1.2.b La famiglia otd/otx nell’evoluzione
I geni otx sono stati identificati in una grande quantità di organismi diversi e vengono comunemente associati allo sviluppo delle strutture anteriori. Come abbiamo già visto, i meccanismi di sviluppo dell’encefalo di Drosophila e del topo sono sorprendentemente simili e suggeriscono una conservazione evolutiva dei geni otd/Otx che si estende dalla struttura dei prodotti genici al “pattern” di espressione e alla funzione. Una dimostrazione sperimentale diretta di questa conservazione funzionale è stata ottenuta per i geni otd/Otx nella specificazione del cervello rostrale (Leuzinger et al., 1998; Acampora et al., 1998). In questi esperimenti i geni OTX1 e OTX2 umani sono stati introdotti e espressi sotto un promotore heat-shock nei mutanti nulli otd di
Drosophila (Leuzinger et al., 1998); viceversa i geni Otx1 e Otx2 murini sono
stati sostituiti col gene otd di Drosophila (Acampora et al., 1998; Acampora et al., 2001) Inoltre Otx1 è stato sostituito anche con Otx2 (Acampora et al., 1999).
In Drosophila, i geni OTX umani sono in grado di recuperare i difetti al cervello e al cordone nervoso centrale osservati nei mutanti otd nulli. Inoltre l’espressione ubiquitaria dei geni otd/otx negli embrioni wild-type determina la comparsa di strutture neurali ectopiche, indipendentemente dal fatto che siano espressi gli OTX umani o il gene otd di Drosophila (Leuzinger et al., 1998). Similmente nel topo il gene otd di Drosophila recupera molti dei difetti del
cervello osservati nei topi Otx1-/-; si osserva infatti un recupero completo della
corticogenesi e dell’epilessia, come pure un parziale recupero di difetti dell’occhio e di altre anormalità del cervello, ma non dei difetti dell’orecchio interno (Acampora et al., 1998a). Al contrario Otx2 riesce a recuperare la quasi
totalità dei difetti dei topi Otx1-/-, ad eccezione del terzo canale semicircolare
parzialmente Otx1 nelle sue interazioni cooperative con Otx2 per il corretto “patterning” del cervello. Pertanto i difetti anatomici e molecolari del cervello
di embrioni Otx1-/- Otx2+/- sono recuperati da otd di Drosophila (in modo dose
dipendente) con un’alta efficienza per quanto riguarda le strutture telencefaliche, con un’efficienza intermedia per quelle del diencefalo posteriore, e con scarsa efficienza per il mesencefalo (Acampora et al., 1998a). Infine è interessante notare che otd è in grado anche di recuperare i difetti degli
embrioni Otx2-/-, con un’efficienza che dipende dalle regioni fiancheggianti
(Acampora et al., 2001).
I prodotti genici dei geni otd/Otx condividono un’omologia strutturale, che è confinata principalmente nell’omeodominio, suggerendo che questo dominio sia cruciale nel selezionare con una stringenza molto alta le stesse sequenze bersaglio. Questo implica che l’estesa equivalenza funzionale dei geni otd/Otx possa essere dovuta a circuiti genetici anch’essi conservati. Comunque, sebbene l’equivalenza funzionale dei geni otd/Otx nello sviluppo del cervello sia estensiva, essa non è completa. Per esempio i geni otd e Otx2 non complementano la funzione di Otx1 nell’orecchio interno (in cui è assente il terzo canale semicircolare) ma, mentre Otx2 complementa la funzione dose dipendente di Otx1 nello stabilire strutture del mesencefalo incluso il confine mesencefalo-rombencefalo, otd (evolutivamente più distante) non è in grado di farlo (Acampora et al., 1998b). Queste differenze nelle caratteristiche funzionali dei due geni possono risultare in maniera predominante da cambiamenti nelle regioni esterne all’omeodominio, che per otd di Drosophila e gli Otx del topo differiscono marcatamente (Simeone et al., 1992a).
L’equivalenza funzionale dei geni otd/Otx ha dimostrato per la prima volta che il concetto di azione genica conservata in phyla differenti si applica anche allo sviluppo embrionale del cervello.
Tuttavia studi successivi hanno sottolineato la possibilità che i geni
otd/otx svolgano anche altre funzioni. Ad esempio, in alcuni vertebrati questi
geni sono anche espressi nel mesoderma precordale, dove potrebbero avere un ruolo nei movimenti cellulari durante la gastrulazione. Questi movimenti sono infatti diversi nel mesoderma precordale rispetto alla notocorda (Wallingford e Harland, 2001; v. oltre).
