AUGALO KRŪMINĖS PERILĖS (Perilla frutescens (L.) Britton) IMUNOMODULIACINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS IR ĮVERTINIMAS

KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS

Virginijus Gailys

AUGALO KRŪMINĖS PERILĖS (Perilla frutescens

(L.) Britton) IMUNOMODULIACINIŲ SAVYBIŲ

TYRIMAS IR ĮVERTINIMAS

Disertacija rengta Kauno medicinos universiteto Fiziologijos katedroje 2001-2005 m.

Mokslinis vadovas:

doc. habil. dr. Konstancija Jankauskienė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, visuomenės sveikata -10 B)

Konsultantas:

prof. habil. dr. Regina Gražulevičienė (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B)

T U R I N Y S

Sutrumpinimai ... 3

1. ĮVADAS ... 4

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 6

3. LITERATŪROS APŽVALGA... 6

3.1. Imunologijos problemos ... 6

3.2 Augalinės kilmės imunomoduliatoriai ... 8

3.3. Augalinių preparatų šaltinis - Perilla frutescens (L.)Britton. ... 10

3.4. Perilla frutescens (L.) Britton. farmakologinės savybės... 16

4. TYRIMO OBJEKTAS IR METODAI ... 19

4.1. Tyrimo objektas ... 19

4.2. Metodikos ... 21

5. STATISTINĖ REZULTATŲ ANALIZĖ ... ... 28

6. TYRIMO REZULTATAI ... 29

6.1. Periferinio kraujo leukocitų ir limfocitų skaičiaus kitimas ... 29

6.2. Timocitų ir splenocitų skaičiaus pokyčiai ... 39

6.3. Fagocitozės aktyvumo kitimas, veikiant Perilla frutescens (L.)Britton. ekstraktais .. 43

6.4. Alergizuojamosios Perilla frutescens (L.) Britton. preparatų savybės ... 48

6.5. Antimikrobinis Perilla frutescens (L.) Britton. preparatų poveikis ... 51

6.6. Organų morfologiniai pokyčiai ... 56

7. REZULTATŲ APTARIMAS ... 59

9. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 68 10. PUBLIKACIJOS DISERTACIJOS TEMA ... 81 11. PRIEDAI ... 82

SUTRUMPINIMAI

HBSS - Henkso subalansuotas druskų tirpalas (angl.- Hank’s balanced salt solution) IFN -Interferonas

Ig - Imunoglobulinai IL - Interleukinai LPS - Lipopolisacharidai NK - natūralūs kileriai

PBMC - Periferinio kraujo vienabranduolės ląstelės (angl.- Peripheral blood mononuclear

cells)

PHA - Fitohemoagliutininas (angl. - Phytohemagglutinin) PMN - Polimorfonuklearai (neutrofiliniai leukocitai) PSO - Pasaulinė Sveikatos Apsaugos Organizacija

1. Į V A D A S

Šiuo metu pasaulyje gausėja susirgimų, kurių patogenezės grandyje yra imuninės sistemos funkcijų pakitimai. Aktuali imunopatologijos problema - imuninės sistemos funkcijų sutrikimų, kuriems priklauso pirminis ir antrinis imunodeficitas, alerginės ir autoimuninės ligos, transplantato atmetimo reakcija, navikai ir kitų ligų plitimas [31; 48; 102;138].

Viena iš aktualiausių imunologijos problemų yra naujų sintetinių imunomoduliatorių sukūrimas bei natūralios augalinės kilmės preparatų paieška ir jų panaudojomas žmogaus imunodeficitinių būklių bei infekcinių ligų gydymui [22; 53; 74; 192].

Pastaruoju metu vėl atkreiptas dėmesys į fitoterapiją, tačiau augalinės kilmės preparatų, efektyviai veikiančių imuninę sistemą, yra nedaug [30]. Pažymėtinas A-konkanavalinas (Con A), išskirtas iš Fabaceae šeimos augalų Convalia ensiformis ir PHA iš

Phasceolus vulgaris, yra T ląstelių polikloniniai stimuliatoriai. Iš Phytolacca americana L.

išskirtas PWM - pokewed mitogenas aktyvuoja T ir B limfocitų blasttransformaciją [67; 109]. Atlikus augalinės kilmės imunomoduliatorių temos literatūros šaltinių studiją, rezumuota, kad augalų, efektyviai veikiančių žmogaus imuninę sistemą, sąrašas nėra ilgas. Naujausiuose vaistų žinynuose įtrauktas tik vienas augalinis preparatas, veikiantis imuninę sistemą [9]. Tai Lietuvoje geriausiai žinomi ir dažniausiai vartojami Echinaceae preparatai, didinantys organizmo natūralų rezistentiškumą ir atsparumą infekcijoms [7; 16; 17; 103].

