos, 1961).
Il tema della glia come elemento primario dell'elaborazione delle informazioni, della memoria, della cognizione e della coscienza riemerge regolarmente (Caudle, 2006; Pereira, et al., 2010; Pereira et al., 2013; Bellini-Leite e Pereira, 2013; Robertson, 2013); questa ipotesi così stimolante manca solo di supporto credibile sperimentale. L’esame fisiologico della neuroglia ha avuto inizio alla fine degli anni '50. Alla fine degli anni '80, Jean de Villis ha purificato colture di cellule neurogliali, che hanno permesso di eseguire l'esame diretto della fisiologia degli astrociti a livello della singola cellula (Morrison e de Vellis, 1981).
1.3 Le principali funzioni fisiologiche degli astrociti
Gli astrociti svolgono un ruolo in quasi tutti i processi fisiologici che assicurano il benessere dei neuroni nel SNC sano. Ad esempio, gli astrociti regolano il volume e la composizione dello spazio extracellulare (controllando la concentrazione degli ioni, il movimento dell'acqua e la ricaptazione di neurotrasmettitori), regolano la creazione e il mantenimento della barriera emato-encefalica, controllano il flusso sanguigno cerebrale in risposta all'attività neuronale e modellano la connettività sinaptica. Inoltre, gli astrociti regolano la trasmissione sinaptica in quella che è stata chiamata "sinapsi tripartita" e svolgono un ruolo chiave nell'integrazione ed elaborazione delle informazioni sinaptiche (Koehler et al., 2009; Perea et al., 2009; Vargas e Johnson, 2010; Chung et al., 2013). Infine, la capacità degli astrociti di produrre e rilasciare metaboliti energetici e antiossidanti è essenziale per la normale funzione metabolica neuronale (Vargas e Johnson, 2009; Belanger et al., 2011; Fernandez-Fernandez et al., 2018).
L'attività neuronale è un processo impegnativo ad alta energia; attraverso lo shuttle del lattato tra astrociti e neuroni, il lattato prodotto dagli astrociti sostiene il fabbisogno energetico dei neuroni. Inoltre, il metabolismo del glutatione negli astrociti aumenta le difese antiossidanti neuronali e protegge i neuroni dall'aumento dello stress ossidativo derivante dalla neurotrasmissione e dall'attività metabolica (Vargas e Johnson, 2009; Belanger et al., 2011; Bolanos, 2016; Fernandez-Fernandez et al., 2018). La disregolazione di questa connessione tra astrociti e neuroni, fattore chiave per la normale funzione cerebrale, può contribuire alla morte neuronale durante la neurodegenerazione.
1.3.1 Omeostasi di ioni e di molecole
L'omeostasi ionica del SNC è di fondamentale importanza per la funzione nervosa, perché definisce l'eccitabilità complessiva e i principali processi di segnalazione. Le concentrazioni di ioni nel tessuto nervoso, tuttavia, non sono statiche e le variazioni del flusso ionico regolano importanti processi sistemici come la memoria (Hertz e Chen, 2016) o il sonno (Ding et al., 2016). Gli astrociti, attraverso numerosi trasportatori di ioni, sono fondamentali per la regolazione dell’omeostasi.
1.3.1.1 Omeostasi del potassio
Il controllo della concentrazione interstiziale del potassio è una delle funzioni base svolte dall'astroglia. Il ruolo chiave degli astrociti nel mantenere l'omeostasi di potassio extracellulare nel SNC è stato proposto a metà degli anni '60 da Leif Hertz, Steven Kuffler e Richard Orkand. Sia la via mediata dal trasportatore NKA (Hertz, 1965) che la diffusione attraverso i canali del potassio (Orkand et al., 1966) sono stati suggeriti come meccanismi fondamentali. Aumenti di concentrazione di potassio durante l'attività neuronale sono associati a ripolarizzazione da efflusso di potassio (Hodgkin e Huxley, 1952), con un singolo potenziale d'azione che aumenta il potassio locale di ~1 mM (Ransom et al., 2000).
Inoltre, il potassio in uscita è collegato all’attivazione di recettori ionotropi post-sinaptici del glutammato (Rice e Nicholson, 1990), con efflusso di potassio particolarmente elevato attraverso i recettori NMDA (Shih et al., 2013) o con rilascio di ioni K+ tramite il co-trasportatore K+/Cl- attivato durante la trasmissione GABAergica (Viitanen et al., 2010). Il potassio extracellulare può anche aumentare in seguito all'efflusso di K+ dagli astrociti associati al funzionamento dei trasportatori di glutammato EAAT1/2.
Probabilmente, la maggior parte di potassio rilasciato nei compartimenti sinaptici è associato alle arborizzazioni dendritiche, mentre i potenziali d'azione assonali rappresentano una frazione minore di K+ che entra nello spazio interstiziale (Hertz, 2011; Howarth et al., 2012).
Gli aumenti fisiologici della concentrazione di potassio ([K+]) nel tessuto nervoso che si verificano in relazione all'attività neuronale sono piuttosto moderati; per esempio, la stimolazione meccanica della pelle provoca un aumento di 0,4 mM di [K+] nel midollo spinale (Heinemann et al., 1990), mentre la [K+] aumenta di 0,5 mM nella corteccia occipitale in risposta alla stimolazione visiva (Singer e Lux, 1975). L'aumento massimo di 3 mM è stato registrato nel midollo spinale in risposta alla stimolazione cutanea nociva (Svoboda et al., 1988).
Va ricordato, naturalmente, che le tecniche sperimentali per la misurazione della concentrazione ionica hanno delle grandi limitazioni, e che la concentrazione di potassio potrebbe essere più elevata in piccoli compartimenti extracellulari.
La regolazione astrogliale del K+ extracellulare è mediata da diversi meccanismi, generalmente classificati in:
1) diffusione attraverso i canali K+, 2) trasporto attivo con NKA, 3) trasporto con trasportatori SLC.
Tutti e tre i meccanismi hanno dimostrato la loro attività, come si è visto nei numerosi studi in vitro e in situ (Somjen, 2002; Kofuji e Newman, 2004; Olsen e Sontheimer, 2008; Hertz e Chen, 2016). Il concetto iniziale (Orkand et al., 1966; Walz, 1982; Kofuji e Newman, 2004) di funzione tampone dell’astrocita verso il potassio postulava che quest’ultimo entrasse nella glia attraverso i canali del potassio della membrana cellulare; successivamente, gli ioni K+ verrebbero ridistribuiti attraverso giunzioni cellulari ed in seguito rilasciati a distanza dal sito di ingresso.
Questo principio risulta funzionare anche a livello di una sola cellula di glia di tipo Müller.
Qui, il K+ entra in queste cellule attraverso i canali Kir4.1 (presenti nello strato interno della retina). Successivamente, il K+ viene rilasciato sempre attraverso i canali Kir4.1. Questo tipo di funzione tampone del potassio è stato definito “sifonamento” (Newman et al., 1984; Kofuji e Newman 2004). Il concetto di tamponamento del potassio si basa sulla capacità dei canali Kir4.1 di accumulare K+ localmente e sulle giunzioni cellulari, che permettono a loro volta la ridistribuzione dello ione stesso. Esperimenti in vitro hanno dimostrato che i canali Kir4.1 sono i principali responsabili della permeabilità del K+ a riposo degli astrociti e che tali canali potrebbero essere considerati i principali attori nella funzione di tamponamento della concentrazione di questo ione (Ballanyi et al.,1987; Neusch et al., 2001; Djukic et al., 2007; Kucheryavykh et al., 2007).
Inoltre, alcuni studi hanno dimostrato come la delezione genetica dei canali Kir4.1 causasse una significativa (~20 mV) depolarizzazione nel potenziale di membrana a riposo, diminuendo la permeabilità al K+. Quindi, il ruolo dei canali Kir4.1 nel tamponamento del potassio sembra essere molto importante, nonostante non sia un ruolo dominante, come suggeriscono altri studi (Larsen e MacAulay, 2014; Nwaobi et al., 2016). La densità dei canali Kir4.1 aumenta notevolmente nello sviluppo postnatale, e quindi gli esperimenti sugli animali più giovani potrebbero essere forvianti. Inoltre, l'espressione dei canali Kir4.1 differisce tra le diverse regioni cerebrali e, pertanto, il ruolo di questi canali nella funzione tampone dello ione K+ può avere una certa variabilità regionale.
