MATERIALI E METODI

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Capitolo 2

MATERIALI E METODI

2.1 Fluoresceina: proprietà ed applicazioni

Gli usi della fluoresceina sia come colorante che come fluoroforo sono molteplici; in campo biologico può essere usato per il labelling in microscopia di fluorescenza, in medicina per evidenziare lesioni della cornea, come tracciante di fluidi per il monitoraggio di fiumi sotterranei oppure per esperimenti di microfluidica [54].

Nelle procedure sperimentali descritte in questa tesi, è stato utilizzato l’isotiocianato di fluoresceina 0,1 mM (0,04 g in 100mL), per monitorare il trasporto transepiteliale attraverso il monostrato di cellule Caco-2 e quindi la permeabilità attraverso le tight junction formatesi nel monostrato cellulare.

Il vero meccanismo di permeabilità non è però ancora stato descritto, ma è stato precedentemente esaminato il trasporto di questa sostanza attraverso il monostrato epiteliale e la dipendenza della permeabilità della fluoresceina in modo dipendente dalla sua concentrazione [55].

La fluorescenza, di tutte le letture eseguite con uno spettrofotometro (Fluostar Omega BMG Labtech, Ortenberg Germany), è stata misurata utilizzando un volume di soluzione di 100 µL ed una piastra Costar 96.

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La lunghezza d’onda di eccitazione utilizzata è 485 nm e quella di emissione è 520 nm. Per ogni esperimento è stata preparata una soluzione di fluoresceina ex novo.

La lettura è stata fatta in triplo.

2.2 Descrizione del circuito

Un bioreattore, chiamato MB (Membrane Bioreactor), è una sorta di cameretta in grado di contenere una quantità adeguata di fluido, chiamato wet volume, ricco di nutrienti per permettere una coltura cellulare al suo interno.

La camera di coltura è costituita da un holder all’interno del bioreattore suddiviso in una zona apicale ed una basolaterale rispetto alla membrana semipermeabile e porosa sulla quale le cellule saranno coltivate. La membrana ha anche la funzione di suddividere il wet volume in due comparti indipendenti, mantenuti in contatto soltanto dai pori del filtro. Ciascun modulo è provvisto di un tubo di ingresso ed uno di uscita, attraverso il quale scorre il mezzo di coltura. In tal modo le cellule coltivate sull’interfaccia fra i due comparti saranno esposte ad un flusso sia dalla parte apicale che da quella basolaterale della membrana.

Il bioreattore descritto è inoltre connesso a due sistemi di tubi che costituiscono circuiti fluidici fra loro indipendenti e paralleli.

L’unico punto di scambio tra il liquido di un circuito e quello dell’altro, come detto, è attraverso la membrana contenuta nell’holder all’interno del bioreattore.

Il sistema completo è formato da due camere di miscelazione, una piccola bottiglia con coperchio a cui sono stati collegati almeno due tubi; questa viene utilizzata come riserva di liquido, che poi la pompa preleva ed invia in tutto il circuito.

Ciascuna camera di miscelazione, in modo separato, viene collegata attraverso un tubo in silicone ad una pompa peristaltica. Essa comprime la parete del tubo, detto di alimentazione, tramite un rotore a cilindri rotanti, garantendo un processo di suzione del liquido dalla reservoire ed in definitiva un flusso con andamento sinusoidale in tutto il circuito.

Dalla pompa attraverso un altro tubo si arriva all’ingresso del bioreattore. Ulteriori tubi collegano le camere di coltura con le rispettive camere di miscelazione, una per la parte apicale del circuito e l’altra per quella basolaterale.

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In questo modo è garantita una chiusura del circuito, dove l’inizio corrisponde alla fine ed il fluido può scorrere senza interruzioni (Figura 7).

Figura 7 : Schema dei due circuiti del sistema.

