Materiali e metodi

2.1. Trasformazione di cellule di E.coli ed amplificazione del

DNA plasmidico

2.1.1. Vettori plasmidici

Al fine di amplificare il cDNA da trascrivere per le sonde antisenso sono stati utilizzati i seguenti vettori plasmidici:

pCS105: questo plasmide contiene un sito di multiclonaggio fiancheggiato dai

promotori delle RNA polimerasi SP6 e T7; inoltre contiene un gene di resistenza all’ampicillina (Fig. 11).

pBluescript II SK (-): questo plasmide contiene un sito di multi clonaggio

fiancheggiato multiclonaggio fiancheggiato dai promotori delle RNA polimerasi T3 e T7; inoltre contiene un gene di resistenza all’ampicillina (Fig. 12).

2.1.2. Cloni

Nome ID GeneBank ID Clone

XL094 _{BC081114 XL094g09} NIBB XL201 BC073529 NIBB XL201e21 XL211 AB019557 NIBB XL211j10 XL325 CA974700 NIBB XL325d11ex XL327 BC046683 NIBB XL327j19ex XL443 BC041729 NIBB XL443d01ex XL446 BQ735282 NIBB XL446m23ex XL448 U18775 NIBB XL448f09ex

Le ESTs sono arrivate da altri laboratori sotto forma di DNA plasmidico adsorbito su carta 3MM. I plasmidi sono stati amplificati per averne una quantità sufficiente tramite la tecnica della trasformazione di cellule batteriche competenti e successivamente linearizzati e trascritti.

Le ESTs da XL094 a XL211 sono clonate in pBluescript II SK(-) nei siti EcoR1 e Xho1 rispettivamente alle estremità 5’ e 3’ del cDNA. Le ESTs da XL325 a XL448 sono clonate in pCS105 nei siti Sal1 e Not1 rispettivamente alle estremità 5’ e 3’ del cDNA.

Per effettuare le trascrizioni in vitro delle sonde antisenso, i cloni sono stati digeriti come segue:

XL094: linearizzato con EcoR1, trascritto con T7 RNA polimerasi. XL201: linearizzato con EcoR1, trascritto con T7 RNA polimerasi. XL211: linearizzato con EcoR1, trascritto con T7 RNA polimerasi. XL325: linearizzato con BamH1, trascritto con T3 RNA polimerasi. XL327: linearizzato con BamH1, trascritto con T3 RNA polimerasi. XL443: linearizzato con BamH1, trascritto con T3 RNA polimerasi. XL446: linearizzato con BamH1, trascritto con T3 RNA polimerasi. XL448: linearizzato con BamH1, trascritto con T3 RNA polimerasi.

.pBluescript KS (ephrinB-1):

Il plasmide è stato linearizzato con HindIII e trascritto con T3 RNA polimerasi

. pLT.31-Lin28. (Moss e Tang, 2003)

Vettore composto dal cDNA di Xlin-28A (numero di accesso: AF521098) clonato in pBluescript. Per la sintesi in vitro delle sonde antisenso per ibridazione in situ, il vettore è stato linearizzato con l'enzima di restrizione SmaI e la trascrizione è stata condotta con l'RNA polimerasi batterica T3.

. pNPG152 (Nrp-1). (Richter et al., 1990)

Vettore composto dal cDNA di Nrp-1 (numero di accesso: M34894-5) clonato in pBluescript. Per la sintesi in vitro delle sonde antisenso per ibridazione in situ, il vettore è stato linearizzato con l'enzima di restrizione NotI e la trascrizione è stata condotta con l'RNA polimerasi batterica T3.

• pBluescript (-/+)-Xotx5b

Plasmide contenente un frammento di 1600bp del gene Xotx5b clonato nei siti Not1/EcoRІ. Per la trascrizione dell’RNA antisenso è necessario prima linearizzare con NotІ e poi trascrivere con T7.

2.1.3. Preparazione di cellule competenti.

Mediante il seguente protocollo le cellule di E. coli (ceppo DH5α) sono state rese competenti per la successiva trasformazione con vettori plasmidici.

· Prelevare una colonia cresciuta ON su terreno solido e inocularla in 50ml di terreno liquido.

· Far procedere la crescita a 37°C in agitazione fino a che la densità ottica(OD) misurata a 600 nm raggiunge il valore di 0,2.

· Interrompere la crescita mantenendo 3’ in ghiaccio. · Centrifugare in tubo sterile per 10’ a 5000 rpm a 4°C.

· Eliminare il sopranatante e risospendere in . del volume iniziale (circa 25ml) di RbCl 50 mM freddo.

· Mantenere 30’ in ghiaccio.

· Centrifugare in tubo sterile per 10’ a 5000 rpm a 4°C.

· Eliminare il sopranatante e risospendere in 1/50 del volume iniziale (circa0,8 ml) di RbCl 50 mM freddo.

· Conservare in aliquote a –80°C fino al momento dell’uso.

2.1.4. Trasformazione.

Per la trasformazione è sufficiente aggiungere, ad una aliquota di 200µl di cellule competenti, da 5 a 20ng di plasmide superavvolto ed incubare in ghiaccio per circa 30 minuti. Successivamente si esegue un “heat shock” a 42°C per 45 secondi e a seguire una ulteriore incubazione in ghiaccio per 2 minuti. A questo punto si aggiunge 1ml di LB preriscaldato a 37°C, si incuba per 1 ora ed infine si piastrano le cellule su terreno solido selettivo (LB-agar contenente ampicillina 100µg/ml). Dopo incubazione a 37°C per tutta la notte, sulla piastra Petri compaiono le colonie: l’antibiotico fa si che crescano solo

le cellule che hanno assunto il plasmide contenente il gene d’interesse e il gene che conferisce resistenza all’antibiotico.