Il tamponamento dello ione K+ mediato dalla via NKA è stato scoperto in esperimenti su astrociti in coltura (Hertz, 1979). Numerosi esperimenti successivi eseguiti nei preparati in situ hanno rivelato il ruolo primario della via NKA nella eliminazione del K+ extracellulare associata all'attività neuronale fisiologica (Ransom et al., 2000; Xiong ZQ e Stringer, 2000; D’Ambrosio et al., 2002; Larsen et al., 2014). Il K+ accumulato dagli astrociti mediante questo meccanismo viene successivamente rilasciato nello spazio extracellulare per essere ricaptato dai neuroni, ripristinando così i gradienti ionici.
Gli astrociti quindi tamponano rapidamente l'eccesso di K+ rilasciato durante l'attività neuronale; quando i neuroni pongono fine alla depolarizzazione, il K+ viene trasferito al compartimento neuronale (Hertz e Chen, 2016; Larsen et al., 2016). Il rilascio di K+ è mediato attraverso i canali di Kir4.1, i trasportatori SLC ed altri canali.
Anche il trasportatore Na+/K+/Cl- NKCC1 sembra partecipare al tamponamento del K+, nonostante il suo ruolo in situ e in vivo non sia stato ancora confermato (Larsenet al., 2014). L'NKCC1 è attivato da incrementi di K+ superiori a 10 mM (Walz e Hertz, 1984) o da ipertonicità extracellulare (Qusous et al., 2011) e può quindi contribuire alla clearance K+ nel contesto patologico.
Nel complesso, diversi sistemi astrogliali lavorano di comune accordo per garantire l’efficacia dell’omeostasi del potassio.
1.3.1.2 Omeostasi del cloruro
Una forte stimolazione dei recettori neuronali GABA può depletare le riserve dello ione Cl- tramite la fessura sinaptica. Gli astrociti rispondono allo stimolo dato dal GABA con un efflusso di Cl-; la secrezione di Cl- astrogliale, dunque, può contrastare l'ingresso del Cl- nei neuroni, mantenendo così la concentrazione dello ione, preservando la forza motrice del Cl- per sostenere la neurotrasmissione inibitoria (Kettenmann et al., 1987).
Questa ipotesi è stata confermata da recenti esperimenti che hanno dimostrato un ruolo astrogliale nel mantenimento della neurotrasmissione GABAergica.
Inoltre, questi esperimenti hanno rivelato il ruolo delle gap junction e del sincizio astrogliale per l'omeostasi del Cl-, dimostrando che l'inibizione delle connessioni durante una stimolazione intensa della trasmissione GABAergica dei neuroni CA1 porti ad un collasso del gradiente del Cl- in tali neuroni (Egawa et al., 2013).
1.3.1.3 Regolazione del Calcio extracellulare
Gli astrociti possono anche contribuire alla regolazione della concentrazione extracellulare di Ca2+. Nel corso dell'attività neuronale, la concentrazione dello ione Ca2+ in compartimenti extracellulari a livello dello spazio sinaptico subisce notevoli fluttuazioni dovute al massiccio afflusso di Ca2+ nei neuroni grazie all’attivazione di questi canali. La concentrazione extracellulare di Ca2+ può scendere al di sotto di 1 mM; ciò può influire sulla segnalazione di Ca2+ sia nel terminale presinaptico che nel comparto postsinaptico con evidenti conseguenze per la trasmissione sinaptica (Rusakov e Fine, 2003). Inoltre, l'abbassamento iniziale della concentrazione dello ione Ca2+ causa il rilascio astrogliale di ATP, che eccita gli interneuroni ippocampali (Torres et al., 2012). L'abbassamento della concentrazione extracellulare di Ca2+ a ~0.5 mM ha dimostrato di innescare il rilascio di Ca2+ indotto dal reticolo endoplasmatico negli astrociti (probabilmente mediato dal rilascio autocrino di ATP) (Zanotti e Charles, 1997). Questo può, almeno ipoteticamente, aiutare a ripristinare la concentrazione di calcio iniziale, perché lo ione Ca2+ può essere rilasciato dall'astrocita attraverso pompe di membrana o scambiatori di Na+/Ca2+.
1.3.1.4 Regolazione del pH
Il controllo omeostatico del pH citosolico ed extracellulare è di fondamentale importanza per la funzione cerebrale, perché anche una lieve acidificazione o alcalinizzazione influisce significativamente sull'eccitabilità neuronale e sulla trasmissione sinaptica. In condizioni di riposo, il gradiente elettrochimico dei protoni è diretto verso il citosol.
Il metabolismo neuronale è la principale fonte di protoni extracellulari, che vengono estrusi dal trasportatore Na+/H+ (antiporto Sodio/Idrogeno). La seconda fonte principale di protoni è associata all'esocitosi dei neurotrasmettitori perché il lume delle vescicole è altamente acido, con pH ~5.2-5.7 (Miesenböck et al., 1998). I protoni possono anche essere rilasciati dagli astrociti insieme al lattato. Gli astrociti regolano il pH extracellulare in due modi: rimuovendo gli ioni H+ con la ricaptazione da parte dei trasportatori EAAT1/2 con un singolo co-trasporto di H+ insieme ad una molecola di glutammato, e rifornendo lo spazio extracellulare con HCO3- attraverso il trasportatore Na+/HCO3 -(NBC), che può operare in entrambe le direzioni a seconda del potenziale di membrana e della [Na+] (Rose e Ransom, 1996; Deitmer e Rose, 2010). Il trasportatore NBC è molto sensibile ai livelli di bicarbonato essendo attivato da [HCO3-] fino a 0,3 mM (Deitmer e Schneider, 1998).
Gli astrociti rilasciano anche lo ione H+ grazie allo scambiatore Na+/H+ e forse anche grazie a pompe protoniche della membrana plasmatica (Hansen et al., 2015). Ciò coincide con una maggiore
capacità di tamponamento del pH astrogliale in situ rispetto a quella in vitro (Bevensee et al., 1997; Hansen et al., 2015).
1.3.1.5 Omeostasi dell'acqua e regolazione del volume dello spazio extracellulare Gli astrociti controllano i movimenti dell'acqua attraverso diverse vie, tra cui spiccano in particolare le acquaporine e i trasportatori di membrana. I canali acquaporina 4 (AQP4) si trovano vicino a Kir4.1 nelle estremità astrogliali. Questa collocazione così vicina e la possibile cooperazione dei canali AQP e Kir4.1 collega i canali K+ e i movimenti dell'acqua (Amiry-Moghaddam e Ottersen, 2003). L'accoppiamento funzionale tra Kir4.1 e AQP4, tuttavia, rimane discutibile, con alcune prove che dimostrano il funzionamento indipendente di questi due canali (Zhang e Verkman, 2008). La delezione genetica di AQP4 ha portato ad un aumento del volume extracellulare del 25% circa (Yao et al., 2008), mentre gli animali privi di AQP4 negli astrociti avevano un maggior contenuto di acqua cerebrale (Haj-Yasein et al., 2011). Gli astrociti contribuiscono anche a cambiamenti del volume extracellulare associati all'attività neuronale. La trasmissione sinaptica evoca una rapida e considerevole riduzione (5-30%) del volume extracellulare (Dietzel et al., 1980. Syková e Nicholson, 2008). Si ritiene generalmente che questa riduzione aumenti i processi astrogliali perisinaptici derivanti dal trasporto di acqua con K+, glutammato, bicarbonato e altre molecole (MacAulay e Zeuthen, 2010; Haj-Yasein et al., 2012). In questi ambienti, un'importante via di trasporto dell'acqua è rappresentata dai canali SLC di membrana, come EAAT1, GAT-1, MCT1, GLUT1, ecc. con 40-500 molecole di acqua che vengono trasportate insieme al substrato contro il gradiente osmotico. Alcuni di questi trasportatori possiedono anche un poro per il trasporto passivo dell'acqua (MacAulay e Zeuthen, 2010). L'AQP4 rappresenta una via di uscita dell'acqua dagli astrociti, e la cancellazione di AQP4 aumenta il restringimento dello spazio extracellulare (Haj-Yasein et al., 2012).
