Capitolo 2
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Processo di ripopolamento dei neoblasti in seguito a
trattamento con 5 Gy
(I dati di questo lavoro sono pubblicati in Salvetti et al., Dev. Biol. 2009 vedere allegato 1)
Identificazione della minima dose letale di raggi X
Al fine di identificare la minima dose letale di raggi X, le planarie sono state irradiate con 1, 2, 3, 5, 10, 15, o 30 Gy. Tutti gli animali trattati con 30 Gy e anche il 70% (35/50) delle planarie trattate con 15 Gy muoiono dopo quattro settimane. Tutti gli animali che sopravvivono a questo irraggiamento presentano dopo circa 2/3 settimane delle lesioni nel parenchima dorsale vicino al faringe che successivamente vengono completamente rimarginate. Le planarie irradiate con 1, 2, 3, 5 o 10 Gy non muoiono. Quindi, nelle nostre condizioni sperimentali la dose di 15 Gy può essere considerata la minima dose letale di raggi X per D. japonica.
Tutte le planarie trattate con 10 Gy sopravvivono ma hanno una zona scura a livello del faringe. Nelle planarie trattate con 5 Gy questa pigmentazione scura si ritrova solo raramente (1/50). In tutti i casi la normale pigmentazione viene ristabilita dopo 4 settimane dall’irraggiamento. Sulla base di queste osservazioni negli esperimenti di questo lavoro è stata utilizzata la dose non letale di raggi X di 5 Gy.
Effetti del trattamento con 5 Gy sulla rigenerazione della planaria
Per analizzare gli effetti del trattamento con 5 Gy sulla rigenerazione, le planarie sono state tagliate dopo 60 ore dall’irraggiamento. Gli animali tagliati hanno difficoltà nel rigenerare e mostrano difetti morfogenetici cefalici come ad es. una testa anormale con un solo occhio solitamente centrale (Fig. 2.1A, B). L’analisi del pattern di espressione di Djsyt, un marcatore del sistema nervoso (Tazaki et al., 1999), rivela che 15 giorni dopo il taglio i frammenti che rigenerano la testa, trattati con 5 Gy, hanno gangli cefalici più piccoli rispetto a quelli di animali non trattati (Fig. 2.1C, D). Dopo 3/4 settimane dal taglio gli animali hanno gangli cefalici normali e recuperano completamente i difetti morfogenetici (dati non mostrati).
Fig. 2.1: Effetto del trattamento con 5 Gy sulla rigenerazione di planaria. (A, B) Visione dorsale, la parte anteriore è in alto. (C, D) Visione ventrale, la parte anteriore è in alto. (A) Immagine al microscopio ottico di una planaria irradiata che ha rigenerato la testa, 15 giorni dopo il taglio. La freccia indica l’ occhio centrale singolo. (B) Immagine al microscopio ottico di una planaria non irradiata che ha rigenerato la testa 15 giorni dopo il taglio. Espressione di Djsyt visualizzata mediante ibridazione in situ whole mount in una planaria irradiata con 5 Gy 15 giorni dopo il taglio (C) e in una planaria non irradiata 15 giorni dopo il taglio (D). cf, ganglio cefalico; nc, cordoni nervosi. Scale bar: 400 μm.
Effetti del trattamento con 5 Gy sui neoblasti
Per indagare cosa accade ai neoblasti nelle planarie intatte dopo l’irraggiamento, sono stati condotti esperimenti di ibridazione in situ whole mount utilizzando come sonda il marcatore molecolare dei neoblasti DjMCM2 (Salvetti et al., 2000) (Fig. 2.2). Anche se il time course del pattern di espressione può cambiare a seconda della variabilità individuale, dopo pochi giorni dall’irraggiamento si trova che il numero di cellule esprimenti DjMCM2 sparse nel parenchima e distribuite lungo la linea mediana del corpo anteriore al faringe è ridotto rispetto a planarie non irradiate (Fig. 2.2A). Al quarto giorno, cluster di cellule DjMCM2 positive sono ancora visibili nel parenchima dorso laterale e lungo la linea mediana del corpo, posteriore al faringe. A sette giorni il segnale di ibridazione aumenta di intensità nella parte ventrale degli animali trattati e appare distribuito principalmente in due binari paralleli situati vicino ai cordoni nervosi (Fig. 2.2B). Nei giorni successivi, cellule che esprimono DjMCM2 aumentano sia nel parenchima dorsale che ventrale e sono accumulate dorsalmente tra i due gangli cefalici vicino agli occhi, una zona in cui le cellule DjMCM2 positive solitamente non si ritrovano nelle planarie non trattate. Il tipico pattern di espressione di DjMCM2 è ristabilito solo dopo 40 giorni dall’irraggiamento (Fig. 2.2A). Al fine di escludere la selezione di una popolazione di cellule radioresistenti, le planarie sono state irradiate
nuovamente con una dose di 5 Gy. I risultati ottenuti mostrano che il pattern di espressione di DjMCM2 segue gli stessi cambiamenti spaziali nel tempo descritti sopra (dati non mostrati).