Ogni volta che si effettua la trasformazione bisogna aver cura di verificare l’efficacia dell’antibiotico, piastrando parallelamente 200µl di cellule batteriche in assenza di DNA plasmidico .

Terreni di coltura

Luria-Bertani Broth (LB) NaCl 1℅

bacto tryptone 1℅ bacto yeast extract 1℅

Bottom agar: agar sciolto in LB 1,5%

Antibiotico utilizzato per rendere selettivo il terreno

2.1.5. Estrazione di DNA plasmidico su piccola scala mediante lisi alcalina (“miniprep”)

Questo metodo permette di ottenere circa 2µg di DNA plasmidico. Da una piastra di cellule batteriche, recanti il plasmide d’interesse, o da uno “stock” di batteri in glicerolo, viene effettuato, in condizioni sterili, l’inoculo di una singola colonia in 3ml di brodo LB con ampicillina (100µg/ml), all’interno di un tubo batteriologico da 15 ml.

Il tubo viene incubato per circa 12-16 ore a 37°C in agitazione, affinché la coltura batterica raggiunga la fase di crescita stazionaria. La coltura viene

quindi centrifugata a 12000rpm per 1-3 minuti, ottenendo così un “pellet” di cellule batteriche che viene poi risospeso in 400µl di soluzione di risospensione, o soluzione S1. Successivamente a questa si aggiungono 400µl di soluzione di lisi, o soluzione S2, e si inverte delicatamente.

La lisi non deve durare più di 5 minuti, trascorso questo tempo si aggiungono 400µl di soluzione neutralizzante, o soluzione S3, necessaria per far precipitare le membrane e le pareti delle cellule lisate, insieme al DNA cromosomico ed all’RNA ad alto peso molecolare ad esse associati.

Dopo una centrifugazione di 15 minuti a 12000rpm si recupera il sovranatante contenente il DNA plasmidico, l’RNA a basso peso molecolare e le proteine batteriche. Si aggiungono poi 0.7volumi (V) di isopropanolo, si inverte più volte per mescolare e si lascia riposare per 10 minuti a temperatura ambiente In questo modo il DNA plasmidico e l’RNA a basso peso molecolare precipitano e vengono recuperati mediante centrifugazione (10 minuti a 12000rpm). Il pellet ottenuto viene lavato in etanolo (EtOH) al 70℅ e risospeso in 20µl di TE (o H

2O ultrapura), contenente RNAsiA ad una concentrazione di 100µg/ml, allo scopo di eliminare l’RNA a basso peso molecolare.

La concentrazione del DNA estratto e purificato viene stimata sottoponendo un’aliquota ad elettroforesi su gel di agarosio, con Bromuro di etidio (EtBr), insieme ad aliquote di preparazioni a concentrazione nota utilizzate come “standard”.

Soluzioni:

Lisozima 10mg/ml Soluzione 2 NaOH 0.2 M SDS 1℅ Soluzione 3 CHCOOH 5 M KCl 3 M TE Tris 10mM pH 8.0 EDTA 1 mM pH 8.0

2.1.6. Estrazione di DNA plasmidico su media scala (“midiprep”) mediante colonne NUCLEOBOND

Questa tecnica prevede l’utilizzo di colonne cromatografiche

NUCLEOBOND a scambio ionico disponibili in commercio insieme alle soluzioni necessarie per il loro impiego.

Con questa tecnica è possibile estrarre da 80 a 140µg di DNA altamente purificato.

Si parte da una coltura batterica di 50-100ml, ottenuta dopo incubazione a 37°C in agitazione O/N, se il brodo di crescita è torbido, si procede alla centrifugazione della stessa a 3000 rpm per 10 minuti. Si ottiene così un “pellet” che viene risospeso in 4ml di soluzione S1; si aggiungono poi 4ml di soluzione S2, si capovolge delicatamente e si lascia a temperatura ambiente per 5 minuti. Si aggiungono quindi 4ml di soluzione S3 a 4°C, si capovolge

delicatamente e si incuba in ghiaccio per 15 minuti; segue una centrifugazione a 4°C, per 30 minuti a 12000rpm. Il sovranatante viene recuperato e filtrato in modo da ottenere un lisato limpido. A questo punto si procede alla estrazione del DNA plasmidico vera e propria. Per prima cosa si equilibra una colonna cromatografia AX-100, caricandola con 3ml di soluzione N2 e permettendone lo svuotamento per gravità; quindi questa stessa colonnina si carica con il lisato. In questo passaggio il DNA si lega alla resina. Si eseguono poi due lavaggi consecutivi, ciascuno con 4ml di soluzione N3, per purificare il DNA dai sali e dall’ RNA residuo. L’eluizione del DNA viene effettuata tramite un lavaggio con 2ml di soluzione N5. L’eluato viene precipitato con aggiunta di 0.7V di isopropanolo, mediante centrifugazione a 4°C per 30 minuti a 12000 rpm. Il “pellet” viene lavato con EtOH al 70℅ e risospeso in TE pH 8.0 (o in H