1.3.1.6 Omeostasi di specie reattive dell'ossigeno
Gli astrociti sono l'elemento chiave del sistema antiossidante del SNC. Il metabolismo energetico neuronale, che si basa interamente sulla fosforilazione ossidativa (Bélanger et al., 2011), genera costantemente un'elevata quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS), che devono essere eliminate per evitare danni cellulari. Il sistema antiossidante del SNC si basa principalmente sul glutatione e sull'acido ascorbico (Makar et al., 1994).
Il glutatione elimina i ROS in una reazione diretta non enzimatica oppure agisce come donatore di elettroni per la glutatione perossidasi. Gli astrociti contengono di norma più glutatione rispetto ai
neuroni (Dringen et al., 2000). La sintesi neuronale del glutatione richiede precursori obbligatori come la cisteina e la glutamilcisteina, entrambi forniti dall'astroglia. Gli astrociti accumulano cistina attraverso lo scambiatore glutammato/cistina (Bridges et al., 2012); successivamente, la cistina viene ridotta a cisteina, che viene poi convertita in glutamilcisteina (CysGlu). Gli astrociti rilasciano cisteina e glutatione, quest'ultimo convertito in CysGlu dall'enzima glutamil transpeptidasi (GT). Sia la cisteina che la CysGlu si accumulano nei neuroni per la sintesi del glutatione, mentre la cisteina viene trasportata dai trasportatori neuronali EAAT2/3 (Chen e Swanson, 2003). I neuroni, in vitro, sostengono alti livelli di glutatione se insieme ad essi si trovano anche gli astrociti. La rimozione degli astrociti dalla coltura o l'inibizione della GT impedisce la sintesi neuronale del glutatione e facilita la tossicità dei ROS (Dringen et al., 1999). In co-coltura, un singolo astrocita è in grado di proteggere fino a 20 neuroni (Desagher et al., 1996).
La capacità antiossidante astrogliale è anche mediata dall'acido ascorbico. Gli astrociti rappresentano il serbatoio per l'acido ascorbico (Makar et al., 1994; Covarrubias-Pinto et al., 2015); inoltre, sono in grado di accumulare l'acido deidroascorbico derivato dall'ossidazione da parte dei ROS e di ridurlo (utilizzando il glutatione) ad acido ascorbico (Winkler et al., 1994; Rice, 2000). L'attività neuronale stimola il rilascio astrogliale di acido ascorbico (Wilson et al., 2000). Questo rilascio può essere mediato attraverso canali anionici come VRAC (Siushansian et al., 1996) o anche attraverso gli emicanali (Corti et al., 2010), anche se quest'ultimo meccanismo non è stato ancora identificato negli astrociti.
1.3.1.7 Omeostasi dei neurotrasmettitori
L’astroglia è fondamentale per il ricambio dei neurotrasmettitori nel cervello. Gli astrociti rimuovono e inattivano, attraverso accumulo e conversione metabolica, sostanze come glutammato, GABA, adenosina e noradrenalina. Inoltre, gli astrociti producono glutammina, precursore del glutammato neuronale e di GABA, indispensabile sia per la neurotrasmissione eccitatoria che inibitoria.
1.3.1.7.1 Glutammato e GABA
Il glutammato è presente in tutti i tipi di cellule e agisce come principale neurotrasmettitore eccitatorio del SNC. Durante la trasmissione sinaptica, il glutammato, rilasciato dai terminali neuronali, può raggiungere livelli millimolari nella fessura sinaptica (Mayer, 2011). Il sistema omeostatico del glutammato è responsabile della rapida rimozione del glutammato dalla fessura
sinaptica, del controllo del rilascio di glutammato nelle sinapsi vicine e del rifornimento rapido del pool di glutammato rilasciabile nei terminali neuronali. Inoltre, questo sistema deve mantenere la concentrazione di glutammato piuttosto bassa per evitare l’eccitotossicità. Queste molteplici funzioni sono svolte principalmente dall’astroglia.
Innanzitutto, gli astrociti sono gli unici sintetizzatori de novo di glutammato a partire dal glucosio nel SNC (Hertz et al., 1999), dato che questa sintesi richiede l'intermedio alfa chetoglutarato ottenuto dal ciclo di Krebs (Schousboe et al., 2014); tale intermedio è prodotto dall'enzima piruvato carbossilasi, che si trova esclusivamente negli astrociti (Yu et al., 1982; Shank et al., 1985). Le cellule astrogliali esprimono la glutammina sintetasi, altro enzima fondamentale per il ricambio del glutammato. La glutammina sintetasi catalizza la conversione del glutammato in glutammina. La glutammina a sua volta è un precursore diretto del glutammato; i neuroni esprimono la glutaminasi, enzima che de-ammina la glutammina in glutammato. La glutammina sintetasi è anche un enzima citosolico attivo nella disintossicazione dello ione ammonio (NH4+), che viene convertito in glutammina (Cooper e Plum, 1987). In condizioni fisiologiche, l'NH4+ viene rilasciato dai neuroni attivi e accumulato dagli astrociti attraverso la diffusione per canali, così come dagli astrociti esprimenti un opportuno trasportatore (Marcaggi et al., 2004).
In secondo luogo, gli astrociti sono il principale serbatoio per il glutammato rilasciato durante la neurotrasmissione. Circa l'80% del glutammato extracellulare nel SNC è ricaptato dagli astrociti (Danbolt, 2001) utilizzando trasportatori EAAT 1/2. Il trasporto del glutammato astrogliale impedisce o permette la fuoriuscita del neurotrasmettitore dalla fessura sinaptica, contribuendo così alla trasmissione sinaptica (Marcaggi e Attwell, 2004; Tzingounis e Wadiche, 2007). Inoltre, l'eliminazione dei trasportatori astrocitari di glutammato provoca eccitotossicità e un aumento consequenziale di glutammato nell'interstizio (Rothstein et al., 1996).
In terzo luogo, gli astrociti provvedono al rifornimento di glutammato nei terminali neuronali. Il glutammato che entra negli astrociti subisce una conversione in glutammina (reazione che richiede una molecola di ATP), che viene successivamente trasportata ai neuroni attraverso trasportatori specifici. Nei terminali neuronali eccitatori, la glutammina viene convertita in glutammato; invece, nei neuroni inibitori, il glutammato viene ulteriormente convertito in GABA. Questa sequenza di eventi di ricaptazione e di natura biochimica rappresenta il sistema glutammina-glutammato e GABA indispensabile per il mantenimento della neurotrasmissione eccitatoria e inibitoria (Bröer e Brookes, 2001; Hertz, 2013). Parte del glutammato accumulato negli astrociti viene metabolizzato in alfa chetoglutarato da parte della glutammato deidrogenasi (GDH) o dalla aspartato-glutammato
transferasi (AAT) ed in seguito utilizzato per la produzione di energia; si stima che ~85% del glutammato sia convertito in glutammina e restituito ai neuroni, mentre il restante ~15% venga ossidato (Rothman et al., 2011).