I tubi in silicone che collegano il tutto hanno un diametro interno pari a 1 mm ed uno esterno di 3 mm e vengono collegati tra loro e con le varie parti del circuito mediante dei connettori in polipropilene. A livello degli ingressi e delle uscite dal bioreattore vengono posizionati alcuni rubinetti a 3 vie, in grado di consentire i prelievi che devono essere eseguiti durante gli esperimenti. L’unico tubo in tutto il sistema ad avere un diametro interno di 2 mm è quello di alimentazione, corrispondente al circuito superiore. Questo permette al fluido presente nel circuito superiore di scorrere ad una velocità pari al doppio di quello presente nel circuito inferiore e questo garantisce un maggior scambio di soluti tra la camera apicale e quella basolaterale del bioreattore. Lo scopo è quello di simulare

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l’intestino, cioè l’epitelio basale, dove i soluti devono passare il più velocemente possibile ed in quantità elevata da una parte all’altra della barriera fisiologica.

È stato ormai assodato sperimentalmente che, raddoppiando la velocità del flusso nella camera apicale rispetto a quella basolaterale, il passaggio dei soluti tra queste due zone diverse del bioreattore separate dalla membrana permeabile è aumentato.

2.3 Procedimento di assemblaggio

La membrana semipermeabile di policarbonato, avente un diametro di 25 mm e pori di 0,4 micron di diametro (G E Water & Process Technologies) viene tagliata con un bisturi e stampino in modo da avere dimensioni ottimali per l’holder, viene poi immersa in acqua (per la fuoriuscita di aria dai pori in modo da avere un interfaccia liquido-liquido) ed inserita tra le due parti dell’holder, che viene infine chiuso. L’holder viene inserito all’interno del bioreattore, questo viene poi chiuso e posizionato in modo che la camera con il tetto inclinato, che garantisce la fuoriuscita di bolle d’aria durante il riempimento con il fluido per l’esperimento, sia quella superiore.

Il bioreattore è stato collegato mediante i due tubi di ingresso, uno per il circuito superiore ed uno per quello inferiore, rispettivamente ai tubi provenienti dalla pompa, mentre le uscite dal bioreattore sono state collegate ai tubi che arrivano alla camera di miscelazione corrispondente.

In tal modo i due circuiti sono stati assemblati ed è stato ottenuto il sistema completo, già descritto nel paragrafo precedente (Figura 7 ).

Prima di procedere con la semina cellulare sulla membrana dell’holder il bioreattore, già assemblato, è stato sterilizzato al gas-plasma. Anche il circuito, prima di essere utilizzato per l’esperimento viene sterilizzato con lo stesso processo.

2.4 Coltura cellulare su membrana di Transwell

La linea cellulare Caco-2/TC7 [2] è stata mantenuta in terreno DMEM (Dulbecco's Modified Medium) (high glucose), addizionato di 1% amminoacidi non essenziali, 10% FBS (fetal bovine serum), 2 mM L-glutammina, 100 U/ml penicellina, 100 mg/ml

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streptomicina e 1 mM Hepes (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), in incubatore a 37°C con 5% CO2.

Il mezzo è stato cambiato tre volte a settimana. Raggiunto il 50% di confluenza, sono state effettuate sub colture [33]. Tutti gli esperimenti sono stati effetuati tra il passaggio 70 e 79. Per svolgere l’esperimento in statico, le cellule sono state seminate su filtri commerciali di policarbonato (inserti Transwell, 0,4 µm diametro del poro; Millipore Corporation, Billerica, MA, USA), alla densità di 16,6X103 cells/cm2 e sono state mantenute in coltura

(figura 8 A).

Raggiunta la confluenza dopo tre giorni, è stato cambiato il terreno regolarmente tre volte a settimana, per 21 giorni.

La permeabilità e l’integrità delle tight junction cellulare è stata monitorata misurando la TEER (Trans Epithelial Electric Resistance) del monostrato usando uno strumento commerciale (EVOM2 – World Precision Instruments, Sarasota, USA) impiegando elettrodi di Ag/AgCl secondo le istruzioni d’uso. La resistenza viene misurata in modo trasversale alla membrana e questa viene aumentata in base a quante più giunzioni serrate si sono formate nel tessuto epiteliale.