2O mq). Per stimare la quantità di DNA estratto si può ricorrere all’elettroforesi su gel di agarosio oppure se si desidera una misurazione più precisa, si può ricorrere a tecniche spettrofotometriche. Con lo spettrofotometro si può ottenere la stima della concentrazione (ricavata dall’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260nm) di campioni diluiti della preparazione di DNA in esame, e della purezza del DNA estratto (ricavata dal rapporto OD 260/OD280)

Soluzioni:

S2 NaOH 200 mM SDS 1℅ S3 KCH 3COOH 2.80 mM pH 5.1 N2 Tris 100mM EtOH 15℅ KCl+H 3PO4 900mM pH 6.3 N3 Tris 100mM EtOH 15℅ KCl+ H 3PO4 1150mM pH 6.3 N5 Tris 100mM EtOH 15% KCl+H 3PO41000mM pH8.5

2.2. Elettroforesi su gel di agarosio

Al fine di verificare la purezza del DNA estratto, la purezza dei trascritti, il grado di completezza raggiunto dalla digestione del DNA, nonché di stimare

la concentrazione del DNA nelle preparazioni e la lunghezza in paia di basi degli acidi nucleici, si ricorre all’elettroforesi su gel d’agarosio. I gel vengono preparati sciogliendo l’agarosio (0.8-1.5% peso/volume) in TBE e portandolo ad ebollizione. La soluzione viene fatta raffreddare e prima che polimerizzi, si aggiunge EtBr ad una concentrazione finale di 10µg/ml. A questo punto il gel viene colato in un vassoio da elettroforesi di un apparato orizzontale, in cui è stato precedentemente posizionato un apposito pettine per la formazione dei pozzetti. Una volta polimerizzato, il gel viene posto nella vaschetta dell’apparato ed immerso nel tampone di corsa, TBE a pH 8. Nel frattempo, si preparano i campioni, diluendoli in acqua e “loading buffer”. La funzione del “loading buffer” è di appesantire il campione, facendolo andare sul fondo del pozzetto, e consentire, allo stesso tempo, di seguire la corsa elettroforetica grazie alla presenza di due coloranti a diverso peso molecolare, che corrono a velocità diverse. Dopo aver caricato i campioni su gel, si applica una differenza di potenziale di 50/120 V per un tempo variabile dai 5 ai 60 minuti. Al termine della corsa elettroforetica, il gel viene posto sotto i raggi U.V. per visualizzare le bande corrispondenti al DNA; il bromuro di etidio, che si è intercalato alle basi, appare, in queste condizioni, luminescente. Le dimensioni dei frammenti sono stimate in presenza di marcatori con peso molecolare noto.

Soluzioni

blu di bromofenolo 0.05% xilene cianolo 0.05%

Gel di agarosio

Agarosio 0.8-1.5% (peso/volume) Bromuro di etidio 10 µg/ml finale TBE 1x

“Marker” di lunghezza: Invitrogen 1 kb DNA ladder

2.3. Stima della concentrazione di DNA e RNA in soluzione

La stima della concentrazione dei campioni di DNA e RNA è stata effettuata mediante due metodi:

Elettroforesi su gel d’agarosio all’1%. Comparando la fluorescenza agli UV

della banda di interesse con quella di marker di quantità si può stimare approssimativamente la concentrazione del campione iniziale.

Spettrofotometria UV. Questa tecnica permette di stimare precisamente la

concentrazione del campione misurandone l’assorbanza alla lunghezza d’onda di 260 nm e la purezza in base al rapporto OD260/OD280 (se è maggiore o uguale a 1,8 il campione è ritenuto privo di contaminazione proteica). Lo spettrometro utilizzato è un GeneQuant pro (biochrom).

2.4. Digestione di DNA con enzimi di restrizione e purificazione

di DNA

2.4.1. Digestione di DNA con enzimi di restrizione

Per ottenere DNA stampo lineari, necessari per trascrivere, si utilizzano enzimi di restrizione che tagliano nel vettore, ma non nell’inserto, alla fine della regione che si vuole trascrivere. In Preferenzialmente si utilizzano enzimi che lasciano estremità 5’ protrudente oppure “blunt”; evitando così che l’RNA venga trascritto a partire dal filamento complementare a quello desiderato cosa che invece può accadere utilizzando come stampo un DNA con estremità 3’ sporgente. In genere le restrizioni vengono effettuate in un volume finale di 20µl. La miscela di reazione è costituita dal DNA plasmidico, dall’enzima di restrizione, presente in concentrazione di 1-2 Unità Enzimatiche (UE) per µg di plasmide e dal tampone specifico per il tipo di enzima utilizzato. Il volume di enzima aggiunto non deve superare 1/10 del volume della miscela di reazione, poiché una eccessiva concentrazione di glicerolo, in cui gli enzimi sono conservati, può interferire con la cinetica di reazione. La reazione di digestione viene fatta procedere per almeno 2 ore, oppure “over-night” (O/N), in base alla quantità di DNA che deve essere digerito. Al fine di verificare se la digestione è avvenuta in maniera completa, si sottopone su gel di agarosio all’1%, colorato con bromuro di etidio, 1/20 della miscela di reazione, accanto ad un’aliquota di plasmide non digerito. Se la digestione è completa nella corsia del digerito avremo una banda unica (che in teoria dovrebbe migrare più lentamente rispetto al DNA non digerito) piuttosto che due o più bande corrispondenti a diverse forme di superavvolgimento del DNA circolare.