Lo sviluppo post-natale del cervello è associato ad un aumento della ricaptazione del glutammato astrogliale (Diamond, 2005), a causa dell'aumento dell'espressione di EAAT1/2 (Ullensvang et al., 1997). Nella corteccia neonatale, la ricaptazione del glutammato è sostanzialmente inferiore a quello dell'ippocampo, il che probabilmente consente il rilascio di glutammato e l'attivazione dei recettori extrasinaptici. La maturazione corticale è accompagnata da un controllo più rigoroso del glutammato extracellulare (Hanson et al., 2015). Nell'ippocampo, nel tessuto neonatale, predominano l'EAAT1 e l'EAAT3 (neuronale), mentre in età adulta l'EAAT2 diventa la forma principale (Bar-Peled et al., 1997). Nei pulcini, l'inibizione del ciclo di Krebs astrogliale (quindi l'inibizione della sintesi del glutammato e l’inibizione della conversione a glutammina) sopprime il consolidamento della memoria dipendente dal glutammato; ciò si può evitare iniettando glutammina esogena (Gibbs e Hertz, 2005). Allo stesso modo, l'inibizione della glutammina sintetasi esaurisce rapidamente il contenuto di GABA sinaptico e riduce la neurotrasmissione inibitoria nell'ippocampo di topo (Ortinski et al., 2010). Gli astrociti rimuovono anche il GABA extracellulare, che viene catabolizzato attraverso il ciclo di Krebs.
Gli astrociti possono anche regolare dinamicamente la concentrazione extrasinaptica di glutammato mediante il suo rilascio attraverso l'antiporto cistina/glutammato (Moussawi et al., 2011). Un aumento del glutammato extrasinaptico potrebbe influenzare i neuroni attraverso i recettori del glutammato NMDA o metabotropi. La delezione genetica della subunità catalitica dell'Sxc ha portato ad una diminuzione del 50% del glutammato extracellulare, risultato ottenuto da misurazioni di microdialisi (Massie et al., 2011); una diminuzione simile è stata osservata anche in seguito alla somministrazione cronica di cocaina o nicotina, sostanze che riducono l'espressione di Sxc (Baker et al., 2003; Moussawi et al., 2011).
1.3.1.7.2 Adenosina
L'adenosina è presente in tutto il sistema nervoso centrale; essa regola numerose funzioni, tra cui la neuromodulazione inibitoria attraverso i recettori A1 presinaptici, la cui stimolazione sopprime il rilascio dei principali neurotrasmettitori eccitatori come glutammato, acetilcolina, dopamina e serotonina (Fredholm et al., 2005). L'adenosina, rilasciata dai neuroni, media la depressione sinaptica e rappresenta un meccanismo di feedback autonomo attraverso il quale i neuroni regolano
la trasmissione eccitatoria durante gli episodi di attività prolungata (Lovatt et al., 2012). L’adenosina, dopo essere stata accumulata negli astrociti, viene fosforilata ad AMP dall'adenosina chinasi (ADK), che rappresenta l'enzima chiave del metabolismo dell'adenosina (Boison, 2008). Le modificazioni dell’adenosina kinasi influenzano lo stato fisiologico: la sovraespressione dell'enzima ADK provoca una riduzione del livello di adenosina e favorisce le convulsioni (Li et al., 2008); l'inibizione farmacologica dell'ADK aumenta il firing neuronale (Pak et al., 1994), mentre la delezione genetica dell'ADK è incompatibile con la vita (Boison et al., 2010).
1.3.1.7.3 Monoammine
Le monoammine (norepinefrina, dopamina e serotonina) nel SNC sono catabolizzate dalle monoammine ossidasi, MAO (A o B) con processo di deaminazione e dalle catecolo-o-metiltransferrasi, COMT, con conseguente metilazione. All’inizio il cervello contiene sia MAO A che MAO B. Nello sviluppo postnatale, l'attività di MAO B aumenta di circa 15 volte, mentre quella di MAO A raddoppia (Yu e Hertz, 1982). Si è visto che gli astrociti in vitro esprimono sia MAO A che MAO B (Hertz et al., 2004), mentre gli astrociti in situ esprimono solamente MAO B; inoltre, gli astrociti sono i principali serbatoi di questo enzima nel SNC (Levitt et al., 1982; Riederer et al., 1987; Saura et al., 1992). Le MAO B sono inibite da L-deprenyl, nota anche come selegilina (Riederer et al, 1987). Il deprenyl 11C-deuterio-L è l’unico tracciante astrogliale per l'imaging del cervello tramite PET. L’enzima COMT è stato rilevato sia negli astrociti che nei processi neuronali (Hansson, 1985; Karhunen et al., 1995).
1.3.1.7.4 Produzione di lattato e turnover
È stato ipotizzato che i neuroni siano i principali consumatori di energia del cervello, utilizzandone il ~90-95% (Attwell e Laughlin, 2001), anche se probabilmente queste stime sono eccessive (Alle et al., 2009). Nel cervello a riposo, il glucosio, tuttavia, è diviso, più o meno equamente, tra neuroni e astrociti (Nehlig et al., 2004; Chuquet et al., 2010). Il metabolismo del glucosio, di conseguenza, si differenzia tra neuroni e astrociti; i primi si basano preferibilmente sul metabolismo ossidativo con elevata produzione di ATP (Boumezbeur et al., 2010), mentre i secondi, utilizzando il glucosio principalmente attraverso la glicolisi anaerobica, producendo quantità relativamente basse di ATP, ma quantità elevate di lattato (Barros et al., 2009; Bittner et al., 2010; Bélanger et al., 2011). L'ipotesi del trasportatore astrocita-neuroni per quanto riguarda il lattato, detta “ANLSH” (Pellerin e Magistretti, 1994; Pellerin e Magistretti, 2012), presuppone che il metabolismo neuronale si basi,
in particolare durante l'attività, sul lattato secreto dagli astrociti. La produzione di lattato astrocitario è legata al rilascio di glutammato sinaptico, con conseguente ricaptazione sodio-dipendente del glutammato negli astrociti. Un aumento di sodio negli astrociti attiva la NKA e aumenta la glicolisi aerobica, producendo così lattato, che verrà successivamente trasportato ai neuroni per sostenere il loro metabolismo. Gli astrociti sono dotati di trasportatori del lattato (MCT1 e MCT4) per secernere il lattato prodotto dalla glicolisi aerobica. Si è visto che gli astrociti, sia in vitro che in vivo, esprimono canali permeabili al lattato, i quali possono rilasciare rapidamente grandi quantità di lattato (Sotelo-Hitschfeld et al., 2015). Il lattato (presente nell'interstizio cerebrale in concentrazioni di ~1 - 1,5 mM) viene assunto e utilizzato dai neuroni per la produzione di ATP; inoltre, i neuroni sembrano addirittura preferire il lattato al glucosio (Qu et al., 2000; Boumezbeur et al., 2010; Bélanger et al., 2011). I mitocondri neuronali sono dotati di un complesso di ossidazione del lattato che facilita l'ingresso del lattato nel ciclo ossidativo mitocondriale (Hashimoto et al., 2008). Infine, l'attività cerebrale in vivo porta ad un rapido aumento dei livelli di lattato; quando l'attività termina, il lattato ritorna ai livelli basali (Caesar et al., 2008; Mangia et al., 2009).
Diversi studi sperimentali hanno dimostrato l'esistenza del trasportatore ANLSH (Izumi et al., 1997; Schurr et al., 1988).
Si è scoperto che gli astrociti in coltura rilasciano maggiori quantità di lattato rispetto ai neuroni in coltura e quindi possono essere la principale fonte di lattato. L'espressione dell’enzima lattato deidrogenasi 1 (LDH1), che prevale a livello neuronale, è fortemente inibita dal piruvato e l'aumento della concentrazione di piruvato, che si verifica durante l'attività neurale, direziona il piruvato stesso verso il ciclo dell'acido tricarbossilico piuttosto che verso la conversione in lattato (Chih e Robert, 2003). Questo concetto è inoltre supportato dal fatto che i neuroni coltivati rilasciano tanto lattato quanto gli astrociti quando il metabolismo ossidativo è bloccato (Walz e Mukerji, 1988). Nel cervelletto, infatti, le cellule gliali di Bergmann assorbono maggiormente il glucosio fluorescente rispetto ai neuroni di Purkinje (Barros et al., 2009). L'espressione dell'enzima esochinasi, che è direttamente correlata al metabolismo del glucosio in diverse regioni, è costantemente più alta nei neuroni rispetto agli astrociti sia nel topo che nel cervello umano (Lundgaard et al., 2015). Inoltre, un'analisi in vivo del 2-fluoro-2-deossi-D-glucosio fosforilato (FDG6P) ha evidenziato alte concentrazioni di FDG6P nei terminali nervosi, suggerendo che il principale combustibile ossidativo per i neuroni attivi non sia il lattato derivato dagli astrociti, bensì il piruvato neuronale derivato dal glucosio (Patel et al., 2014).