Il valore finale verrà espresso in Ω*cm2

.

2.5 Coltura cellulare su membrana di holder

Le cellule sono state mantenute in coltura come precedentemente descritto, ma sono state seminate su membrana di policarbonato (0,4 µm diametro del poro) posizionata all’interno dell’holder.

Sono state sperimentati due metodi di coltura all’interno dell’holder; uno prevedeva la semina ed il differenziamento delle cellule nell’holder inserito all’interno di multiwell da 6 pozzetti. Soltanto alla fine dei 21 giorni di coltura, l’holder verrà inserito con l’utilizzo di pinzette sterili nel bioreattore che a quel punto, verrà chiuso nel clamp-system (figura 8 B). L’altro metodo invece prevedeva la semina delle cellule sulla membrana inserita e posizionata all’interno del bioreattore già assemblato, sterilizzato e posizionato nel sistema di clamp (Figura 8 C). In questo caso tubi di ingresso e di uscita del bioreattore sono stati chiusi collegandoli tra loro per evitare la fuoriuscita del terreno e qualsiasi forma di inquinamento delle cellule. Tra i due connettori è stato posto un rubinetto a cui è stato

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collegato un filtro 0,22 µm che permette all’aria, necessaria per mantenere in vita le cellule, di entrare nel sistema.

In entrambi i casi, su ogni membrana sono state seminate 4*104 cellule ed il mezzo di coltura completo (DMEM) è stato cambiato tre volte a settimana.

Le cellule, in entrambe le procedure sperimentali, sono state mantenute per 21 giorni (dopo il raggiungimento del 100% di confluenza) in coltura per permettere il differenziamento.

A

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C

Figura 8 : Transwell utilizzate, immagine riprodotta [56] (A); holder con membrana in multiwell pronti per

la semina (B); riempimento bioreattore (C).

2.6 Esperimento per passaggio di fluoresceina tramite membrane di Transwell con

e senza cellule

Prima di procedere con gli esperimenti per valutare il passaggio di fluoresceina tramite l’epitelio intestinale formato dalle cellule Caco-2 che, dopo essere state seminate sulla membrana, sono state mantenute in coltura per 21 giorni, occorre valutare il passaggio della fluoresceina dalla membrana semipermeabile in assenza di cellule.

Per prima cosa è opportuno preparare la soluzione di fluoresceina alla concentrazione desiderata di 0,1 mM in terreno (DMEM).

Il terreno è stato rimosso sia dalla parte apicale che da quella basolaterale delle transwell. A questo punto sono stati aggiunti 600 µL di terreno nella zona basolaterale, mentre 400 µL di soluzione di fluoresceina nella zona apicale.

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Durante l’utilizzo della fluoresceina occorre far attenzione a lavorare in ambienti semibui in modo da evitare un eventuale decadimento della sostanza.

A questo punto ad intervalli di tempo regolari sono stati effettuati pescaggi da 100µL ciascuno, sia nella parte apicale, che in quella basolaterale, per monitorare un eventuale passaggio della sostanza attraverso la membrana. I prelievi sono stati fatti dopo 30 minuti da quando è stata aggiunta la fluoresceina (che corrisponderà al tempo zero), dopo 2, 7, 24 ore e letti immediatamente allo spettrofotometro.

Nello stesso modo è stato allestito l’esperimento in statico contenente però la barriera epiteliale formata dalle cellule Caco-2.

2.7 Esperimento per passaggio fluoresceina tramite membrana di holder con e senza cellule in bioreattore (dinamico)

Per gli esperimenti condotti senza cellule, dopo aver verificato, facendo scorrere acqua in tutti i componenti, che non ci sono tracce di sostanze che leggano in fluorescenza, si è proceduto con l’inserimento delle soluzioni necessarie all’esperimento direttamente nelle camere di miscelazione.