2.4.2. Purificazione del DNA

Per purificare campioni di DNA in seguito a digestioni con enzimi di restrizione, è stato utilizzato il kit Gen Elute™PCR Clean-Up (Sigma), seguendo le indicazioni fornite dal produttore. La risospensione finale è stata effettuata in 30µl anziché nei 50 µl indicati dal produttore.

2.5. Preparazione della sonda per gli esperimenti di “Whole

Mount”

Le sonde utilizzate nell’ibridazione in situ ”whole mount” sono marcate con digossigenina (DIG). Per la sintesi della sonda si linearizza il plasmide tagliandolo con enzimi di restrizione in corrispondenza dell’ estremità 5’. Dopo purificazione, il DNA linearizzato viene utilizzato come stampo in una reazione di trascrizione in vitro con la RNA polimerasi che riconosce il promotore posto al 3’ del frammento in modo da ottenere un probe antisenso. Gli enzimi necessari per preparare la sonda possono essere: SP6, T7, T3 RNA. La marcatura con digossigenina deriva dal fatto che la miscela di nucleotidi contiene un UTP ribonucleotide in posizione 11 con digossigenina. Alternativamente l’UTP- ribonucleotide può essere sostituito, in posizione 12, con una molecola di fluoresceina.

Anche se il segnale dato dalla marcatura con fluoresceina è assai più debole rispetto a quello dato dalla stessa sonda marcata con digossigenina.

La miscela di reazione oltre il DNA linearizzato contiene:

4 µl Tampone di reazione 5X 2 µl DTT 100mM

1 µl DNA linearizzato 1µg/µl 1 µl Rnase Inhibitor (20 UE/µl) 2 µl RNA polimerasi

2 µl miscela di nucleotidi contenente DIG-UTP 2.5 mM (o fluoresceina-UTP 2.5 mM)

x µl H

2O RF per un volume finale di 20 µl

La miscela viene incubata per 2 ore a 37°C; per eliminare il DNA si aggiungono poi 2µl di DNasi I (1 mg/ml),si incuba poi per almeno 15 minuti sempre a 37°C.

L’intera reazione viene bloccata aggiungendo EDTA 0.5 M pH 8.0 RF. Si effettua quindi una precipitazione alcolica aggiungendo 1/10 del volume di NH

4Acetato 5M sterile e 1 volume di Isopropanolo sterile, mescolando bene e mettendo il tubo a -20°C per 40 minuti.

Successivamente si centrifuga per 15 minuti a 12000 rpm a 4°C, si lava con etanolo al 70% sterile e si centrifuga di nuovo sempre a 12000 rpm e a 4°C. Quando l’EtOH è evaporato il pellet viene risospeso in 22µl di H

2O RF o in TE pH 7.5 RF e conservato a -20°C. La stima della quantità dell’ RNA ottenuto viene effettuata su gel di agarosio, utilizzando come confronto tRNA a concentrazione nota, come marcatori di quantità. I trascritti possono essere conservati in “stocks” 10X nella miscela di ibridazione.

2.6. Ibridazione in situ su embrioni interi “Whole mount”

L’ibridazione attraverso la tecnica di “whole mount” permette di studiare il “pattern” d’espressione di un gene durante lo sviluppo embrionale di Xenopus

protocollo messo a punto nel laboratorio del Dott. Igor Dawid (NIH, Bathesod, U.S.A.).

Durante l’esperimento gli embrioni si trovano in provette (“vials”) “RNase free” (RF). La vetreria per essere RF viene tenuta in stufa a 180°C per almeno 4 ore. L’acqua e tutte le altre soluzioni utilizzate nell’ibridazione vengono sterilizzate in autoclave.

Tutti i passaggi, se non diversamente indicato sono eseguiti sistemando le “vials” in orizzontale su un agitatore, aggiungendo e rimuovendo ogni volta 5 ml di soluzione

2.6.1. Raccolta di embrioni di Xenopus laevis

Gli embrioni sono ottenuti mediante la fecondazione in vitro. Si anestetizza il maschio immergendolo in una soluzione di metan-sulfonato dell’estere etilico dell’ acido aminobenzoico (MS222) 0.1% e, dopo averlo sciacquato con acqua di rubinetto, lo si opera per asportagli il testicolo che, per qualche giorno, potrà essere conservato in una soluzione contenente MMR 1X , siero di pecora (LS=”lamb serum”) e l’antibiotico Gentamicina.

La femmina di Xenopus deve essere stimolata, 4-6 giorni prima della deposizione, con 100UI di Folligon Intervet per uso veterinario e, 10-12 ore prima della deposizione, con 800/1000UI di Profasi HP 2000 Serono (gonadotropina corionica). Entrambi gli ormoni sono iniettati nel sacco perilinfatico della femmina. La deposizione delle uova è ottenuta facendo, manualmente, pressione sull’addome della femmina.

Le uova vengono raccolte in una piastra Petri, e immediatamente fecondate, passando sopra di esse, per qualche minuto, un frammento di testicolo e,

eventualmente, lasciandolo in mezzo alle uova per circa 5 minuti; poi nella Petri si versa MMR 0.1X. La raccolta delle uova può essere fatta ogni 1-2 ore. Dopo almeno 30 minuti dalla fecondazione, gli embrioni sono trattati con l’apposita soluzione degellificante di DDT per rimuovere il loro rivestimento gelatinoso e successivamente vengono abbondantemente sciacquate in MMR 0.1X e quindi lasciate in questa soluzione fino allo stadio voluto: fino a stadio di 2, 4, 8 cellule nel caso debbano essere utilizzati per le microiniezioni, oppure fino a stadi più avanzati per esperimenti di ibridazione.

