Costruzione di un sistema di espressione perossisomale della PHA Sintasi 1 di Pseudomonas corrugata in Nicotiana benthamiana

UNIVERSITÀ di PISA

Facoltà di Agraria

Laurea Magistrale in Biotecnologie Vegetali e Microbiche

Costruzione di un sistema di espressione

perossisomale della PHA sintasi 1 di Pseudomonas

corrugata in Nicotiana benthamiana

Relatore: Candidato:

Dr. Rodolfo Bernardi Dr. Mauro Distefano

Correlatore:

Dr. Alessandro Lombardo

II

“Per le persone che si occupano di scienza

,

nulla è più gradito dell’aumento del

numero delle scoperte, ma la loro

gioia è totale quando i risultati si

dimostrano anche di utilità pratica”.

III

INDICE

Abbreviazioni V

Riassunto VI

1 Introduzione 3

1.1 Trasformazione genetica delle piante 5

1.1.1 Agrobacterium tumefaciens 7

1.2 Applicazione biotecnologiche 12

1.2.1 Biotecnologie tradizionali e biotecnologie avanzate 13

1.3 Microbiologia industriale 15

1.4 Biopolimeri 17

1.4.1 Polisaccaridi 18

1.4.1.1 Polisaccaridi da materiale di scarto 19 1.4.2 Biopolimeri e nuovi materiali rinnovabili 21

1.5 Le plastiche 24

1.6 Poliidrossialcanoati 27

1.6.1 Significato bio-ecologico dei PHA 27

1.6.2 I PHA come parametro tassonomico delle Pseudomonadi 31 1.6.3 Caratteristiche e applicazioni dei PHA 33 1.6.4 Produzione industriale e implicazioni economiche dei PHA 34

1.6.5 Il PHB 37

1.6.6 Principali organismi produttori di PHA 39

1.7 Sintesi dei PHA 42

1.7.1 Geni ed enzimi coinvolti nella sintesi dei PHA 42

1.7.2 Le classi delle PHA sintasi 46

1.7.3 Le fasine 49

1.7.4 Strategie di identificazione dei geni pha 50 1.7.5 Vie metaboliche per la formazione dei mcl – PHA 52 1.8 Sintesi dei PHA in organismi ricombinanti 56

1.8.1 Sintesi dei PHA in E. coli 56

1.8.2 Sintesi dei PHA in lieviti 59

1.8.3 Sintesi dei PHA in cellule di insetti 60

1.9 Sintesi dei PHA in piante 61

1.9.1 Sintesi dei PHA nel citoplasma 63

1.9.2 Sintesi dei PHA nei plastidi 64

1.9.3 Sintesi dei PHA nei perossisomi 67

1.9.4 Limiti all’incremento dei PHA nelle piante 70

1.10 Pseudomonas corrugata 71

1.10.1 Analisi del locus PHA di P. corrugata 72

2 Scopo del lavoro 74

3 Materiali e metodi 77

IV

3.2 Ceppi batterici 78

3.3 Costruzione del vettore di espressione 78

3.3.1 Il sistema pGreen 78

3.3.2 Unione della sequenza target a phaC1Pco 82

3.3.2.1 Clonaggio di PHAC1PST in pNOS 83

3.3.2.2 Clonaggio di NOS/PHAC1PST in pGreenII0029

modificato 85

3.3.3 Trasformazione di E. coli e di A. tumefaciens 88

3.4 Nicotiana benthamiana 89

3.5 Procedura per trasfezione 90

3.5.1 Preparazione della coltura batterica 90

3.5.2 Infezione e co-coltivazione 91

3.5.3 Rigenerazione e selezione degli espianti 91

3.6 Analisi molecolare 92

4 Risultati e Discussioni 94

4.1 Analisi filogenetica 94

4.2 Costruzione del vettore di espressione pTNos/PHAC1PST-GFP 95 4.2.1 Amplificazione e clonaggio di PHAC1PST 95 4.2.2 Amplificazione e clonaggio della cassetta Nos/PHAC1PST 97 4.3 Selezione e rigenerazione degli espianti 102 4.3.1 Analisi molecolari mediante PCR sugli espianti rigenerati 104

5 Conclusioni 106

6 Allegati 109

V

Abbreviazioni

BAP Benzil Amino Purina

BLAST Basic Local Alignment Sequenze Tool

CDW Cellular Dry Weight

CNR Centro Nazionale Ricerche

GFP Green Fluorescent Protein

IBA Acido Indol Butirrico

mcl Medium-chain-lenght

MCS Multiple Cloning Site

MS Murashige e Skoog

nos Nopalina sintasi

OD Densità Ottica

O.N. Over Night

ORF Open Reading Frame

[P(3HO-3HV)] Poly(3-Hydroxyoctanoate-3-Hydroxyvalerate)