Dopo aver preparato una soluzione di fluoresceina 0,1 mM in terreno (DMEM), sono stati aggiunti 15 mL di questa, all’interno della camera di miscelazione corrispondente al circuito superiore. Nella reservoire collegata al circuito inferiore sono stati aggiunti 15 mL di terreno, lo stesso volume che verrà poi usato per la coltura di Caco-2.

A questo punto, dopo aver controllato la chiusura di tutti i connettori e delle varie parti del circuito, è stata accesa la pompa peristaltica ed è stato avviato il riempimento dei due circuiti. Avendo il tubicino della pompa del circuito superiore un diametro maggiore, in esso il flusso sarà il doppio; il circuito superiore si riempirà più velocemente e senza problemi anche a livello della camera superiore del bioreattore con il tetto inclinato.

Invece più lento e problematico è il riempimento della camera inferiore del bioreattore dove potrebbero formarsi bolle di aria che andrebbero a compromettere l’esperimento; al fine di evitare questo inconveniente è stato opportuno tenere il supporto del bioreattore inclinato e muoverlo per far defluire dal tubicino di uscita tutta l’aria durante tutto il riempimento del circuito.

Riempiti entrambi i circuiti, quando il fluidi tornano a gocciolare nelle camere di miscelazione da cui erano partiti, è stata impostata la pompa peristaltica ad un flusso pari a

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circa 100 µL/min. In questo modo, essendo i tubi della parte apicale e della parte basolaterale di diametri differenti, il circuito inferiore ha una velocità di flusso 100 µL/min, mentre quello superiore scorre a 200 µL/min.

La stessa procedura di riempimento dei due circuiti e di settaggio della pompa è utilizzata anche per l’esperimento dinamico con le cellule cresciute e differenziate sulla superficie apicale della membrana contenuta nell’holder.

Terminato il riempimento, grazie al supporto su è stato montato, il circuito è stato mantenuto in incubatore (37 ° C, 5% CO2) per tutta la durata dell’esperimento e messo

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A

B

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2.8 Pescaggi lungo il circuito per rilevare passaggio fluoresceina

La fluoresceina disciolta nel terreno inizialmente sarà presente solo nel circuito corrispondente alla camera superiore del bioreattore, avendo inserito la soluzione solo nella camera di miscelazione relativa.

Abbiamo monitorato il passaggio attraverso la barriera epiteliale ed attraverso la membrana semipermeabile, campionando a tempi ben definiti nei punti di maggior importanza del circuito, in corrispondenza dei rubinetti a tre vie.

I pescaggi pari a 100 µL sono stati rapidi e precisi, in modo da far intercorrere quanto meno tempo possibile fra quelli relativi all’uscita del bioreattore superiore e inferiore. Eseguendo quindi il rapporto fra la fluoresceina contenuta nei due campioni, per ogni istante temporale, come verrà meglio descritto in seguito, è possibile monitorare il passaggio della sostanza attraverso la membrana e le cellule (se presenti), i pescaggi vengono fatti dopo 30 minuti dall’inizio dell’esperimento, dopo 1 ora, dopo 2 ore, dopo 4 ore, dopo 7 ore ed infine dopo 24 ore.

Fatti i prelievi questi sono stati inseriti in una multiwell da 96 pozzetti ed è stata fatta il prima possibile la lettura allo spettrofotometro.

2.9 Lettura allo spettrofotometro e trattamento dei dati

L’analisi dei campioni prelevati è stata fatta sfruttando lo spettrofotometro (Fluostar Omega BMG Labtech, Ortenberg Germany) ad una lunghezza d’onda d’eccitazione di 485 nm e di emissione di 520 nm.

Le letture vengono confrontate con la retta di taratura, una per ciascun esperimento, ad esse viene sottratta la lettura del terreno puro (“bianco” dell’esperimento) e viene valutata la variazione di concentrazione di fluoresceina fra un campione ed il successivo in ordine temporale. Questa variazione può esser associata ad una “scomparsa” di fluoresceina dalla camera superiore a favore di quella inferiore.