Gli stadi sono classificati secondo i criteri di Nieuwkoop e Faber (Nieuwkoop et al.,1967a; Nieuwkoop et al.,1967b )

Dato che gli embrioni devono essere utilizzati in esperimenti di ibridazione “whole mount”, vengono privati della membrana vitellina tramite pinzette Dumont n°5 e poi fissati in MEMFA in “vials” di vetro da 5ml, lasciandole in oscillazione per 1 ora a temperatura ambiente. Il MEMFA sarà poi sostituito con metanolo o etanolo assoluto che consente di conservare gli embrioni per mesi, alla temperatura di -20 °C.

Soluzioni:

Soluzione per il testicolo (per 10ml) MMR 1X fino a volume

Siero di agnello inattivato al calore 10% Gentamicina 50 µg/ml 10µl MMR NaCl 0.1 M KCl 2 mM MgSO 4 1 mM

CaCl 2 2mM HEPES 5mM pH 7.8 EDTA 0.1 M Soluzione degellificante DDT 3.2 mM Tris-HCl 0.2 M pH 8.8 MEMFA MOPS 0.1 M pH 7.4 EGTA 2mM MgSO 4 1mM Formaldeide 3.7%

In genere si conservano “stocks” 10X sterili di una soluzione di sali che si diluiscono e si addizionano di formaldeide al momento dell’uso.

2.6.2. Procedura di ibridazione

Gli embrioni, che sono conservati in metanolo assoluto (100%), vengono gradatamente reidratati, effettuando lavaggi di 5 min ciascuno, in una serie graduale di alcoli a concentrazione decrescente:

metanolo 75%, PBTw 25% metanolo 50%, PBTw 50% metanolo 25%, PBTw 75%

Vengono poi effettuati 2 lavaggi da 5 minuti in PBTw 100%. Dopo l’ultimo lavaggio in PBTw gli embrioni vengono incubati per 5 minuti a T ambiente con una soluzione di 10µg/ml di proteinasi K in PBTw. Durante questi 5 minuti le “vials” sono tenute in verticale, immobili.

Questo passaggio è molto delicato e la sua durata deve essere controllata con precisione in quanto una permanenza troppo lunga in questa soluzione potrebbe danneggiare gli embrioni. Si lava 2 volte per 1 minuto con PBTw, sull’agitatore in posizione verticale, sempre a T ambiente. In agitazione verticale, gli embrioni vengono fissati in 4% paraformaldeide (4ml di PBS +1ml di 20% paraformaldeide) a T ambiente per circa 20 minuti.

Da notare che nel caso in cui si effettui una ibridazione in situ “whole-mount” su cervelli di Xenopus è necessario eliminare il trattamento con la proteinasi K, e quindi il successivo passaggio con la paraformaldeide al 4%, in quanto il tessuto dei cervelli è già sufficientemente permeabile ed estremamente delicato.

Gli embrioni vengono poi lavati brevemente 2 volte con PBTw, seguono 4 lavaggi di 5 minuti ciascuno (le “vials” sono nuovamente collocate sull’agitatore in posizione orizzontale). Si rimuovono quindi il PBTw da ogni provetta e lo si sostituisce con una soluzione costituita al 50% da miscela di ibridazione e al 50% da PBS, disponendo le “vials” sull’agitatore verticalmente per 3 minuti: questo passaggio è necessario per equilibrare gli embrioni alla nuova densità della miscela di ibridazione. Si ripete il passaggio utilizzando una soluzione composta al 100% da miscela di ibridazione, trascorsi i 3 minuti, si sostituisce con della nuova miscela di ibridazione, e si trattano gli embrioni per 2-3 ore a 60°C (questo passaggio prende il nome di pre-ibridazione).

Segue la fase di ibridazione in cui il tampone di pre-ibridazione viene sostituito con 0.6ml di nuova miscela di ibridazione a cui si è aggiunta la sonda marcata con digossigenina o fluoresceina; utilizzando una quantità variabile di RNA “probe” (50-350ng), si porta, eventualmente a 10µl con H

2O mQ e si denatura per 2 minuti a 95°C.

Si aggiunge infine 0.6ml di miscela di ibridazione. L’ibridazione dura 12-16 ore a 60°C. Una volta rimosso, il tampone di ibridazione contenente la sonda può essere conservato e riutilizzato fino a due/tre volte.

A questo punto è necessario lavare l’eccesso di sonda non ibridata o ibridata in maniera aspecifica; a tale scopo si effettuano lavaggi a forza ionica decrescente, per aumentarne la stringenza, tenendo però presente che è importante aggiungere le soluzioni preriscaldate alla temperatura del lavaggio corrispondente.

Si sostituisce la miscela di ibridazione contenente la sonda con 1ml di soluzione composta al 50% da miscela di ibridazione e per l’altro 50% da 2XSSC/0.1X CHAPS preriscaldato a 37°C, per 10 minuti a temperatura ambiente in agitazione verticale; seguono due lavaggi da 30 minuti a 37°C con 2X SSC/0,1X CHAPS.