PCR Polymerase Chain Reaction

PDC Piruvate dehydrogenase complex

PHA Polyhydroxyalkanoate

PHB Polyhydroxybutyrate

PLA Poly Lactic Acid

P(3HB) Poly (3- Hydroxybutyrate)

P(3HA) Poly(3-Hydroxyalkanoate)

P(3HO) Poly(3-Hydroxyoctanoate)

scl Short-chain-lenght

VI

Riassunto

I cambiamenti climatici e l’esaurimento delle risorse, in particolare dei carburanti fossili, hanno dato maggiore impulso allo sviluppo di piante per la produzione sostenibile di un ampio spettro di materiali e prodotti chimici utili all’uomo. Gli sforzi sono stati focalizzati principalmente verso piante per la produzione di biocarburanti, come bioetanolo e biodiesel, ma è stata indagata anche la possibilità di ottenere un più ampio range di biomateriali come, ad esempio, biopolimeri con caratteristiche termoplastiche. Numerose sono le ricerche rivolte allo sviluppo ed alla produzione di biopolimeri che abbiano caratteristiche tali da poter essere utilizzati come sostituti biodegradabili delle attuali plastiche. Fra quelli oggetto di maggiore attenzione troviamo i poliidrossialcanoati (PHA).

I PHA sono poliesteri di idrossiacidi naturalmente sintetizzati da più di 100 generi di batteri, con funzione di riserva di fonte di carbonio e di potere riducente. I poliidrossialcanoati presentano caratteristiche simili ai materiali termoplastici, con proprietà elastomeriche paragonabili alle plastiche convenzionali, ed in più sono biodegradabili.

Negli anni recenti, verificata la potenzialità industriale di questi composti, gli studi sono stati indirizzati al miglioramento dell’efficienza del sistema biologico di biosintesi, in termini di qualità e di produttività dei PHA, mirando a ridurne i costi di produzione per renderli comparabili a quelli delle plastiche sintetizzate chimicamente. Fra le vie esplorate, la realizzazione di piante transgeniche PHA-produttrici e l’espressione eterologa in E. coli sono ritenute le più promettenti.

Diversamente dai batteri, che generalmente necessitano di costosi processi fermentativi, la produzione di PHA in piante può risultare un sistema più economico in quanto viene utilizzata la CO2 atmosferica come fonte di

carbonio e la luce solare come fonte energetica. Inoltre, un impianto per la produzione di PHA in pianta avrebbe un impatto ambientale praticamente nullo e la possibilità di ottenere sottoprodotti ad elevato valore aggiunto (oli, amidi, fibre, materiale di scarto fermentabile).

VII

In questo lavoro è stato realizzato un vettore di espressione perossisomale per la PHA sintasi 1 di Pseudomonas corrugata e la trasformazione Agrobacterium mediata di Nicotiana benthamiana. È stato scelto il perossisoma come organello target dell’espressione del gene esogeno per via delle rilevanti quantità di aceti-CoA e 3-idrossiacil-CoA presenti derivate dal ciclo della β-ossidazione degli acidi grassi. Questi composti sono precursori necessari per la sintesi dei PHA.

Il costrutto ottenuto, denominato pNos/PHAC1PST-GFP, è costituito da una cassetta di espressione in cui il gene phaC1Pco, fuso con una sequenza di

localizzazione perossisomiale (PST: Perossiomal Target Sequence), è stato clonato sotto il controllo del promotore e del terminatore NOS (nopalina sintasi). Tale cassetta è stata amplificata e trasferita nel plasmide T-0029 modificato (per una maggiore flessibilità ed una relativa facilità d’applicazione), recante il T-DNA, il gene NptII che codifica per la neomicina fosfotrasferasi conferendo resistenza alla Kanamicina ed il gene che codifica per la Green Fluorescent Protein (GFP). Il costrutto finale ottenuto è stato trasfettato nel ceppo di Agrobacterium tumefaciens EHA 105 contenete il plasmide pSoup (plasmide helper) per la successiva trasfezione in pianta (infezione di frammenti fogliari con capacità rigenerativa mediante immersione in colture liquide del batterio, co-coltivazione e successiva rigenerazione degli espianti putativamente trasformati in mezzo selettivo).

Lo screening per la verifica della trasformazione delle piante di N. benthamiana, rigenerate su Kanamicina, è stato effettuato attraverso l’estrazione del DNA e successiva amplificazione con primer specifici per phaC1Pco.