Discussione
1 DISCUSSIONE
Le ormai note capacità antagonistiche di numerose specie appartenenti al genere Trichoderma rendono questi funghi potenziali antagonisti di funghi fitopatogeni e impiegabili, quali principi attivi di biofitofarmaci, in programmi di lotta biologica e integrata. Studi ecologici condotti sui potenziali agenti di lotta biologica risultano essere necessari prima di un loro utilizzo. Poiché fattori di stress ambientali, come la presenza di competitori nella microflora del terreno, fonti nutrizionali limitanti, presenza ed accumulo di fitofarmaci e metalli pesanti, temperature estreme e bassi livelli di potenziale idrico, possono inficiare il normale accrescimento e le performance degli isolati di Trichoderma spp. (Badham, 1991; Morley and Gadd, 1995; Naár and Kecskés, 1998), è fondamentale condurre studi approfonditi, volti a valutare l’influenza di questi parametri sull’accrescimento miceliare, sulla sporulazione, sulla capacità competitiva o sull’ abilità di produrre e rilasciare enzimi extracellulari ad attività litica di quegli isolati potenzialmente impiegabili come agenti di lotta biologica, prima di un loro utilizzo in pieno campo (Manczinger et al., 2002).
Il principale scopo di questo lavoro di tesi è stato quello di selezionare uno o più isolati di Trichoderma spp., a partire da un numero consistente di individui (circa 150 isolati presenti all’interno della Collezione Fungina depositata presso il Dipartimento di Coltivazione e Difesa delle Specie Legnose), in grado di agire contro un isolato patogeno di Rhizoctonia solani su ravanello. Successivamente, gli isolati risultati essere in grado di ridurre l’incidenza della malattia sono stati sottoposti ad ulteriori indagini volte a verificare gli effetti di parametri ambientali sul loro accrescimento ed indagare i meccanismi d’azione nei confronti del patogeno.
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Numerosi lavori sono stati condotti al fine di individuare isolati di Trichoderma da utilizzare per il controllo biologico di R. solani e l’argomento è da tempo oggetto di studio nel laboratorio ospite della presente tesi. Già nel 1986, Scaramuzzi et al.
selezionarono alcuni isolati fungini per la lotta al patogeno con esiti significativi su ravanello. In seguito, nel 1987, Vannacci e Pecchia valutarono la capacità di produrre antibiotici e composti volatili negli isolati selezionati, con particolare riferimento ai ceppi T. asperellum I252 e T. virens I10, attualmente in via di sviluppo come agenti di lotta biologica da impiegare insieme in un prodotto commerciale (Vannacci e Pecchia, 2000).
Più recentemente, nell’ambito di una tesi di dottorato (Sarrocco, 2004) e del lavoro di preparazione di un’altra tesi di laurea (Sarrocco et. al, 2006), i due isolati sono stati sottoposti ad indagini fisiologiche al fine di valutare l’effetto di parametri ambientali sull’azione antagonista e sull’accrescimento e studiare alcuni meccanismi d’azione (competizione per il substrato, micoparassitismo, produzione e rilascio di enzimi ad attività cellulosolitica) per il controllo di R. solani. Sulla base dell’esperienza acquisita, la prima parte del presente lavoro è stata condotta allestendo esperimenti in vivo, in terreno naturale, valutando l’effetto della presenza nel terreno di 15 isolati di Trichoderma spp.
nei confronti di R. solani, agente causale del “damping-off” del ravanello. La scelta di utilizzare questi 15 isolati è il risultato di prove di accrescimento condotte in piastra, che hanno permesso di individuare questi come i ceppi più veloci a 24°C e con accrescimento confrontabile con quello del patogeno, partendo dall’ipotesi che i potenziali antagonisti devono mostrare un ottimo accrescimento alla temperatura ottimale di crescita del patogeno.
Nel controllo biologico notevole attenzione è rivolta alla competizione come parametro per valutare la fitness degli antagonisti impiegati nella lotta a patogeni di origine tellurica.
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La competizione può verificarsi simultaneamente contro altre popolazioni (competizione co-attiva) oppure l’antagonista può, per primo, colonizzare un substrato dal quale, successivamente, può essere allontanato o, infine, può colonizzare un substrato precedentemente occupato da un altro microrganismo. Lockwood (1988) si riferisce a quest’ultima categoria d’interazione definendola “competizione per il substrato”, simile a quella che Park nel 1960 descrisse come “reazione di antagonismo”. Poiché i residui vegetali, come la paglia utilizzata in questa prova, rappresentano un teatro per la competizione tra funghi del terreno, i quattro isolati di T. harzianum (T4940, T4956, T6741 e T6776) risultati essere in grado di controllare il “damping-off” su ravanello, sono stati sottoposti ad un test in laboratorio volto a valutarne la Capacità Saprotifica Competitiva (CSA), espressa come abilità di interferire con R. solani per la colonizzazione della paglia. La CSA non ha un significato assoluto: dipende dalla microflora con cui gli isolati da testare devono competere. Il semplice protocollo utilizzato nella nostra prova, che prevede l’impiego di terreno sterile, permette una valutazione della capacità saprofitica competitiva di ciascun antagonista nei confronti di R. solani da sola.