Per analizzare meglio il destino dei neoblasti dopo il trattamento con i raggi X, sono stati condotti esperimenti di ibridazione in situ su sezioni corrispondenti a differenti parti del corpo di animali irradiati e di controllo. Due giorni dopo il trattamento si ha una forte riduzione del numero di cellule esprimenti DjMCM2. Tuttavia sono ancora presenti cellule positive sia nel parenchima ventrale che dorsale (Fig. 2.3A-D). Dopo 4 giorni il numero di cellule presenti nel parenchima dorsale è paragonabile a quello che si osserva a due giorni. Nel parenchima ventrale, invece, si ha un leggero aumento del numero di cellule che esprimono DjMCM2 vicino al sistema nervoso (Fig. 2.3E, F). Nei giorni seguenti il numero di cellule DjMCM2 positive aumenta nel parenchima dorsale e ventrale e si osserva un accumulo del segnale di ibridazione vicino e tra i cordoni nervosi (Figs. 2.3G, H). Successivamente, si assiste ad una diminuzione di cellule positive nel parenchima ventrale e ad un aumento di cellule positive nel parenchima dorsale e diventano visibili gruppi di cellule tra i due rami intestinali (Fig. 2.3I, J). 23 giorni dopo l’irraggiamento il segnale di ibridazione è principalmente accumulato nel parenchima dorsale ed è più intenso rispetto a quello osservato nelle planarie non trattate (Figs.2.3K, L). Questi eventi sono osservabili nella regione anteriore al faringe, a livello del faringe e della coda. Cluster di cellule DjMCM2 positive sono presenti anche nella regione anteriore agli occhi e a livello degli occhi, mentre solo qualche cellula era presente nei controlli (Fig. 2.4).
Una ulteriore evidenza della capacità delle planarie di ricostituire la popolazione di neoblasti dopo il trattamento a 5 Gy viene fornita dall’analisi al FACS delle frazioni di cellule sensibili ai raggi X (X1 e X2) precedentemente identificate (Reddien et al., 2005b; Hayashi et al., 2006). L’analisi al FACS ha dimostrato che il numero di cellule della frazione X1 era fortemente ridotta dopo un giorno dal trattamento, mentre il numero di cellule X2 è simile a quello delle planarie non irradiate. Al terzo giorno il numero di cellule X1 e X2 è ridotto cosi come avviene nelle planarie irradiate con 30 Gy. Nei giorni successivi, le frazioni cellulari sono ristabilite e 12 giorni dopo il trattamento il numero di eventi supera quello delle planarie non trattate (Fig. 2.3M).
Il destino dei neoblasti dopo il trattamento con i 5 Gy è stato seguito anche contando il numero di cellule capaci di entrare nella fase S o M del ciclo cellulare in una finestra temporale di 6 ore. Nelle planarie irradiate dopo un giorno (T1) si osserva che il numero
di cellule nella fase S è drasticamente ridotto. A partire dal quarto giorno (T4) il numero di cellule in fase S aumenta gradualmente e dopo 14 giorni (T14) diventa significativamente più alto che del controllo (Fig. 2.5A). Dopo quattro settimane dall’irraggiamento (T30) il numero di cellule in fase S diventa paragonabile a quello degli animali di controllo. L’analisi del numero di mitosi ha confermato i risultati ottenuti con l’incorporazione della BrdU (Fig. 2.5A).