Dopodiché vengono effettuati altri due lavaggi sempre da 30 minuti ciascuno a 60°C con 0.2X SSC/0.1X CHAPS, preriscaldato. Prima di iniziare la procedura di incubazione con anticorpo, si lava 5 minuti a T ambiente, in agitazione verticale, con TBSX.

Segue una preincubazione di 2 ore a 4°C in agitazione orizzontale, in “blocking buffer”. Si incuba poi per 4 ore a T ambiente o a 4°C O/N con anticorpo anti-dig diluito in “blocking buffer” preincubato, precedentemente, anch’esso 2 ore a 4 °C. Il “blocking buffer” è una soluzione di TBSX +

reagente bloccante 2% + siero di pecora 15%+ estratto di uova 5%; (l’utilizzo dell’ estratto di uova riduce il segnale aspecifico).

Per rimuovere l’eccesso di anticorpo si procede con 5 lavaggi a temperatura ambiente di 1 ora ciascuno, di cui uno da effettuarsi a 4°C O/N con TBSX. Seguono quindi 2 lavaggi di 5 minuti a temperatura ambiente con il tampone per la fosfatasi alcalina (“AP buffer”) a cui si aggiunge levamisol (inibitore delle fosfatasi endogene).

A questo punto si aggiunge la soluzione di rivelazione più opportuna, in questo lavoro di tesi il substrato della fosfatasi alcalina utilizzato è il “BM-purple” che si trova in forma liquida pronta per l’utilizzo e porta ad una colorazione blu intenso.

La fosfatasi alcalina coniugata con l’anticorpo scinde il substrato cromogenico (“BM purple”) generando il prodotto colorato che rende possibile evidenziare la zone in cui la sonda si è ibridata e dove il gene in esame si è espresso. Si usano 0.5-1ml per “vial” a T ambiente fino a quando la colorazione non è soddisfacente (da 1 ora a 7 giorni). La reazione deve avvenire al buio così i tubi devono essere coperti da un foglio di alluminio. Una volta che la reazione cromogenica è terminata si rimuove il tampone per la fosfatasi alcalina e si fissano gli embrioni per almeno 1 ora con MEMFA (oppure o/n a 4°C) per stabilizzare la colorazione. Gli embrioni così fissati possono essere conservati in metanolo a -20°C.

Soluzioni:

KH 2PO4 2 g TBS (per 1 litro) NaCl 80 g KCl 2 g Tris base 30 g PBTw PBS 1X Tween-20 0.1% TBSX TBS 1X Triton X-100 0.1% Soluzione di paraformaldeide

Si può preparare uno “stock” di paraformaldeide al 20% da conservare in frigorifero a 4°C per diversi mesi. Si scioglie la paraformaldeide in acqua RF ad una temperatura di 60°C e si chiarifica aggiungendo 10µl di NaOH 10N in 100ml di paraformaldeide. Quando la soluzione è diventata limpida si lascia raffreddare, si porta a volume con acqua distillata e si filtra con carta 3 MM. Al momento dell’uso si diluisce la paraformaldeide così preparata con PBS 1X. Tampone di ibridazione: Formammide 50% SSC5X RNA di Torula 1mg/ml Eparina 100µg/ml

Denhart’s 1X Tween-20 0.1% CHAPS 0.1%EDTA10mM AP buffer Tris 100 mM ph 9.5 MgCl2 50 mM NaCl 100 mM Tween 20 0.1% Levamisol 2mM 2.6.3. Depigmentazione (“bleaching”)

La depigmentazione è una tecnica che si utilizza per distinguere meglio la marcatura, e che consiste nel depigmentare gli embrioni con perdita minima di segnale. A questo scopo è necessario lavare gli embrioni per minuti con EtOH 100% segue un lavaggio di 5 minuti con EtOH 70% e infine si lava con una soluzione composta al 50% da EtOH 100% e 50% con SSC 1X.

Si passano quindi gli embrioni nella soluzione depigmentante, contenente SSC 0.5X, H

2O21%, Formammide 5%, lasciando i tubi sull’agitatore e sotto una lampada fluorescente per circa 1-2 ore. Dopo questo tempo gli embrioni dovrebbero essere sufficientemente depigmentati. A questo punto gli embrioni vengono lavati per 5 minuti con EtOH 70% e poi trasferiti in EtOH assoluto a -20°C.

2.7. Microiniezione di embrioni di Xenopus laevis

Per gli esperimenti di microiniezione sono stati utilizzati embrioni pigmentati, in cui è possibile distinguere, allo stadio di 4-8 cellule, il polo animale da quello vegetativo e i blastomeri dorsali da quelli ventrali. Al momento della microiniezione, gli embrioni degellificati, vengono trasferiti in una piccola piastra Petri, sul fondo della quale è fissata una reticella di plastica, con maglie di circa 1mm, al fine di limitarne gli spostamenti durante la microiniezione.

Gli embrioni sono immersi in una soluzione di Ficoll al 4% (peso/volume ) sciolto in 0.1X MMR. Il Ficoll è piuttosto viscoso e permette agli embrioni di mantenere la forma sferica durante la fase di iniezione, limitando, inoltre, la perdita di citoplasma dal sito dell’ iniezione.

Gli embrioni microiniettati sono lasciati sviluppare in 0.1X MMR-4% Ficoll nelle prime ore dopo l’iniezione e poi trasferiti in 0.1X MMR.

Quando gli embrioni di controllo raggiungono lo stadio desiderato, si fissano controlli ed iniettati e si conservano in MtOH oppure in EtOH assoluto a – 20°C.