D'altra parte, i livelli di NADH nell’ippocampo, in studi in vitro, indicavano una chiara separazione tra l’aumento del metabolismo neuronale ossidativo e del metabolismo glicolitico astrogliale del glucosio (Kasischke et al., 2004), ma quando questi esperimenti sono stati ripetuti in vivo, non è stata osservata alcun tipo di separazione (Kasischke et al., 2011).
In sintesi, anche se ci sono prove di un'elevata attività neuronale accoppiata alla produzione di lattato, gli studi definitivi in vivo definiscono che la produzione predominante di lattato, astrocitaria o neuronale, sia ancora da dimostrare.
Allo stesso tempo, il quadro complessivo potrebbe diventare ancora più complicato, dopo che si è scoperto che fino al 60% dell'aumento di lattato nel cervello attivo deriva dal sangue (Boumezbeur et al., 2010). Si è scoperto che gli astrociti sono in grado non solo di produrre e rilasciare lattato, ma anche di assorbire e tamponare i carichi extracellulari di quest’ultimo (Gandhi et al., 2009). Così, gli astrociti possono avere un duplice ruolo nel supporto metabolico dei neuroni; possono produrre e rilasciare lattato o assumere lattato dal sangue e trasformarlo nei neuroni (Figley, 2011).
Oltre a produrre e ridistribuire lattato, gli astrociti sono gli unici detentori di glicogeno cerebrale. Nel cervello maturo, il glicogeno è presente soprattutto negli astrociti, anche se è stato trovato anche in altre cellule neuronali (Cataldo e Broadwell, 1986; Magistretti et al., 1993; Brown, 2004). I neuroni esprimono l’enzima glicogeno sintasi, che viene mantenuto inattivo dai meccanismi proteaso-dipendenti, mentre, quando viene attivato artificialmente, provoca l'apoptosi neuronale (Vilchez et al., 2007). L'attività fisiologica influenza i livelli di glicogeno negli astrociti ed è controllata da neurotrasmettitori come norepinefrina, serotonina e VIP. Il glicogeno aumenta nel sonno e nell' anestesia e diminuisce nel cervello attivo, mentre la mobilizzazione del glicogeno aiuta a sostenere l'attività neuronale (Magistretti et al., 1981; Brown et al., 2005; Bélanger et al., 2011). La glicogenolisi è anche di importanza critica per il mantenimento di LTP (Suzuki et al., 2011) e per il consolidamento della memoria (Gibbs et al., 2006).
Ci si è domandati se questi effetti fisiologici siano associati solo alla funzione del glicogeno come riserva di energia. La quantità totale di glicogeno nel cervello è molto bassa; circa 100 volte inferiore a quella del fegato (Brown, 2004). Questa quantità di glicogeno non può certo sostenere l'attività cerebrale per un tempo ragionevole e potrebbe quindi esercitare i suoi effetti fisiologici attraverso meccanismi non ancora conosciuti. Il ruolo metabolico dell'astroglia e la distribuzione del consumo di energia tra neuroni e glia sono due aspetti ancora lontani dall'essere risolti. Inoltre, la plasticità metabolica del cervello può influenzare l'equilibrio energetico neurone-glia e il turnover del lattato.
1.3.2 Regolazione della connettività sinaptica e della trasmissione sinaptica
Almeno la metà di tutte le sinapsi del SNC è coperta da guaine membranose astrogliali perisinaptiche, che rappresentano estensioni terminali dei processi astrogliali periferici (note come PAP). I processi perisinaptici esprimono specificamente le proteine ezrina e radixina (Derouiche e Frotscher, 2001; Derouiche, 2003; Lavialle et al., 2011), che si associano all'actina e possono contribuire alla plasticità morfologica dei processi astrogliali. Questa forma di rimodellamento morfologico potrebbe avere un ruolo nella plasticità sinaptica (Heller e Rusakov, 2015), anche se deve ancora essere confermata nel cervello in vivo. Il grado di copertura astrogliale differisce tra le diverse regioni cerebrali e sembra riflettere la natura della sinapsi.
Nella neocorteccia il 29-56% delle sinapsi eccitatorie sono avvolte da processi gliali; nello strato IV della corteccia somatosensoriale, ~90% delle sinapsi sono coperte da membrana gliale (Bernardinelli et al., 2014). Nell'ippocampo, il numero di sinapsi avvolte varia tra il 60 e il 90% (Ventura e Harris, 1999; Witcher et al., 2007). Nel cervelletto, appendici complesse che provengono dai processi delle cellule gliali di Bergmann coprono quasi il 90% delle sinapsi formate da fibre rampicanti e ~65% delle sinapsi formate da fibre parallele sul neurone Purkinje (Grosche et al., 1999; Xu-Friedman et al., 2001). Il grado di copertura varia anche tra i diversi tipi di sinapsi. Nell'ippocampo, gli astrociti coprono ~50% delle piccole sinapsi, mentre ~90% delle grandi sinapsi a forma di fungo e delle sinapsi perforate sono avvolte da processi astrocitari (Witcher et al., 2007). Nelle fette organotipiche, il 97% delle sinapsi complesse e il 78% delle sinapsi semplici hanno una copertura astrogliale (Lushnikova et al., 2009). Nelle sinapsi formate da fibre muschiose su neuroni granulari, la copertura delle singole sinapsi è ~15% (Mitchell e Silver, 2000; Sylantyev et al., 2013); tuttavia, gli astrociti coprono anche i glomeruli interi isolandoli (Reichenbach et al., 2010). I processi astrogliali perisinaptici che coprono le sinapsi sono estremamente sottili, anche se hanno una superficie estremamente ampia (Reichenbach et al., 2010). La membrana astrogliale perisinaptica rappresenta la maggior parte della superficie cellulare, rappresentando ~80% del plasmalemma astrogliale totale, mentre contribuisce solo al ~4-10% del volume cellulare; di conseguenza, i processi astrogliali perisinaptici hanno un rapporto superficie/volume estremamente elevato (Grosche et al., 2002). La membrana astrogliale perisinaptica è ricca di recettori, canali ionici e trasportatori; i flussi di ioni sono particolarmente importanti per la generazione di segnali locali di Ca2+ e Na+, che uniscono le cascate omeostatiche astrogliali con l'attività neuronale (Verkhratsky e Nedergaard, 2016). I processi perisinaptici sono strutture plastiche; per esempio, riescono a racchiudere rapidamente dendriti e sinapsi nei neuroni appena generati nel giro dentato e integrati nell'ippocampo adulto (Krzisch et al., 2015).
1.3.2.1 Sinapsi tripartita e culla sinaptica
Le relazioni morfologiche intime tra astroglia e sinapsi, così come l'ampia espressione dei recettori per i neurotrasmettitori negli astrociti, hanno portato ad un concetto di triade sinaptica (Kettenmann et al., 1996), che successivamente si è sviluppato nel modello sinaptico tripartito (Araque et al., 1999; Halassa et al., 2007). Il modello tripartito si è poi sviluppato in una sinapsi multipartita, composta dai seguenti componenti: 1) il terminale presinaptico; 2) il compartimento postsinaptico, rappresentato, ad esempio, dalla spina dorsale; 3) il processo perisinaptico dell'astrocita; 4) il processo della cellula microgliale vicina che periodicamente entra in contatto con la struttura sinaptica; e 5) la matrice extracellulare (ECM), che è presente nella fessura sinaptica e si estende anche in modo extrasinaptico (De Leo et al., 2006; Faissner et al., 2010; Dityatev e Rusakov, 2011; Nedergaard e Verkhratsky, 2012; Verkhratsky e Nedergaard , 2014).