Eksperimentais ir klinikiniais tyrimais nustatyta, kaip kai kurie augaliniai preparatai veikia žmogaus ar gyvūnų imuninę sistemą [93; 96; 137]. Paaiškėjo, kad imunodeficitines būkles, atsiradusias dėl infekcinių, navikinių ar kitų ligų, galima koreguoti augaliniais preparatais, kurie yra mažiau toksiški už sintetinius. Tam tikri augalinės kilmės

imunomoduliatoriai pajėgūs koreguoti konkrečią imuninės sistemos nepakankamumo grandį. Fitoimunostimuliatoriai pajėgūs patikimai didinti organizmo ląstelinį ir humoralinį atsaką prieš antigenus, todėl gali būti veiksminga imunodeficitines būkles sukeliančių ligų terapijos dalis [13; 15; 22; 25; 147; 189].

Preparatų, efektyviai skatinančių imuninės sistemos veiklą yra nedaug, o specifinė imunostimuliacija vakcinomis taikoma tik atskirų infekcinių ligų profilaktikai. Šiuo metu daug dėmesio skiriama nespecifiniams imunostimuliatoriams, aktyvinantiems nespecifinio imuniteto grandį – fagocitozę (ji kartu su antigeną pristatančiom ląstelėmis susiduria su svetimkūniais ir juos apdoroja). Vis plačiau vartojami augaliniai nespecifiniai imunostimuliatoriai, skatinantys fagocitozę, kurie mažiau sensibilizuoja ir pasižymi mažesniu šalutiniu poveikiu už sintetinius preparatus [30; 33].

Imunostimuliatorių savybių tyrimas yra Europos Komisijos ir prioritetinės Lietuvos mokslinių tyrimų krypties „Geros kokybės, saugaus ir ekologiškai švaraus maisto technologijos“ dalis.

Krūminės perilės preparatai, paruošti iš Lietuvoje introdukuoto augalo Perilla frutescens

(L.) Britton., mažai tirti, jų poveikis nėra aiškus, todėl savo mokslinio tyrimo objektu

pasirinkome šį augalą [134]. Tyrimais siekėme detaliau ištirti bei įvertinti Perilla frutescens ekstraktų farmakologines savybes ir jų reikšmę imuninei sistemai [133].

MOKSLINIS NAUJUMAS

Pasaulyje nemažai literatūros duomenų, kuriuose aprašomos Perilla frutescens (L.)

Britton. preparatų įvairios farmakologinės savybės. Šis augalas pasižymi plačiu biologinio

veikimo spektru, tačiau Lietuvą jis pasiekė palyginus neseniai (nuo 1990 m.) ir iki šiol nebuvo tirtos jo imunomoduliacinės galios. Šiame darbe pirmą kartą Lietuvoje ištirtos mūsų kilmatinėse sąlygose (Vytauto Didžiojo universiteto Kauno Botanikos sodo Vaistinių augalų kolekcijoje) išaugintos krūminės perilės žolės vandeninės bei spiritinės ištraukų imunomoduliuojančios savybės ir jų poveikis imuninei sistemai.

Darbas yra sudėtinė Lietuvos valstybinio mokslo ir studijų fondo remiamo projekto „Augalinės kilmės ekologiški funkciniai ingredientai ir maisto priedai maisto saugai ir kokybei", dalis.

Naujo efektyvaus imunomoduliatoriaus sukūrimas ir įdiegimas į medicinos praktiką yra ilgas bei brangus procesas, todėl naudingiau tęsti šių savybių paieškas augalinės kilmės preparatų tarpe. Augaliniai preparatai yra mažiau toksiški už sintetinius analogus, fitoimunostimuliatoriai neturi šalutinio poveikio. Ištyrus Lietuvoje introdukuotos Perilla

frutescens (L.) Britton. preparatų savybes bus pasiūlyta farmacijos pramonei pradėti naujo

vietinės žaliavos augalinio imunostimuliatoriaus, skirto kai kurių imunodeficitinių ligų gydymui, gamybą.