Le microiniezioni sono state eseguite con un microiniettore “Drummond Nanoject”, che consente l’iniezione di volumi tra 4.6nl e 73.6nl ad incrementi discreti. L’iniettore è dotato di un micromanipolatore che ne permette lo spostamento macrometrico nelle tre dimensioni e di un movimento micrometrico controllato idraulicamente lungo una direzione predefinita. Gli aghi tirati sono preparati per tiratura da capillari forniti da “Drummond”. Prima di essere montato sul microiniettore, l’ago deve essere riempito di olio minerale. Il caricamento dell’RNA da microiniettare è eseguito dal

microiniettore stesso. In generale, vengono caricati nell’ ago 2.0-3µl di soluzioni

Durante gli esperimenti sono stati microiniettati 200 pg di β-galattosidasi più 50 pg di Xrx1.

2.7.1. Sintesi in vitro dei trascritti da microiniettare (Melton et al., 1985)

I trascritti da microiniettare devono contenere sequenze che ne aumentano la stabilità, sia l’efficienza di traduzione all’interno della cellula.

Per questo si inserisce il cDNA dei geni da iniettare all’interno dei plasmidi che contengono elementi stabilizzanti l’RNA. Inoltre per aumentare l’efficienza di traduzione, si aggiunge alla miscela di trascrizione una “terminal cap structure“ (“cap”) all’estremità 5’.

In questo modo si possono ottenere trascritti stabili, in grado di sopravvivere all’interno della cellula. Il “cap”, tipico di molti RNA cellulari, consiste di una 7-metil-guanosina 5’ trifosfato, che si lega mediante un ponte fosfodiesterico 5’-5’ all’RNA trascritto in vitro, rallentandone la degradazione in ambiente cellulare. Per ottenere trascritti forniti di “cap” è sufficiente far avvenire la reazione di trascrizione in presenza di una concentrazione di GTP pari a 1/10 di quella del “cap”, la cui concentrazione eguaglia quella di ATP, UTP e CTP. I templati vengono di norma preparati digerendo 5-10µg di DNA plasmidico, usando un sito di restrizione a valle del sito di poliadenilazione virale. La reazione di trascrizione viene generalmente condotta in 50µl.

Esempio:

DNA linearizzato 1-2 µg

Tampone per trascrizione 5 X 10µl DTT 0.1 M 5µl

ATP 10mM 2.5µl CTP 10mM 2.5µl UTP 10mM 2.5µl GTP10 mM 2.5µl “cap” 10mM 2.5µl RNA-polimerasi 2µl (50-100UE) Rnase-Inhibitor 1µl (20UE) H2O RF fino a 5

La reazione procede a 37°C per 2 ore, trascorse le quali, si idrolizza il DNA stampo aggiungendo 1-2µl di DNAsi I RF e, incubando, sempre a 37°C, per 15 minuti. Il trascritto viene estratto con fenolo-cloroformio a pH7.5 e precipitato in 2.5V di etanolo assoluto più 0.1V di CH

3COONa 2.5 -3M a pH5.2. La concentrazione viene stimata su gel, confrontando un’aliquota con tRNA a concentrazione nota.

2.7.2. Reazione cromogenica della β-galattosidasi

Negli esperimenti di microiniezione è stato co-iniettato mRNA di β-galattosidasi nucleare come marcatore: ciò ha permesso di valutare la bontà della microiniezione attraverso la reazione catalizzata dall’enzima, che in presenza di un substrato cromogeno produce un precipitato colorato. Come substrato cromogeno e stato utilizzato il Salmon-gal, che produce un precipitato di colore rosso, seguendo il seguente protocollo:

· Fissare gli embrioni microiniettati in MEMFA per 30-40’. · 2 x 5’ lavaggi in PBS 1x (si può lasciare a 4°C fino a 48 h). · 2 x 15’ lavaggi in “Wash solution” (o ON a 4°C).

· Lasciare 5’ in soluzione di ferri.

· Rivelare in 0,5 ml totali di soluzione di ferri contente 5 µl di stock Salmongal, incubando a 37°C. Controllare periodicamente la rivelazione. · 2 x 5’ lavaggi in “Wash solution”.

· Fissare in MEMFA per 30’45’ e trasferire in etanolo 100%. Conservare a -20°C.

Soluzioni per la reazione cromogenica della β-galattosidasi

Soluzione di ferri K3Fe(CN)6 30 mM

K4Fe(CN)6.3H2O 30 mM PBS 1x

Stock Salmon-gal

Salmon-gal (Sigma) 5% in metanolo

Wash solution (conservare a 4°C) PBS pH 7.4 1X

Sodio deossicolato 0,01% Nonidet P40 0,02%

2.8. Ibridazione in situ su sezioni

2.8.1. Sezioni al criostato

Gli embrioni devono essere fissati e crioprotetti per mantenere la morfologia cellulare originaria e infine inclusi in una resina per permettere il taglio al criostato.

· Trasferire gli embrioni in tubi da batterio.

· Fissare in paraformaldeide 4% in PBS 1x 8ml/tubo per 2 ore a RT in agitazione orizzontale.

· Sostituire con saccarosio 20% in PBS 1x e lasciare in agitazione orizzontale finché gli embrioni non affondano oppure ON a 4°C.

· Trasferire il numero desiderato di embrioni in appositi stampi di plastica e ricoprire di O.C.T™.

· Orientare gli embrioni nel senso del taglio.