La lettura che corrisponde al primo pescaggio, dopo ½ ora dall’inizio dell’esperimento, cioè nel momento in cui il fluido torna dopo aver percorso tutto il circuito, alla camera di miscelazione corrispondente, viene considerata pari al 100% quando il prelievo è stato fatto dall’uscita della camera superiore, mentre il valore che corrisponde alla lettura del pescaggio dall’uscita della camera inferiore è lo 0% dell’esperimento. Questo permette di

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ovviare a possibili impurità presenti nel circuito, che potrebbero inficiare la lettura allo spettrofotometro. Sulla base di questi valori sono state calcolate le differenze con i campioni successivi in scala temporale e rapportati con il valore di partenza, in modo da valutare le percentuali di tutte le letture svolte durante le 24 ore dell’esperimento, rispetto al valore di partenza.

2.10 Saggi ed Immunocitochimica

2.10.1 Trans Epithelial Electrical Resistance

Trans Epithelial Electrical Resistance (TEER) viene valutata con EVOM2 (World Precision Instruments, Sarasota, USA) al fine di valutare l’integrità del monostrato cellulare, Caco-2. Per gli holder, con cellule in coltura sulla loro membrana, è stata eseguita la misura una volta ogni tre giorni.

Ogni tre giorni la TEER è stata valutata anche nelle Transwell su cui sono state seminate le cellule, mentre per la coltura cellulare in bioreattore è stata misurata soltanto, “sacrificando” uno di questi, al termine dei 21 giorni necessari per il differenziamento.

2.10.2 Lattato Deidrogenasi

La vitalità cellulare è stata valutata tramite il saggio della lattato deidrogenasi (LDH). La LDH è un enzima citoplasmatico che viene rilasciato dalle cellule nel mezzo di coltura

(in-vitro) o nei fluidi biologici (in-vivo) quando la membrana cellulare è danneggiata. Questo

enzima all’interno delle cellule catalizza una reazione NADH-dipendente in cui il piruvato viene ridotto a lattato (Figura 10).

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Figura 10 : Conversione del piruvato in lattato.

Maggiore quantità di piruvato è rilasciata dalle cellule morenti, più piruvato è convertito a lattato, e meno piruvato sarà disponibile per la reazione con il 2,4-dinitrofenilidrazina e di conseguenza si formerà una minore quantità di prodotto di color bruno-rossastro che può essere quantificato fotometricamente (Figura 11).

CH₃ O O O -Pyruvate O₂N NO₂ N H NH₂ O₂N NO₂ N H N CH₃ COO

-H

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2.10.3 Immunochimica (ZO-1)

Per verificare la formazione di tight junction è stata utilizzata la proteina ZO-1 (zonula

occludens), quindi dopo aver completato l’esperimento dinamico in presenza di cellule,

abbiamo recuperato le membrana.

La membrana prelevata è stata posta in un pozzetto di una multiwell da 24 e lavata per eliminare eventuali residui di terreno.

A questo punto le cellule sono fissate utilizzando paraformaldeide 4% e per 20 minuti sono state lasciate a temperatura ambiente.

In seguito, sono stati effettuati tre lavaggi con PBS 1X (Phosphate Buffer Saline) di 2 minuti ciascuno e dopo è stato aggiunto Triton X-100 (0,1% in PBS 1X) per 2 minuti. Dopo aver fatto altri tre lavaggi con PBS 1X, le membrane sono state lasciate per 30 minuti con BSA al 5%.

Dopo tre lavaggi con PBS 1X, le cellule sono state incubate con un anticorpo anti-ZO-1, 1:500 (Invitrogen, cod. 339100) per una notte e successivamente con un anticorpo Alexa Fluor® 568, 1:1000 (Invitrogen, cod. A11011). Infine, è stato aggiunto, per 15 minuti, una soluzione 0,5 µL/500 µL di 4',6-diamidin-2-fenilindolo (DAPI) per la colorazione dei nuclei.