DARBO APROBAVIMAS

Pagrindiniai tyrimo rezultatai paskelbti 4 straipsniuose, vienoje tarptautinėje konferencijoje.

2. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Įvertinti Lietuvoje introdukuoto augalo krūminės perilės - Perilla frutescens (L.)

Britton. žolės vandeninių ir spiritinių ekstraktų imunomoduliacines savybes, jų poveikį

ląsteliniam imunitetui.

2.2. DARBO UŽDAVINIAI:

1. Įvertinti imunokompetentinių ląstelių - leukocitų skaičiaus bei jų formų pakitimus eksperimentinių gyvuliukų kraujyje, veikiant Perilla frutescens (L.) Britton. preparatais.

2. Ištirti Lietuvoje introdukuotosP. frutescens ekstraktų poveikį imunokompetentinių

lastelių pirmtakų (timocitų ir splenocitų) skaičiaus kitimui.

3. Nustatyti P. frutescens preparatų nespecifinį poveikį imuninės sistemos ląsteliniam faktoriui - neutrofilų fagocitozės aktyvumuii in vitro ir in vivo.

4. Ištirti krūminės perilės ekstraktų alergizuojamąsias savybes.

5. Ištirti P. frutescens antimikrobinį poveikį įvairioms mikroorganizmų kultūroms ir klinikinėms padermėms.

6. Nustatyti morfologinius eksperimentinių gyvuliukų organų pokyčius, veikiant P.

3. L I T E R A T Ū R O S A P Ž V A L G A

Imuninės sistemos ligos vadinamos imunodeficitais, kurie gali būti pirminiai (įgimti) ir antriniai (įgyti) [31]. Sergamumas didesnis antriniais imunodeficitais, kuriuos sukelia įvairūs aplinkosveiksniai, tokie kaip bakterijos, virusai, helmintai, cheminės medžiagos, vaistai, radiacija, stresas ir kt. [102; 117]. Imuninės sistemos supresija stebima sergant alerginėmis ligomis, bronchine astma, onkologinėmis ir kt. ligomis [102]. Imunodeficitinių būklių metu padidėja sergamumas infekcinėmis ligomis, nes organizmas negeba greitai sunaikinti infekcijos sukėlėjų. Šių būklių metu padidėja infekcijos išplitimo galimybė, aktyvėja oportunistinės infekcijos, sukeltos adenovirusų, citomegalo virusų ir kt. [117]. Sėkmingas imuninės sistemos nepakankamumo gydymas priklauso nuo to, kurioje sistemos grandyje yra defektas. Esant T sistemos defektui suaktyvėja oportunistinė infekcija, dėl granuliocitų, monocitų funkcijų sutrikimų ar pašalinus blužnį, aktyvėja kapsulinės bakterijos, o dėl komplemento sistemos nepakankamumo aktyvėja gonokokinė infekcija [102].

Pagal PSO klasifikaciją skiriamos 5 įgytų imunodeficitų, kurie gali pažeisti T, B sistemas arba ląsteles reguliatorius, grupės. Esant parazitų invazijai, gali atsirasti imuninės sistemos nepakankamumas. Imunosupresinės būklės, kurias sukelia lėtinės bakterinės kilmės ligos labiausiai slopina ląstelinio imuniteto veiksnius. Sergant virusine infekcija, pakinta imuninė sistema, pasireiškia ląstelinio bei humoralinio imuniteto nepakankamumas, nes virusai gali sukelti imunodepresiją, per T supresorius sutrikdyti imunokompetentinių ląstelių diferenciaciją [48; 117; 195]. Sergant ūmine virusine infekcija pasireiškia ląstelinio imuniteto veiksnių nepakankamumas, todėl ši liga dažnai komplikuojasi, pasireiškia hospitalinė infekcija.

Aktualus imunopatologijos atstatymas, sergant piktybiniais navikais. Per pastaruosius 25 metus, nustatyta, kad sergamumas navikais Lietuvoje didėja kasmet vidutiniškai 1% (vyr. - 1.6%, mot. - 0.5%) [76; 82]. Onkologijoje gydymui naudojant spindulių terapiją bei chemoterapiją citostatikais, kurie yra stiprūs imunodepresantai, imuninės sistemos atstatymas imunostimuliatoriais tampa aktualiu uždaviniu [36; 74; 77; 82; 87; 128; 151; 172].