La marcatura con BrdU è stata utilizzata per confermare la distribuzione delle cellule proliferanti nelle planarie trattate con 5 Gy. Nei controlli dopo 22 ore di incubazione con la BrdU, cellule nella fase S si ritrovano sparse in tutto il parenchima (Fig. 2.5B). 4 giorni dopo il trattamento, si osserva una drastica riduzione di cellule proliferanti rispetto ai controlli, ma rimangono alcune cellule BrdU positive nel parenchima ventrale e dorsale (Fig. 2.5C). Il numero di cellule in fase S aumenta sette giorni dopo dall’irraggiamento e sono per lo più distribuite in prossimità dei cordoni nervosi nel lato ventrale del corpo degli animali trattati (Fig. 2.5D). L’accumulo di neoblasti vicino al sistema nervoso è stato dimostrato anche da esperimenti di co-immunolocalizzazione condotti utilizzando un anticorpo diretto contro un antigene nucleare di cellule proliferanti, DjPCNA (Orii et al., 2005) e un anticorpo diretto contro la sinapsina, una proteina del sistema nervoso (3C11) che marca le sinapsi neuronali e i cordoni nervosi (Fig. 2.6 e 2.7).
Ulteriori analisi al TEM hanno dimostrato la presenza di molti neoblasti localizzati vicino al sistema nervoso (Figs.. 2.8A, B). Alcuni di questi neoblasti possiedono le tipiche caratteristiche di neoblasti di tipo A con nuclei ricchi di eucromatina considerati proliferanti (Higuchi et al., 2007). Molti gruppi di questi neoblasti appaiono orientati verso il parenchima dorsale (Fig. 2.8D). Al contrario, nella stessa regione di animali non trattati, sono presenti pochi neoblasti che possiedono un nucleo ricco di eterocromatina e non sono presenti gruppi di neoblasti orientati verso la superficie dorsale.
Per capire se il sistema nervoso è coinvolto nella ripopolazione dei neoblasti è stato analizzato il rilascio del neuropeptide sostanza P dopo trattamento con i raggi X studiando gli effetti della spantide, un antagonista della sostanza P, sulla proliferazione cellulare negli animali irradiati. Come precedentemente dimostrato (Baguña et al., 1989), si trova che l’aggiunta di spantide agli animali non irradiati determina una lieve stimolazione della proliferazione cellulare. L’aggiunta di spantide insieme alla sostanza P produce una riduzione della proliferazione indotta dalla sostanza P. Negli animali intatti irradiati con 5 Gy trattati con la sola spantide, viene osservata una significante
riduzione dell’attività mitotica rispetto ai controlli a 4 e 7 giorni dall’irraggiamento (Fig. 2.9).
Fig. 2.2: Analisi dell’espressione di DjMCM2 mediante ibridazione in situ whole mount. Visione dorsale, la parte anteriore è in alto. (A) Espressione di DjMCM2 in un animale non trattato e in animali irradiati con 5 Gy a differenti giorni dall’irraggiamento (d). La freccia indica le cellule DjMCM2 positive che si trovano tra i gangli cefalici. (B) Sinapsi neuronale visualizzata mediante immunolocalizzazione con l’anticorpo antisinapsina (3C11) (verde) e espressione di DjMCM2 in animali trattati con 5 Gy. (C) Disegno schematico di una planaria che mostra la distribuzione delle cellule DjMCM2 positive (punti arancioni) 11 giorni dopo l’irraggiamento. Il sistema nervoso della planaria consiste di due gangli cefalici anteriori (cg) e due cordoni nervosi ventrali (vnc); ph, faringe. Scale bar: 400 μm in A; 200 μm in B.
Fig. 2.3: Analisi dell’espressione di DjMCM2 in animali irradiati con 5 Gy ottenuta mediante ibridazione in situ su sezioni trasversali ottenute dalla regione del corpo anteriore al faringe. L’epitelio dorsale è verso l’alto. Espressione di DjMCM2 in un animale di controllo (A) e in animali trattati con 5 Gy sacrificati a differenti giorni dal trattamento con i raggi X (C, E, G, I, K). (B, D, F, H, J, L) Ingrandimento della regione evidenziata in A,C, E, G, I e K rispettivamente. Le frecce nere indicano i cluster dorsali di cellule DjMCM2 positive radioresistenti. La freccia bianca indica le cellule DjMCM2 positive situate tra i rami dell’intestino. (M) Analisi al FACS ottenuta mediante marcatura delle cellule con propidio e calceina. Le popolazioni X1 (blu) e X2 (rossa) sono sensibili all’irraggiamento, la popolazione Xis (nera) è resistente ai raggi X. Scale bar: 150 μm in A, C, E, G, I e K; 25 μm in B, D, F, H, J e L.