Il modello di sinapsi tripartita si concentra principalmente su una rapida comunicazione bidirezionale; pertanto, la segnalazione gliale del Ca2+ indotta da neurotrasmettitori con conseguente rilascio di neurotrasmettitori dall'astroglia ("gliotrasmissione") è di fondamentale importanza. Il ruolo dell'astroglia nella regolazione della connettività sinaptica è, tuttavia, immensamente più ampio: gli astrociti controllano lo sviluppo e la formazione delle reti sinaptiche, regolano l'omeostasi ionica della fessura sinaptica, controllano la dinamica dei neurotrasmettitori, prevengono o permettono il rilascio dei neurotrasmettitori e contribuiscono allo spegnimento delle sinapsi. Questi molteplici ruoli dell'astroglia sono stati racchiusi nel concetto di “culla astrogliale” (Nedergaard e Verkhratsky, 2012; Verkhratsky e Nedergaard, 2014). Questo modello considera la copertura astrogliale come uno strumento responsabile di molteplici funzioni necessarie per la neurotrasmissione fisiologica.
1.3.2.2 Genesi, maturazione ed eliminazione delle sinapsi
Nel corso della vita, le sinapsi nascono, si rimodellano e svaniscono, il che è una parte importante della neuroplasticità, dell'apprendimento e della memoria. Le connessioni sinaptiche attraversano diverse fasi: la prima fase comprende la formazione di un contatto iniziale tra il terminale e il neurone postsinaptico, in seguito avviene la maturazione, la stabilizzazione ed il mantenimento, ed infine l’eliminazione. La sinaptogenesi embrionale procede per lo più senza glia. Nei mammiferi, nelle prime settimane postnatali si verifica la genesi delle sinapsi glutamatergiche eccitatorie; dopodiché, segue immediatamente l'astrogliogenesi (Miller e Gauthier, 2007). Il ruolo fondamentale degli astrociti nella sinaptogenesi è stato scoperto in vitro: l'aggiunta di astrociti alle
colture neuronali ha aumentato di sette volte il numero delle sinapsi (Pfrieger e Barres, 1997). Questo legame tra astroglia e sinaptogenesi è stato inoltre successivamente confermato (Eroglu e Barres, 2010).
Gli astrociti favoriscono la sinaptogenesi attraverso la secrezione di molteplici fattori, tra cui i più importanti sono il colesterolo (Mauch et al., 2001) e le trombospondine (Eroglu et al., 2009), sebbene siano coinvolte anche altre sostanze. Il colesterolo, in particolare, fornisce materiale da costruzione per nuove membrane, inoltre può anche essere localmente convertito in ormoni steroidei, che a loro volta possono agire da segnali sinaptogeni (Eroglu et al., 2009; Pfrieger, 2010). Gli astrociti sono indispensabili per la formazione di sinapsi per tutta la vita; la carenza astrogliale colpisce la sinaptogenesi nel SNC adulto e ne impedisce la rigenerazione dopo una lesione (Tsai et al., 2012). I fattori astrogliali sono altrettanto importanti per la maturazione delle sinapsi. Questi fattori includono il fattore neurotrofico attività-dipendente e il TNF alfa, i quali regolano il traffico dei recettori del glutammato nelle membrane postsinaptiche, mentre il colesterolo può migliorare il rilascio dei neurotrasmettitori dai terminali presinaptici (Eroglu e Barres, 2010). I glicani 4 e 6 derivati dall'astroglia facilitano la maturazione delle sinapsi, aumentando il numero di recettori glutamatergici AMPA nei siti postsinaptici (Allen et al., 2012).
La copertura sinaptica astrogliale può anche esercitare un controllo dinamico sulla densità sinaptica. Nell'ippocampo, ad esempio, in assenza di processi perisinaptici astrogliali, o in assenza della segnalazione di ezrina che influisce sulla loro motilità, le spine dendritiche scompaiono più velocemente (Nishida e Okabe, 2007). Gli astrociti possono regolare la densità sinaptica attraverso il rimodellamento dinamico della copertura delle membrane postsinaptiche. Nell'amigdala laterale, per esempio, la ritrazione dei processi astrogliali dalle sinapsi è un prerequisito per il rimodellamento sinaptico associato al consolidamento della memoria del condizionamento pavloviano (Ostroff et al., 2014). L’astroglia contribuisce all'eliminazione delle sinapsi e regola la morfologia sinaptica. Ad esempio, si è visto che gli astrociti, in vitro, marcano i terminali sinaptici con il fattore di complemento C1q. La microglia riconosce tale fattore, eliminando quindi le sinapsi così marcate con la fagocitosi selettiva (Schafer e Stevens, 2013); inoltre, gli astrociti di per sé possono eliminare le sinapsi in via di sviluppo nel cervello (Chung et al., 2013).
1.3.2.3 Rilascio astrogliale dei neurotrasmettitori
Con l'emergere del concetto di sinapsi tripartita si è creato un grande interesse per la secrezione astrogliale dei neurotrasmettitori. Numerosi studi in vitro, in situ e in vivo, hanno fornito una serie
di dati, grazie ai quali sono nati accesi dibattiti (Hamilton e Attwell, 2010; Nedergaard e Verkhratsky. 2012; Araque et al., 2014; Sahlender et al., 2014). Per vedere in che modo il rilascio di neurotrasmettitori astrogliali influisce sui neuroni, facciamo riferimento, per esempio, al rilascio astrocitario di glutammato, il quale sembra provocare:
l’inibizione delle correnti eccitatorie o inibitorie postsinaptiche evocate e spontanee (EPSC o IPSC) nell'ippocampo (Araque et al., 1998; Liu et al., 2004);
il potenziamento delle correnti postsinaptiche spontanee eccitatorie (EPSC) o inibitorie postsinaptiche (IPSC) nell'ippocampo (Kang et al., 1998; Liu et al., 2004; Jourdain et al., 2007; Santello et al., 2011; Santello et al., 2012);
il potenziamento sinaptico (Perea e Araque, 2007; Navarrete e Araque, 2010; Navarrete et al., 2012);
l’aumento dell'eccitabilità neuronale (Bezzi et al., 1998);
la generazione di correnti lente verso l'interno, o SIC, nell'ippocampo, nella corteccia, nel tronco cerebrale e nel midollo spinale: questa è probabilmente l'osservazione più frequente (Sanzgiri et al., 1999; Angulo et al., 2004; Fellin e Carmignoto, 2004; Kang et al., 2005; Xu et al., 2007; Shigetomi et al., 2008; Bardoni et al., 2010; Gómez-Gonzalo et al., 2010; Sasaki et al., 2011; Chen et al., 2012);
la modulazione del potenziamento a lungo termine o depressione a lungo termine (Han et al., 2012; Min e Nevian, 2012; Navarrete et al., 2012);
la depressione eterosinaptica (Andersson et al., 2007).
L’ ATP (e/o adenosina) di derivazione astrocitaria causa:
soppressione di EPSCs (Brockhaus e Deitmer, 2002; Pascual et al., 2005; Serrano et al., 2006; Martín et al., 2007);
potenziamento di EPSCs (Gordon et al., 2005; Gordon et al., 2009);
inibizione dei recettori NMDA attraverso la cascata di segnalazione P2XPCD95 (Lalo et al., 2016); generazione di SICs (D’Ascenzo et al., 2007);
aumento dell'eccitabilità neuronale (Lee et al., 2013); modulazione di LTP (Pascual et al., 2005; Lee et al., 2013).