Nepakankamai maitinantis ar sutrikus rezorbcijai, esant neigiamam azoto balansui, sergant lėtiniu alkoholizmu ar piktnaudžiaujant vaistais, lėtėja ląstelių proliferacija, baltymų sintezė, mažėja T limfocitų, silpnėja jų funkciją. B sistema pažeidžiama mažiau, tačiau imunoglobulinų sintezė gali būti sumažėjusi [87; 138; 195].

Nuo seno T limfocitams stimuliuoti, imunodeficitui gydyti naudojami preparatai, gaunami iš stambiųjų raguočių čiobrialiaukės. Tai -T aktyvinas, timalinas ir kt. [41]. T limfocitų aktyvumą stimuliuojantys preparatai gaminami iš mielių polisacharidų arba jie komponuojami su kitais augalinės kilmės produktais. Dažnai stimuliacijai naudojami bakterinės kilmės lipopolisacharidai iš E. coli, Vi - antigenas, pneumokokinis polisacharidas ir kiti [25; 189].

3.2. AUGALINĖS KILMĖS NESPECIFINIAI IMUNOMODULIATORIAI

Pasaulyje vyrauja tendencija daugiau vartoti natūralios kilmės vaistus, o peršalimo ligų profilaktikai - skatinti natūralų organizmo rezistentiškumą [20; 22; 165; 196]. Lietuvos medicinos praktikoje gerai žinomi augaliniai imunomoduliatoriai [25; 85; 94; 145; 168; 174; 182; 185]. Įvairūs ežuolės preparatai imunostimuliatorių klasifikacijoje net išskirti atskira grupe [6; 135]. Ištyrus Echinaceae purpura Moench. preparatų poveikį ląstelinei imuninei sistemai, nustatyta, kad Echinaceae Moench. ir Rudbeckia L. etanoliniai ekstraktai didina imunokompetentinių ląstelių skaičių, turi imunostimuliacinį veikimą, nes stimuliuoja makrofagų fagocitinį, metabolinį bei bakteriocidinį aktyvumą [16; 18; 107]. Echinaceae ekstraktai didina neutrofilų fagocitinį aktyvumą net 22 procentais [123; 197]. Purpurinės ežuolės ekstrakto ir timostimulino poveikyje mažėja CD8+ (T supresoriai/citotoksiški) ir didėja CD4+(T helperiai) ląstelių kiekis, daugėja NK (natūralių žudikų) bei periferinių PMN (polimorfonuklearų) ląstelių kiekis ir jų aktyvumas [28; 29; 70; 88; 123].

Literatūros duomenimis, kai kurie kiti augalai taip pat gali stimuliuoti T imuninę sistemą, kaip pavyzdžiui Andrographis paniculata ekstraktas stimuliuoja nespecifinį imuninį atsaką, didindamas makrofagų migracijos indeksą bei neutrofilų fagocitinį aktyvumą [20; 131; 174].

Tiek liaudies, tiek tradicinėje medicinoje žinomi priešuždegiminiai augaliniai preparatai, kaip pavyzdžiui, Haplophyllum hispanicum ekstraktas. Jis stabdo uždegiminių edemų formavimąsi [80; 129]. Tinospora cordifolia, Crataegus sinaica ir kitų augalų komponentai, priklausomai nuo dozės, inhibuoja C3-konvertazę, pasižymi antikomplementinėmis ir imunomoduliacinėmis savybėmis. Jie veikia ląstelinį imunitetą, didindami makrofagų aktyvumą [74; 144; 164]. Panašiai veikia ir Dipsacus asperoides šaknų polisacharidų ekstraktas, kuris turi antikomplementinių savybių ir stimuliuoja limfocitų

mitogeninį bei makrofagų fagocitinį aktyvumą [181]. Polypodium leucotomos ekstraktas, turintis imunomoduliacinių savybių, vartojamas uždegiminių ligų gydymui, apsaugo nuo saulės UV spindulių žalingo poveikio [42]. Osbeckia octandra, Melothria maderaspatana ir

Phyllanthus debelis vandeniniai ekstraktai, gali būti skiriami kepenų uždegiminių ligų

gydymui. Jie pasižymi stipriu antikomplementiniu efektu, inhibuoja tiek klasikinį, tiek alternatyvų komplemento sistemos aktyvinimo kelius, slopina zimozano poveikį polimorfonukleariniams leukocitams [159]. Yra žinomi ir kiti augalai, tokie kaip Cedrela lilloi,

Trichilia elegans, kurie pasižymi antikomplementiniu poveikiu, slopina fagocitozę.