Fig. 2.4: Analisi dell’espressione di DjMCM2 in planarie trattate con 5 Gy visualizzata mediante ibridazione in situ su sezioni trasversali ottenute da animali sacrificati 11 giorni dopo il trattamento. (A, F) Schemi della testa di planaria. In A viene indicato il livello delle sezioni raffigurate in B-E; in F viene indicato il livello delle sezioni raffigurate in G-J. (C, E, H, J) Ingrandimento della regione evidenziata in B, D, G ed I, rispettivamente. cg, ganglio cefalico; e, occhi. Scale bar: 400 m in B, D, G ed I; 35 m in C, E, H e J.
Fig. 2.5: Analisi delle cellule proliferanti in planarie non irradiate e trattate con 5 Gy. (A) Analisi delle cellule in fase S e in fase M in animali non irradiati e irradiati con 5 Gy. E’ stato analizzato il numero di cellule capaci di entrare nella fase S o M del ciclo cellulare in una finestra temporale di 6 ore. I valori sono espressi come percentuale rispetto ai controlli ai quali è stato dato arbitrariamente il valore di 100%. Ogni valore è dato dalla deviazione media standard di quattro campioni indipendenti contati in duplicato. (B-D) Distribuzione delle cellule marcate con BrdU in una finestra temporale di 22 ore analizzate mediante immunofluorescenza su sezioni trasversali ottenute dalla regione del corpo anteriore al faringe. L’epitelio dorsale è situato in alto. Gli asterischi indicano il sistema nervoso. Scale bar: 150 μm.
Fig. 2.6: Analisi dell’espressione di DjPCNA in planarie irradiate con 5 Gy visualizzata mediante immunoistochimica su sezioni trasversali ottenute dalla regione anteriore al faringe. Distribuzione delle cellule DjPCNA positive in un animale irradiato sacrificato 11 giorni dopo il trattamento (A) e in un animale non trattato (B). La distribuzione del sistema nervoso è stata rivelata mediante l’uso dell’anticorpo anti-sinapsina (3C11). I nuclei sono stati visualizzati con il colorante nucleare Hoechst. Le frecce indicano i nuclei dell’epidermide. Scale bar: 20 μm.
Fig. 2.7: Analisi dell’espressione di DjPCNA in planarie irradiate con 5 Gy visualizzata mediante immunoistochimica su sezioni trasversali. La parte dorsale è situata in alto. Distribuzione dei neoblasti in un animale irradiato con 5 Gy sacrificato 7 giorni dopo il trattamento (7 d) e in un animale non trattato (UNT). La distribuzione del sistema nervoso è stata rivelata mediante l’uso dell’anticorpo anti-sinapsina (3C11). I nuclei sono stati visualizzati con il colorante nucleare Hoechst. ph, faringe. Scale bar: 150 μm.
Fig. 2.8: Analisi al microscopio elettronico di animali non irradiati e irradiati con 5 Gy sacrificati 11 giorni dopo l’irraggiamento. (A) Neoblasti situati vicino al sistema nervoso di una planaria non trattata. (B) Numerosi neoblasti sono presenti nella stessa regione di una planaria irradiata. (C) Neoblasti nel parenchima dorsale di un animale di controllo. (D) Molti neoblasti (*) orientati verso l’epitelio dorsale di una planaria irradiata. Le frecce nere indicano i neoblasti che hanno il nucleo ricco di eterocromatina. Le frecce verdi indicano i neoblasti che hanno il nucleo ricco di eucromatina. bl, lamina basale; ep, epitelio; ns, sistema nervoso; ne, neurone. Scale bar: 10 μm.
Fig. 2.9: Analisi dell’effetto della spantide (SPA) sull’attivazione mitotica in planarie trattate con 5 Gy. La spantide determina un effetto inibitorio sull’attività mitotica negli animali a 4 (4 d) e 7 giorni (7 d) dall’irraggiamento. I risultati sono espressi come percentuale dell’attività mitotica dei controlli ( 5 Gy PS) ai quali è stato arbitrariamente attribuito il valore di 100%. Ogni barra mostra la deviazione media standard di quattro differenti animali. I dati sono stati ottenuti da due esperimenti indipendenti. *Significativo con p<0,05; **Significativo con p<0,01.
Effetti del trattamento con 5 Gy sulle diverse sottopopolazioni di neoblasti
Per studiare gli effetti del trattamento con 5 Gy sulle specifiche sottopopolazioni di neoblasti è stato analizzato il pattern di espressione di DjPiwi-1 (Fig. 2.10).