Lo spettro delle risposte neuronali è comunque piuttosto ampio. Ci sono anche alcune informazioni sulla modulazione della funzione neuronale da parte del GABA (Kozlov et al., 2006; Lee et al., 2010) o del TNF alfa (Stellwagen e Malenka, 2006). Quest'ultimo è stato anche riportato indurre LTP
"gliogenico" nel midollo spinale (Kronschläger et al., 2016). Questi effetti multipli, che possono avvenire a livello presinaptico, postsinaptico o extrasinaptico, modulano meccanismi neuronali distinti che molto probabilmente differiscono tra le diverse regioni cerebrali, riflettendo la complessità della comunicazione astroglia-neurone.
Gli astrociti rilasciano neurotrasmettitori attraverso diversi meccanismi, a seconda del contesto in cui si trovano. Ci sono diversi elementi che si pongono contro il rilascio Ca2+ dipendente di neurotrasmettitori dagli astrociti. In primo luogo, l’eliminazione o il miglioramento della segnalazione di Ca2+ astrogliale non produce alcun effetto apparente sull'attività neuronale (Fiacco et al., 2007; Petravicz et al., 2008; Agulhon et al., 2010). In secondo luogo, i livelli extracellulari di glutammato non sono influenzati dagli astrociti di topo che esprimono la dnSNARE (soppressore dell’esocitosi) (Clasadonte et al., 2013). In terzo luogo, l'origine astrogliale del glutammato che induce i SIC rimane da confermare; effetti simili potrebbero essere dovuti, ad esempio, al rilascio somatodendritico da parte dei neuroni (Nedergaard e Verkhratsky, 2012). Infine, i protocolli di stimolazione utilizzati per attivare gli astrociti in situ potrebbero non riflettere la situazione fisiologica in vivo.
Nel complesso, gli astrociti probabilmente rilasciano neurotrasmettitori che agiscono in modo lento e duraturo; si rivolgono a recettori extrasinaptici a bassa affinità e modulano le sinapsi multiple, piuttosto che influenzare i singoli eventi sinaptici.
1.3.2.4 Controllo della dinamica dei neurotrasmettitori nella fessura sinaptica
Gli astrociti, attraverso i loro trasportatori specifici, regolano le concentrazioni dei neurotrasmettitori nella fessura sinaptica, modellando quindi le risposte postsinaptiche (Marcaggi e Attwell, 2004; Tzingounis e Wadiche, 2007). Ciò è particolarmente importante per la trasmissione glutammatergica: il glutammato rilasciato dal terminale presinaptico, mentre si diffonde nella membrana postsinaptica, viene tamponato rapidamente dai trasportatori di glutammato astrogliale che si trovano sulle membrane astrogliali perisinaptiche. È stato stimato (Marcaggi e Attwell, 2004) che il glutammato, quando esce dal terminale presinaptico, incontra, entro la distanza di diffusione di 0,5m, ~7.000 trasportatori di glutammato, che superano il numero di recettori AMPA (~25) disponibili per l'attivazione postsinaptica. Il tamponamento del glutammato astrogliale accorcia e riduce l'ampiezza delle correnti post-sinaptiche eccitatorie mediate dai recettori NMDA nelle sinapsi dell’ippocampo (Mennerick e Zorumski, 1994; Asztely et al., 1997; Diamond, 2001; Tsukada et al., 2005) e del cervelletto (Overstreet et al., 1999). L'inibizione della ricaptazione del glutammato ha
più che raddoppiato il tempo di decadimento delle correnti post-sinaptiche eccitatorie mediate dal recettore NMDA nelle sinapsi ippocampali CA1 (Arnth-Jensen et al., 2002).
Le correnti post-sinaptiche eccitatorie mediate dai recettori AMPA, invece, a causa della loro rapida desensibilizzazione, sono generalmente insensibili alla ricaptazione astrogliale del glutammato (Hestrin et al., 1990; Sarantis et al., 1993). La rimozione della desensibilizzazione del recettore AMPA con ciclotiazide rende le correnti post-sinaptiche eccitatorie dovute alla attivazione del recettore AMPA sensibili al buffering del glutammato (Tsukada et al., 2005). I trasportatori del glutammato limitano in modo simile l'attivazione dei recettori metabotropici neuronali del glutammato: l'inibizione farmacologica (Brasnjo e Otis, 2001; Reichelt e Knöpfel, 2002) o la delezione genetica dei trasportatori hanno portato ad un forte potenziamento delle correnti post-sinaptiche eccitatorie mediate da mGluR. La ricaptazione del glutammato astrogliale sembra essere così regolata dall'attività neuronale. I trasportatori astrogliali per il GABA hanno anche un ruolo nel controllo della concentrazione di GABA nella fessura sinaptica. Il GAT-3 astrocitario, ad esempio, sembra regolare la concentrazione di GABA extracellulare e quindi la trasmissione GABAergica nell'ippocampo (Kersanté et al., 2013). Nel talamo, gli astrociti esprimono sia GAT-1 che GAT-3 (De Biasi et al., 1998; Vitellaro-Zuccarello et al., 2003), la cui attività influisce sulla cinetica delle correnti post-sinaptiche mediate dal recettore GABAB, con GAT-1 che colpisce principalmente il picco della corrente post-sinaptica inibitoria, mentre GAT-3 impedisce la fuoriuscita dei neurotrasmettitori (Beenhakker e Huguenard, 2010).
1.3.2.5 Isolamento sinaptico
Gli astrociti, attraverso i processi perisinaptici e i trasportatori del glutammato, sono essenziali per preservare l'isolamento spaziale della trasmissione sinaptica, mantenendo così la specificità della segnalazione. Il buffering del glutammato impedisce la diffusione dei neurotrasmettitori tra sinapsi adiacenti. L'inibizione farmacologica della ricaptazione del glutammato con l'acido DL-treo-benzilossispartico (DL-TBOA) ha dimostrato prolungare significativamente le correnti post- sinaptiche eccitatorie in risposta alla stimolazione di input multipli nell’ippocampo in vitro, il che è indicativo di una fuoriuscita di glutammato (Arnth-Jensen et al., 2002). Risultati simili sono stati ottenuti nelle fibre parallele del cervelletto a livello delle sinapsi neuronali del Purkinje in topi transgenici privi di trasportatori EAAT1 (Marcaggi et al., 2003). Il grado di isolamento sinaptico è variabile a seconda delle regioni del SNC e cambia durante lo sviluppo. Di conseguenza, la diffusione del glutammato e le connessioni sinaptiche possono anche cambiare nei diversi stadi di sviluppo e
in diversi stati fisiologici. Inoltre, la plasticità morfologica dei processi astrogliali può rapidamente influenzare la comunicazione crociata da sinapsi a sinapsi.
1.3.3. Gli astrociti regolano la microcircolazione cerebrale: il concetto di unità neurovascolare.
L'attività del cervello è legata alla circolazione locale, e l'aumento del firing neuronale innesca rapidamente vasodilatazione di piccoli vasi localizzati entro ~ 200-250 micrometri dal sito di aumento dell'attività neuronale. Tale evento, noto come iperemia funzionale, è stato scoperto da Angelo Mosso (Mosso, 1880) e da Charles Roy e Charles Sherrington (Roy e Sherrington, 1890), i quali hanno postulato che "... il cervello possiede un meccanismo intrinseco con cui il suo
rifornimento vascolare può essere variato localmente in corrispondenza alle variazioni locali di attività funzionale" (Roy e Sherrington, 1890). L'attività neuronale e la circolazione locale sono
controllate da diversi meccanismi; i neuroni, per esempio, sono noti per rilasciare agenti vasoattivi come il monossido di azoto, NO, o prostaglandine, e la vascolarizzazione del cervello è riccamente innervata da proiezioni neuronali che rilasciano neurotrasmettitori vasoattivi, tra cui acetilcolina, noradrenalina, serotonina o dopamina (Attwell et al., 2010; Cauli e Hamel, 2010; Hotta, 2016). Alcune prove convincenti indicano un ruolo specifico degli astrociti nel processo neurovascolare e nella regolazione del flusso sanguigno locale. In primo luogo, si pensava che gli astrociti rilasciassero l'acido arachidonico in risposta alla stimolazione con il glutammato; successivamente, si è pensato che l’acido arachidonico fosse convertito in un potente vasodilatatore (un acido epossieicosatrienoico, o EETs) dal citocromo P-450 (Harder et al., 1998). Questa ipotesi iniziale è stata subito testata su fettine di cervello, le quali hanno rivelato ruoli astrogliali ancora più complessi: la stimolazione con glutammato degli astrociti e con stimoli coinvolgenti il Ca2+ astrogliale potrebbero evocare sia vasodilatazione che vasocostrizione. Si è visto che la vasodilatazione è dovuta alla prostaglandina E2 (PGE2) (Zonta et al., 2003), mentre la vasocostrizione all'acido 20-idrossieicosatetraenoico (20-HETE) (Mulligan e MacVicar, 2004). Nella retina, entrambi gli effetti possono essere osservati con vasodilatazione mediata da PGE2 e EETs e vasocostrizione da 20-HETE (Metea e Newman, 2006; Mishra e Newman, 2010).