R. solani è un fungo caratterizzato come un R-selected (Campbell, 1989) ed è considerato un buon colonizzatore primario (Papavizas, 1970). Tuttavia, grazie alla capacità di esplorare il terreno attraverso un veloce accrescimento del micelio, il patogeno può mostrare una strategia secondaria di tipo S-selected. Le specie di Trichoderma sono caratterizzate come R-selected (Campbell, 1989) con una grande abilità di colonizzare residui vegetali come la paglia (Harper and Lynch, 1989), ma sono considerate anche C- selected per la loro capacità di mantenere il possesso di un substrato o colonizzare un substrato precedentemente occupato (Bruehl and Lai, 1966). Nelle nostre prove, tutti i
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quattro antagonisti si sono mostrati capaci di competere con R. solani per il possesso della paglia anche se a diversi livelli e in funzione dell’isolato di Trichoderma utilizzato. In generale, i quattro antagonisti, sulla base del loro comportamento, hanno mostrato quello che Cook and Rayner (1984) definirono una strategia secondaria di conquista delle risorse. Al primo campionamento (rilievo I) R. solani è il colonizzatore dominante dei pezzetti di paglia, indipendentemente dalla presenza o assenza di ciascuno degli antagonisti. Dal secondo campionamento gli antagonisti hanno ridotto fortemente la presenza del patogeno sulle esche sebbene per un periodo di tempo differente secondo l’antagonista utilizzato. Sulla base della durata dell’efficacia si può tentare di suddividere i quattro isolati in tre categorie. Alla prima appartiene T6741 che si è dimostrato essere non solo il più combattivo (C-selected), ma anche il più stress tollerante (S-selected), impedendo una ricattura dell’esca da parte del patogeno anche quando, trascorso più tempo dall’inoculo, le condizioni ambientali cominciavano a diventare sfavorevoli. Alla seconda categoria appartengono T4940 e T4956. Questi, sebbene combattivi, poichè scalzano il patogeno già dopo 2 giorni dall’inizio della prova, non sembrano essere stress tolleranti, poiché le percentuali delle esche colonizzate da R. solani tendono ad aumentare con il procedere del tempo d’ incubazione. Infine, il peggiore in assoluto sembra essere T6776. Questo isolato è apparso poco combattivo e non ha mostrato alcuna caratteristica di stress tolleranza, riducendo poco e per un periodo di tempo limitato, la capacità di R.
solani di mantenere il possesso dell’esca. Il successo nell’emergenza di piantine sane di ravanello è apparso essere differente per i terreni contenenti i diversi antagonisti. I quattro isolati sono stati raggruppati nuovamente in categorie, sulla base della capacità di contenere il “damping-off” causato da R. solani presente nel terreno. T6741 sembra essere di nuovo il migliore anche nel controllare la malattia, stavolta affiancato nella stessa
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categoria da T4956. T4940 appartiene al secondo gruppo, poiché mostra un andamento meno regolare e porta ad un controllo inferiore della malattia, laddove T6776 è assolutamente il peggiore mostrando una stentata capacità nel contenimento della malattia e i risultati finali non sono dissimili da quelli registrati in presenza del patogeno da solo.
Nel complesso, si può ritenere che gli isolati T6741, T4856 e T4940 siano, in vario grado, capaci di ridurre la colonizzazione della paglia da parte di R. solani e, nel contempo, di ridurre la malattia da questo causato, mentre T6776 non è né un buon competitore né è in grado di ridurre l’attività del patogeno nei confronti delle piante testate.
Poiché Trichoderma è considerato un fungo r-selected, la competizione potrebbe agire nei confronti di quelli che Harper and Lynch (1985) hanno definito come componenti semplici, solubili in acqua, presenti nella paglia che rappresentano fino al 10% del peso e includono fino al 5% del carbonio totale. Possiamo supporre che dopo l’esaurimento di questi semplici composti rimangano disponibili nella paglia solamente i polisaccaridi più complessi, per il cui utilizzo R. solani potrebbe essere meglio adattata. E’ noto che la capacità saprofitica competitiva di un fungo in un substrato lignocellulosico non dipende esclusivamente dalla sua capacità di utilizzare le risorse nutritive ma anche dalla sua tolleranza verso gli effetti di altri microrganismi che colonizzano il substrato (Shearer, 1995). Barker et al. (1967) dimostrarono che la presenza di R. solani tende ad aumentare nei residui organici presenti nel terreno in funzione della diminuzione degli antagonisti.