· Effettuare un congelamento rapido appoggiando i blocchetti in una vaschetta contenente etanolo a -80°C per 15-20’.

· Asciugare bene il fondo e conservare a -80°C fino al momento del taglio. · Lasciare i blocchetti a -20°C per circa 30’ per ammorbidire la resina e poi tagliare al criostato sezioni dello spessore di 12 µm.

· Fare aderire le sezioni ottenute al vetrino avvicinandolo parallelamente ad esse, l’adesione avviene elettrostaticamente.

· Lasciare asciugare all’aria i vetrini per circa 1 ora a RT, conservarli a – 80°C.

2.8.2. Ibridazione in situ per sezioni al criostato

Il protocollo seguito è sostanzialmente quello descritto da Casarosa (Casarosa et al., 2003):

· Scongelare i vetrini a RT almeno 30’.

· Pre-riscaldare la soluzione di ibridazione a 65°C per fluidificarla

· Diluire la sonda a 0.1-1µg/ml (la concentrazione va valutata sperimentalmente per ogni sonda ) nella soluzione di ibridazione, denaturarla 5-10’ a 70°C poi mettere subito in ghiaccio per qualche minuto.

· Aggiungere 120µl di sonda per vetrino e mettere il coprioggetto.

Appoggiare orizzontalmente i vetrini in una camera umida contenente 2 fogli di carta “Whatman” 3MM bagnati con 50% Sali -5 0% formammide e lasciare ibridare ON a 65°C.

· Preparare la washing solution e lasciarla a 65°C ON. · Trasferire i vetrini in un portavetrini verticale.

· Fare un primo lavaggio con la washing solution di 15’ a 65°C per togliere il coprioggetto.

· Lavare 3x30’ a 65°C con la washing solution pre-riscaldata. · Lavare 2x30’ a RT con il MABT 1x.

· Mettere 1ml per vetrino di blocking solution lasciare per 1-2 ore a RT senza coprioggetto nella camera umida con carta “Whatman” 3MM imbevuta di H2O.

· Diluire l’anticorpo AP-Fab anti-Dig (Roche) 1:2500 in blocking solution. · Aggiungere 150µl di anticorpo per vetrino, mettere il copri oggetto e incubare a RT nella camera umida ON.

· Trasferire i vetrini nel portavetrini verticale e fare 5 lavaggi in MABT per 30’ a RT.

· Lavare 2x10’ con l’AP-buffer a RT.

· Diluire 18µl l’NBT/BCIP (Roche) in 1ml AP-buffer e mettere 150µl di soluzione per vetrino. Aggiungere il coprioggetto, lasciare in rivelazione a RT nella camera umida al buio (per rallentare la reazione mettere a 14°C o 4°C). Cambiare la soluzione ogni 24 ore. Alternativamente all’NBT/BCIP usare

200µl di “BM Purple” senza diluirlo. E’ stato scelto per ogni sonda il substrato che dava risultati migliori.

· Fermare la reazione quando la colorazione ha raggiunto una intensità sufficiente lavando i vetrini 5’ in PBS 1x.

· Aggiungere 1ml per vetrino di “Hoechst” staining diluito 1:1000 in PBS 1x lasciare 5’ a RT senza coprioggetto al buio per marcare i nuclei cellulari. · Lavare 5’ in PBS 1x poi montare il coprioggetto con “AcquaPoly/Mount” · Lasciare asciugare per circa 30’ a RT e poi conservare a 4°C.

Soluzioni per ibridazione in situ su sezioni

10x Sali (1L) NaCl 114g TrisHCl pH7.5 14.04g Tris base 1.34g NaH2HPO42H2O 7.8g Na2HPO4 7.1g 0.5M EDTA pH8 100ml 100x Denhardt’s

Albumina di siero bovino 2% peso/volume Ficoll 2% peso/volume Polivinilpirrolidone 2% peso/volume Soluzione di ibridazione Sali 1x Formammide 50% Solfato di destrano 50% rRNA 1mg/ml

Denhardt’s 1x MABT Acido maleico 100 mM NaCl 150 mM Tween20 0.1% Blocking solution MABT 1x Blocking reagent 2%

Siero di agnello inattivato al calore 20% pH 7.5 Washing solution SSC 1x Formammide 50% Tween-20 0,1%

2.9. Fotografie

Le fotografie degli embrioni interi sono state realizzate mediante una fotocamera digitale CoolSNAP-cf montata in asse focale ad uno stereoscopio Nikon SMZ1500 con l’ ausilio di una coppia di fibre ottiche.

Le fotografie delle sezioni sono state realizzate mediante un microscopio Nikon Eclipse E600 integrato di fotocamera. Il trattamento delle immagini è stato realizzato con l’ ausilio del software Adobe Photoshop CS3.

2.10. Strumenti di bioinformatica

Per le analisi bioinformatiche stati utilizzati gli algoritmi BLASTn e BLASTx disponibili presso l’ NCBI (National Center for Biotechnology Information) all’ indirizzo web http://blast.ncbi.nih.gov/Blast.cgi. Questi algoritmi hanno permesso il confronto delle sequenze immesse con tutte quelle contenute nelle banche dati dell’ NCBI e disponibili in Rete. I risultati degli allineamenti di sequenza hanno permesso di cercare, in base all’omologia, sequenze che fossero simili ai trascritti analizzati e dessero quindi indicazioni sulla possibile identità e funzione.