Infine abbiamo osservato i campioni al microscopio ottico a fluorescenza (AX70, Olympus Italia, Milano) con obiettivi 10X e 20X e con il microscopio confocale (Zeiss LSM 510 confocal microscope con il software LSM510 Package).

2.11 Semina e coltura di cellule Caco-2 su membrane elettroattive in

acrilato.

2.11.1 Sterilizzazione membrane

Le membrane sono state sterilizzate con il loro anellino, in etanolo al 70% per massimo 2 minuti.

Gli anellini utilizzati sono stati di due tipi, senza e con supporto per stabilizzare la membrana (figura 12 A e B).

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A B

Figura 12 : Membrana acrilato su anellino (A); membrana acrilato in anellino con chiusura per stabilizzare la

membrana.

La membrana (rivolta verso l’alto) è stata poi lasciata asciugare per 15 minuti sotto cappa a flusso laminare in modo da togliere eventuali residui di etanolo e successivamente 10 minuti sotto raggi UV sotto cappa a flusso laminare (sempre rivolta verso l’alto).

Insieme all’anello di supporto, è stata trasferita (delicatamente e con l’uso di pinzette sterili non appuntite) in una piastra multiwell da sei pozzetti con la membrana rivolta verso il basso.

Sopra la membrana, sono stati aggiunti 800 µL di terreno DMEM ed infine è stata lasciata in incubatore per circa 24 h.

2.11.2 Coating di gelatina o collagene

Dopo aver rimosso il terreno da sopra e sotto la membrana aspirando delicatamente, si può procedere eventualmente con il coating.

La gelatina è stata preparata sciogliendo 2 g di gelatina di pelle porcino IA in 200 mL di PBS 1X (concentrazione finale 1%) e sterilizzata in autoclave.

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Su ogni pozzetto sono stati messi 1 mL di gelatina (liquida) e si è lasciato riposare 1 h in incubatore. Al termine dell’incubazione è stato aspirato l’eccesso di gelatina e si procede alla semina delle cellule.

Il collagene è stato diluito con terreno di coltura alla concentrazione finale di 0.3 mg/mL. Su ciascuna membrana, è stato aggiunto 1 mL di collagene e si è lasciato riposare 30-40 minuti a temperatura ambiente, per poi procedere al piastramento.

2.11.3 Semina e coltura Caco-2

Su ogni membrana sono state piastrate circa 500.000 cellule.

Dopo aver staccato le cellule dalla fiasca con tripsina ed aver centrifugato e risospeso in terreno completo (DMEM) le cellule sono state contate tramite l’utilizzo della di Burker. La multiwell con le membrane, sono state mantenute in incubatore (37°- 5% CO2).

Il terreno di coltura è stato cambiato tre volte a settimana.

2.11.4 Acquisizione foto al microscopio ottico

Le foto per valutare la crescita delle cellule sulla membrana di acrilato sono state effettuate nei giorni:

GIORNO 0 GIORNO 7 GIORNO 14 GIORNO 21

2.11.5 Immunochimica (DAPI e Falloidina)

Dopo aver aspirato il terreno dalle membrane e dopo averle lavate due volte utilizzando PBS 1X, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.

Dopo due lavaggi con PBS 1X (2 minuti ciascuno), è stato aggiunto, su ogni membrana, Triton X-100 allo 0,2% per 5 minuti.

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Dopo altri 3 lavaggi con PBS 1X, sono stati aggiunti BSA 1% e 2 µL di falloidina-rodamina (diluita 1:300) su ciascuna membrana per 30 minuti a temperatura ambiente (piastra multiwell coperta con alluminio).

Dopo tre lavaggi con PBS 1X sono stati aggiunti 0,5 µL di DAPI (in 500µL di BSA 1%) per 15 minuti.

Infine sono state osservate le membrane al microscopio a contrasto di fase a fluorescenza (LEICA DM IRB); l’acquisizione ed elaborazione dei dati è stata effettuata mediante software Leica QFluoro su PC Pentium III.