Uno dei principali limiti all’utilizzo di isolati di Trichoderma come biofungicidi è la loro bassa osmotolleranza. Nessun dei nostri isolati antagonisti è stato capace di accrescersi a valori di potenziale dell’acqua inferiori a -11.00 MPa, confermando la tendenza alla diminuzione della velocità di accrescimento ifale in Trichoderma spp. al diminuire del potenziale idrico, come descritto da Jacson et al. (1991). Kredics et al. (2003) hanno
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dimostrato che sebbene l’attività enzimatica connessa con la capacità antagonista di Trichoderma fosse influenzata dal potenziale dell’acqua, una significante attività enzimatica poteva, tuttavia, essere registrata a – 14.8 MPa, valore ben al di sotto del potenziale idrico a cui il micelio cessa di crescere. I 4 isolati antagonisti sembrerebbero essere più tolleranti alla diminuzione del potenziale dell’acqua rispetto e R. solani, indipendentemente dall’agente osmotico addizionato al substrato di crescita. La maggiore tolleranza di Trichoderma spp. rispetto a R. solani rende questi antagonisti dei promettenti candidati quali agenti di lotta biologica da utilizzare in nicchie sottoposte ad inaridimento come gli strati superficiali del terreno o i residui culturali.
Infine, quando abbiamo valutato l’effetto del pH del substrato sulla crescita dei nostri isolati, R. solani ha mostrato un range più ampio di tolleranza rispetto agli antagonisti.
Valori di pH intorno 4.0 rappresentano l’optimum per i quattro isolati antagonisti, laddove l’intervallo 4.0-6.0 consente di ottenere l’accrescimento maggiore per R. solani.
L’optimum di pH registrato per i quattro antagonisti non differisce da quanto indicato da Danielson e Davey (1973) e da Roiger et al. (1991) per l’accrescimento di Trichoderma spp. e da Kredics et al. (2003) sia per l’accrescimento che per le attività enzimatiche connesse con l’antagonismo. Il ristretto intervallo di pH a cui gli antagonisti hanno l’optimum di crescita potrebbe rappresentare un fattore limitante verso l’impiego di questi isolati in alcuni tipi di suoli. La crescita di questi antagonisti è negativamente influenzata da pH maggiori di 5.0, il che esclude un loro impiego in terreni scarsamente acidi o neutro-alcalini dove è noto che elevati livelli di ammonio tendono a ridurre l’attività di biocontrollo esercitata da Trichoderma spp. (Papavizas, 1985). Inoltre, le condizioni acide sono favorevoli non solo all’accrescimento degli antagonisti, ma possono
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aumentare la produzione di conidi e l’attività di composti antimicrobici come antibiotici ed enzimi litici (Duffy et al., 1997; Cook and Baker, 1983; Dennis and Webster, 1971).
In conclusione del lavoro condotto, l’isolato T6741 sembrerebbe essere il migliore candidato per un utilizzo quale agente di lotta biologica nei confronti di R. solani, grazie alla sua capacità di contenere la malattia e l’abilità di competere con il patogeno per il possesso del substrato. Tuttavia, le sue esigenze ambientali sembrerebbero essere in linea con quelle del patogeno in termini di potenziale dell’acqua mentre l’effetto del pH sull’accrescimento lascia ipotizzare un suo utilizzo in particolari ambienti quali terreni soggetti ad inaridimento e prettamente acidi. Infine, tra i meccanismi d’azione per il contenimento del patogeno, il micoparassitismo sembrerebbe essere il favorito, come emerso dalle indagini microscopiche che hanno evidenziato un’elevata tendenza a formare coilings intorno alle ife di R. solani. La disponibilità di questo isolato che si è dimostrato essere il più promettente rappresenta il punto di arrivo della fase di selezione, ma anche il punto di partenza di ulteriori indagini. I risultati ottenuti offrono spunti stimolanti per successive prove tendenti, da un lato, a valutare l’efficacia di questo isolato in terreni diversi e a definire le condizioni ottimali per ottenere un incremento dell’efficienza, e dall’altro a mettere a punto un processo di fermentazione per la produzione di biomassa dell’antagonista.