Eksperimentais in vitro įrodytas jų imunomoduliacinis efektas pelių imuninei sistemai. Nustatyta, kad jie gali inhibuoti T limfocitų proliferaciją blužnyje [116]. Kai kurių priešuždegiminių bei antipiretinių augalinių vaistų, tokių kaip Tripterygium wilfordii, Aconitum ar Artemisiae arbatos, turi imunosupresinių savybių. Jie stimuliuoja antinksčių funkciją, kas prolonguoja audinių transplantantų atmetimo reakcijos laiką [94]. Cedrela tubiflora ekstraktai turi ryškų inhibicinį poveikį fagocitozės aktyvumui, ConA stimuliuotų limfocitų proliferacijai ir kitiems žmogaus imuninės sistemos komponentams [8]. Jie taip pat gali būti taikytini klinikoje reumatoidinių artritų, lėtinių nefritų, sisteminės lupus erythematosus ir įvairių odos ligų gydymui.

Jau virš 1000 m. tradicinėje kinų medicinoje ypač gausiai vartojami įvairūs imunomoduliacinių savybių turintys augalai [13; 60; 179; 180]. Įvairūs grybų metabolitai ar žolių polisacharidai vartojami Kinų medicinoje, kaip efektyvūs imunostimuliatoriai [3; 13; 47; 92]. Eksperimentais su gyvuliukais bei moderniais klinikiniais tyrimais įrodyta, kad augaliniai imunostimuliatoriai, tokie kaip polisacharidai ar saponinai, išskirti iš Astragalus mongholicus,

Acanthopanax senticosus, Panax notoginseng ir kitų augalų, stimuliuoja makrofagus, antikūnų

formavimąsi, aktyvuoja komplemento sistemą ir didina T limfocitų proliferaciją [90; 94].

Polygonum cuspidatum, Rehmannia glutinosa, Taraxacum officinale, Oidenlandia diffusa

preparatai stimuliuoja ląstelinį nespecifinį imunitetą [97].

Gerai žinomo Panax ginseng polipeptidai, priklausomai nuo dozės, veikia periferinio

kraujo limfocitus, kurie gali būti aktyvuoti fitohemaglutininu (PHA) [171]. Ženšenio preparatų sudėtyje esančių didelės molekulinės masės proteinų veikimas yra imunomoduliacinio efekto pagrindas. Iš ženšenio ląstelių kultūros gautas polisacharidas eksperimentuose pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, didina imuninės sistemos aktyvumą, fagocitozę, efektyvus gydant

Staphylococcus aureus sukeltas odos infekcijas [188]. Ženšenio alkaloidų ekstraktas turi protekcines savybes prieš radiaciją [78], o ženšenio saponinai turi imunostimuliacines savybes

[177]. Tokio plataus biologinio veikimo mechanizmai nėra pilnai išaiškinti, bet nustatyta, kad ženšenio šaknų ekstrakto imunomoduliacinis poveikis susijęs su polisacharidais, kurie aktyvuoja žmogaus neutrofilų chemotaksį [149].

Literatūroje skelbiami duomenys, kad ištyrus Polypodium leucotomos ekstrakto preparato Anapsos poveikį žmogaus leukocitų sistemai, buvo nustatyta, kad jis skatina T limfocitų proliferaciją [10]. Autorių duomenimis, Polygonatum odoratum Druce ir Cuscuta

australis R. didina limfocitų proliferaciją, makrofagų fagocitozės aktyvumą ir fagocitozės

indeksą. Fagocitozės aktyvumą gali stimuliuoti augalinės ar mikrobinės kilmės produktai. Pastarieji suardo antigenus ir gerina makrofagų fermentų virškinimą [173]. Phytolacca acinosa polisacharidai stiprina imunines funkcijas in vivo, nes jų įtakoje didėja NK ląstelių aktyvumas bei limfocitų proliferacija. Tai įrodyta eksperimentais, kai po pelių apšvitinimo, būna sumažėję limfocitų proliferacija bei NK ląstelių aktyvumas [166]. Jūros dumblių preparatas Zosterin, turintis pektinų pasižymi antibakteriniu aktyvumu bei stimuliuoja ląstelinį imunitetą. Jis didina PMN leukocitų migraciją ir fagocitozės aktyvumą [186].