La scoperta e caratterizzazione di Cnotx, un gene otx nell’idra, evidenzia come questa famiglia genica compaia precocemente nell’evoluzione dei metazoi. Cnotx è espresso ad alti livelli nelle gemme e negli aggregati, dove sembra avere un ruolo nei movimenti cellulari che sono coinvolti nella formazione dei nuovi assi embrionali che daranno origine ai polipi laterali. Successivamente il gene è espresso a bassi livelli lungo tutto il corpo colonnare dell’idra. Questo tipo di espressione potrebbe riflettere un ruolo di Cnotx nello specificare un tessuto rendendolo competente ad essere anteriore, sebbene il gene non abbia un ruolo diretto nella formazione della testa (Smith et al., 1999). In molti animali bilateri, i membri della famiglia otd/otx sono espressi nella testa o nelle strutture del cervello. Gli Cnidari però non hanno una testa o un cervello distinto e tuttavia la medusa Podocoryne carnea possiede una copia altamente conservata nella sequenza e nella struttura di un gene otx. Questo particolare otx ha una struttura globale più conservata rispetto agli otx dei deuterostomi, mentre diverge di più da quelli dei protostomi. La regione a più alta omologia è ovviamente l’omeodominio, ma sono presenti già in questo gene “ancestrale” sia il motivo WSP che la otx-tail idrofobica (Muller et al., 1999). A dispetto dell’omologia strutturale e di sequenza tuttavia, non sembra che ci sia conservazione funzionale tra il gene di Podocoryne e gli altri modelli animali. Nella medusa infatti sembra che il gene otx sia associato alla muscolatura striata ed è presente solo nella fase di medusa e non in quella di polipo. Membri della famiglia otd/otx sono stati trovati anche in C. elegans,
dove ttx-1 si è visto essere espresso nei neuroni termotattici. Questo risultato conferma la conservazione precedentemente osservata dei meccanismi di sviluppo tra il circuito termosensoriale di C. elegans e quello fotosensorio dei Vertebrati (Hobert e Ruvkun, 1998; Hobert et al., 1998), che suggerisce un collegamento evolutivo tra termosensazione e fototrasduzione (Satterlee et al., 2001).
Nella planaria Dugesia japonica sono stati identificati DjotxA e DjotxB la cui espressione sembra ristretta al ganglio cefalico (cervello). Sembra che i due geni siano il risultato di una duplicazione recente e che almeno uno di essi (DjotxA) sia coinvolto nel sistema visivo, a causa della sua localizzazione nelle cellule visive e negli assoni visivi (Umesono et al., 1999).
Nel riccio di mare Strongylocentrotus purpuratus la proteina Spotx ha la particolare caratteristica di esistere in 2 forme alternative di splicing (Li et al., 1997), caratteristica riscontrata solo recentemente anche in Otx2 di topo, che presenta 3 forme differenti dovute ad eventi di “splicing” alternativo, di cui una è espressa nelle cellule staminali embrionali indifferenziate, mentre le altre due sono presenti nella retina neurale (Courtois et al., 2003).
Costrutti Engrailed-Repressor (Eng-R) sono stati utilizzati per lo studio del ruolo di geni otx durante lo sviluppo del riccio di mare. Essi sono caratterizzati dalla fusione della proteina di interesse col forte dominio di repressione della proteina Engrailed di Drosophila. Spotx è richiesto per la formazione dell’endoderma e dell’ectoderma aborale durante l’embriogenesi del riccio di mare (Mao et al., 1996). Esperimenti con costrutti Engrailed-Repressor di Spotx hanno mostrato che questo gene potrebbe essere modulato da segnali vegetativi di tipo Wnt attraverso la via canonica di Wnt/β-catenina (Li et al., 1999).
Nell’ascidia il gene Hroth appartiene alla famiglia otd/otx ed è espresso dapprima nel mesoderma, durante la sua involuzione, e successivamente
nell’ectoderma anteriore, durante la gastrulazione; più tardivamente la sua espressione è ristretta alla vescicola sensoria e all’ectoderma anteriore. La funzione e la regolazione dell’espressione di Hroth sono state indagate tramite microiniezione e si è scoperto che la sovraespressione comporta un maggior sviluppo delle strutture anteriori e una coda ridotta, nonché la formazione ectopica di neurectoderma anteriore, unita alla soppressione di sviluppo epidermico anche in assenza di interazioni cellula-cellula. Poiché l’espressione ectodermica di Hroth richiede un’induzione dalle cellule dell’emisfero vegetativo, si suppone un suo ruolo sia nella specificazione delle cellule mesendodermiche, che contribuiscono alle strutture anteriori, sia nella formazione del neurectoderma anteriore (Wada e Saiga, 1999; Wada et al., 1999).