L'iperemia funzionale astroglia-dipendente mediata da prostaglandine (Takano et al., 2006), così come da EETs (Liu et al., 2011) è stata successivamente rilevata in vivo nella corteccia. Gli astrociti regolano il tono vascolare a riposo in modo simile. Nella corteccia, sia in situ che in vivo, è stato dimostrato che il tono vasomotorio è controllato da ATP derivante da astroglia, rilasciato a seguito
di aumenti della [Ca2+] dovuti alla attivazione del recettore TRPV4 (Kim et al., 2015). Allo stesso modo, l'ATP rilasciato dagli astrociti determina la vasocostrizione delle arteriole nella retina (Kur e Newman, 2014). Anche la dilatazione tonica è regolata dagli astrociti, ma in modo dipendente dalla COX1 (Rosenegger et al., 2015). La dipendenza dell'accoppiamento tra astrociti e vasi dalla concentrazione dello ione Ca2+ è stata messa in discussione di recente, quando si è visto che i topi di tipo 2 InsP3R (che non sono in grado di generare segnali globali legati al Ca2+) hanno preservato l'iperemia funzionale (Takata et al., 2013; Bonder e McCarthy, 2014; Jego et al., 2014).
Un meccanismo alternativo associa la vasocostrizione al rilascio di K+ dalle estremità dell’astroglia; l'aumento di K+ extracellulare potrebbe iperpolarizzare il muscolo liscio vascolare, causando così vasodilatazione. Inizialmente si pensava che i canali Kir4.1 mediassero l’efflusso di K+ (Paulson e Newman, 1987), ma questa ipotesi è stata smentita grazie agli esperimenti su topi Kir4.1-/- che hanno comunque conservato completamente l’iperemia funzionale (Metea et al., 2007). L'ipotesi è tuttavia riemersa di recente, ed i canali calcio e potassio dipendenti sembrano essere responsabili dell’efflusso di K+ dalle estremità astrogliali che successivamente iperpolarizzano le cellule muscolari lisce (Filosa et al., 2006). L'accumulo di prove sperimentali relative all'accoppiamento neurovascolare controllato dall’astroglia rafforza il concetto di unità neurovascolare come un insieme di neuroni, interneuroni, astrociti, microglia, lamina basale, cellule muscolari lisce, periciti, cellule endoteliali e matrice extracellulare, che, con la segnalazione coordinata e reciproca, prevede il controllo locale del flusso sanguigno cerebrale (Harder et al., 2002; Muoio et al., 2014; Wei et al., 2016). L'astroglia rappresenta l'elemento centrale dell'unità neurovascolare attraverso l'integrazione di tutti gli altri componenti che risiedono nel suo dominio strutturale. Infine, l'estremità astrogliale sembra essere un elemento chiave per la comunicazione neurovascolare.
1.3.4. Astrociti e funzioni cognitive superiori.
Gli astrociti possono contribuire direttamente alle funzioni cognitive superiori del cervello? Possono avere un ruolo per quanto riguarda le emozioni, l'apprendimento, la memoria e la generazione di pensieri? La scoperta che gli astrociti possano scatenare segnali di Ca2+ nei neuroni vicini in coltura (Nedergaard, 1994; Parpura et al., 1994) ha suscitato un interesse negli studi sulla segnalazione gliale-neuronale. Le scoperte iniziali hanno suscitato la provocatoria domanda se gli astrociti possano modulare o addirittura contribuire alla trasmissione sinaptica. La risposta, in generale, è positiva, come documentato per la prima volta da più gruppi di ricerca nel 1998 (Araque et al., 1998; Kang et al., 1998; Robitaille, 1998). Una miriade di studi, utilizzando una grande varietà di tecniche,
ha da allora esteso questo concetto a quasi tutte le regioni del cervello e del midollo spinale. È ormai universalmente riconosciuto infatti che gli astrociti possano modulare sia l'eccitabilità neuronale intrinseca che la forza di trasmissione sinaptica (Araque et al., 2014; De Pitta` et al., 2016).
Molti studi ex vivo, tuttavia, soffrono di limitazioni tecniche, come l'uso di fettine preparate da animali appena nati con astrociti immaturi, o l'uso di manipolazioni non fisiologiche. Di conseguenza, nonostante il notevole sforzo sperimentale, rimane aperta la questione se gli astrociti contribuiscano direttamente alle funzioni cognitive o se permettano queste funzioni cognitive attraverso il loro supporto. Numerose osservazioni indirette ottenute in vivo indicano che l'attività astrocitaria è associata allo stato di eccitazione. Ad esempio, i segnali del Ca2+ astrocitari sono fortemente soppressi dall'anestesia negli animali (Schummers et al., 2008; Thrane et al., 2012). Al contrario, la maggior parte, se non tutti, i segnali di Ca2+ astrogliali sono mediati dalla norepinefrina nei topi da svegli (Ding et al., 2013; Paukert et al., 2014; Srinivasan et al., 2015). L’attivazione degli adrenocettori astrocitari alfa1 rappresenta il 90% della segnalazione spontanea del Ca2+ nei topi svegli e che la maggior parte, se non tutti, gli aumenti di Ca2+ evocati in risposta alla paura o al moto sono eliminati dagli antagonisti degli alfa1-adrenocettori. Tuttavia, il significato funzionale degli aumenti di Ca2+ astrocitari che si verificano contemporaneamente nella maggior parte delle regioni cerebrali in risposta all'attivazione del locus coeruleus non è stato stabilito. Probabilmente questi segnali preparano il cervello ad un'impennata del tasso metabolico e sono accoppiati alla glicogenolisi e alla risposta vascolare (Bekar e He, 2008; Gibbs et al., 2008). Tuttavia, la mancanza di topi con delezione dei recettori adrenergici astrocitari ha per ora impedito di capire l’importanza funzionale della segnalazione del Ca2+ astrocitaria evocata dal rilascio di norepinefrina dalle proiezioni del locus coeruleus. Ci sono indicazioni del fatto che il processo di apprendimento è associato ai cambiamenti astrogliali. L'esposizione ad un ambiente arricchito, per esempio, aumenta la complessità e l'estensione dei processi astrogliali e migliora la copertura sinaptica astrogliale (Jones e Greenough, 1996; Rodríguez et al., 2013). Anche l'esercizio fisico migliora i profili astrogliali (Rodríguez et al., 2013) e aumenta l'espressione dei trasportatori di glucosio (Allen e Messier, 2013). Solo studi sporadici hanno affrontato la questione del ruolo degli astrociti nelle funzioni cognitive in vivo. Uno di questi studi ha analizzato il deterioramento della memoria di lavoro indotto dai cannabinoidi o dalla marijuana. I topi con delezione astrocitaria dei recettori dei cannabinoidi CB1 non hanno mostrato deficit nella memoria in risposta ai cannabinoidi. Al contrario, i topi con eliminazione condizionata dei recettori CB1 nei neuroni glutammatergici o l’utilizzo di inibitori hanno mostrato gli attesi effetti dannosi dei cannabinoidi (Han et al., 2012).