Due giorni dopo il trattamento non si ha alcun segnale di ibridazione lungo la linea mediana dorsale del corpo. A partire dal quarto giorno alcune cellule che esprimono
DjPiwi-1 sono visibili nel parenchima ventrale e a 7 giorni il segnale di ibridazione si fa
più intenso e appare organizzato in due cordoni paralleli posti in prossimità dei cordoni nervosi. Successivamente, cellule DjPiwi-1 positive compaiono anche nel parenchima dorsale e, 14 giorni dopo il trattamento, è ripristinato il tipico pattern di espressione nel 60% degli animali irradiati (30/50). Negli altri animali si osserva un segnale di ibridazione più forte e diffuso rispetto ai controlli (Fig. 2.10A). L’evidente centralizzazione del segnale di ibridazione di DjPiwi-1 in seguito all’irraggiamento, ci ha indotto a investigare il ruolo di questo gene durante il ripopolamento cellulare. Quindi, è stato analizzato il pattern di espressione di DjMCM2 in animali in cui è stato silenziato il gene DjPiwi-1, a 2, 4 e 7 giorni dopo irraggiamento. I risultati indicano che il silenziamento di DjPiwi-1 non altera il ripopolamento delle cellule esprimenti
DjMCM2 negli animali trattati con i raggi X (dati non mostrati).
E’ stato analizzato anche il pattern di espressione di altri marcatori di neoblasti,
Djnos (Sato et al., 2006), DjPum (Salvetti et al., 2005) e l’omologo di planaria CIP29
(Rossi et al., 2007). In seguito all’irraggiamento, il numero delle cellule che esprimono
Djnos è notevolmente ridotto rispetto ai controlli ma la loro distribuzione spaziale
rimane invariata e non si osservano mai cellule esprimenti Djnos in posizione ventrale vicino ai cordoni nervosi (Fig. 2.10B). Invece, il pattern di espressione di DjPum e
Fig. 2.10: Analisi dell’effetto del trattamento con 5 Gy sulle diverse popolazioni di neoblasti mediante ibridazione in situ whole mount. Analisi dell’espressione di DjPiwi-1 (A) e Djnos (B) in animali non trattati (UNT) e irradiati con 5 Gy a differenti giorni dal trattamento (d). La parte anteriore è situata in alto. ve, visione ventrale. Scale bar: 400 μm.
Effetti dei trattamenti con 1, 2 e 3 Gy sui neoblasti
Per studiare la radiosensibilità di planarie irradiate a dosi inferiori ai 5 Gy, sono stati condotti esperimenti di ibridazione in situ whole mount su planarie trattate con le dosi di raggi X di 1,2 e 3 Gy (Fig. 2.11). A qualsiasi dose di raggi X, il numero di cellule esprimenti DjMCM2 sparse nel parenchima è ridotto un giorno dopo i trattamenti. Tuttavia, la riduzione è proporzionale alla dose (Fig. 2.11A-C). In particolare, negli animali trattati con 1 Gy dopo un giorno dal trattamento si ha solo una lieve riduzione del segnale di ibridazione di DjMCM2 e dopo due giorni si ritrovano cellule DjMCM2 positive vicino al sistema nervoso (Fig. 2.11D). In planarie trattate con 2 e 3 Gy si osserva ad un giorno dal trattamento una riduzione delle cellule DjMCM2 positive sparse nel parenchima e a due giorni dal trattamento una riduzione dei clusters laterali dorsali (Fig. 2.11E, F). Inoltre, negli animali irradiati con 2 o 3 Gy dopo 4 giorni è presente l’accumulo di cellule esprimenti DjMCM2 nel parenchima ventrale e vicino ai cordoni nervosi, che si osserva negli animali trattati con 5 Gy 7 giorni dopo il trattamento (Fig. 2.11H, I). Quindi, la distribuzione spaziale delle cellule che esprimono
DjMCM2 nelle planarie trattate con 1, 2 e 3 Gy è simile a quella osservata negli animali
trattati con 5 Gy. Tuttavia gli eventi sono temporalmente anticipati probabilmente a causa di una ridotta perdita di neoblasti negli animali trattati con una dose minore di raggi X.
Fig. 2.11: Analisi dell’espressione di DjMCM2 in animali trattati con i raggi X (1, 2 and 3 Gy) mediante ibridazione in situ whole mount. Distribuzione delle cellule che esprimono DjMCM2 1 giorno (A, B, C), 2 giorni (D, E, F) e 4 giorni (G, H, I) dopo il trattamento con i raggi X. Le frecce indicano le cellule DjMCM2 positive in prossimità del sistema nervoso. Scale bar: 400 μm.