Praeito amžiaus 60-ųjų metų gale navikų gydymui Europoje tūkstančiams pacientų sėkmingai buvo pradėtas taikyti amalo (Viscum album L.) standartizuotas preparatas Viscumin, kurio veikimo pagrindas yra imuninės sistemos stimuliacinės savybės. Jis yra kaip adjuvantas biologinėje vėžio terapijoje [12; 36; 152]. Optimali jo dozė didina blužnies ir čiobrialiaukės masę, timocitų, makrofagų, leukocitų, iš jų T limfocitų ir monocitų skaičių, o mažina periferinio kraujo granuliocitų kiekį [154]. Viscum album L. ekstrakto lektinai inhibuoja visų tipų navikinių ląstelių augimą, nes keičia jų genominę DNR struktūrą ir turi citotoksinį efektą [66; 85; 153]. Jo ekstraktai veikia polimorfonuklearus, CD4+ (Th ląsteles) ir CD14+ (monocitus/makrofagus). Amalo preparatai aktyvuoja periferinio kraujo monocitus, įtakoja Th1/Th2 pusiausvyrą [153; 154]. Amalo ekstraktas (Iscador QuFrF) žymiai didina CD4+ ir priešingai, mažina CD8+ ląstelių kiekį. Taip pat jis didina T ląstelių migraciją, o citotoksinis amalo efektas atipinėms ląstelėms gali būti aiškinamas apoptozės stimuliavimu [69; 113]. Yra duomenų, kad kai kurių augalų ekstraktai pasižymi potencialiu priešvėžiniu veikimu, kadangi jie inhibuoja navikinių ląstelių augimą, indukuoja endogeninį citotoksinį veiksnių (TNF) [121; 136; 167]. Be to, veikia kaip antivirusiniai preparatai prieš herpes simplex bei influenza virusus. Pušų preparatai skatina makrofagus, PMN ir splenocitų DNR sintezę [144]. Polisacharidai, gauti iš pušų sėklų ekstrakto aktyvuoja T limfocitų proliferaciją, didina neutrofilų fagocitinį aktyvumą ir makrofagų chemotaksį [5]. Melilotus officinalis sudėtyje

esantys polisacharidai pasižymi ir imunokoreguojančiomis savybėmis, nes veikia blužnies ir čiobrialiaukės ląstelių proliferaciją [20; 192].

Taigi, augaliniai preparatai veikia žmogaus ir gyvūnų imuninę sistemą, jie gali būti vartojami imunodeficitinių būklių korekcijai.

3.3. AUGALINIŲ PREPARATŲ ŠALTINIS - Perilla frutescens (L.)Britton.

Vienas iš augalinių imunomoduliatorių yra krūminė perilė (Perilla frutescens (L.)

Britton, š. Lamiacae), sinonimai: Mentha perilloides, Melissa cretica, Perilla ocymoides, Perilla arguta, Ocimum frutescens, (angl. - Breefsteak Plant) [65].

Ši perilės rūšis kilusi iš Pietryčių bei Rytų Azijos, kur auga natūraliose augimo vietose bei auginama kaip komercinė kultūra. [50; 130]. Ji Azijoje kitaip vadinamas Ao Shiso, bifštekso augalu, barškuolės gyvatės piktžole, purpurine mėta, kiniečių baziliku, laukiniu sezamu [64; 130]. Krūminė perilė sėkmingai auginama daugelyje Azijos šalių, ypač Korėjoje, Kinijoje, Japonijoje, Indijoje, be to, Šiaurės Amerikoje, Pietų Afrikoje, Kipre, Pietryčių Europoje, Ukrainoje [14; 45; 50; 118]. Šių šalių mokslininkai nustatė biologiškai aktyvių junginių kaupimąsi P. frutescens vaistinėje žaliavoje: lapuose, vaisiuose [21; 34; 35; 56; 95; 114; 115].

P. frutescens vaistinės žaliavos vartojimas pateikiamas vienoje iš Senovės Kinijos

medicinos knygų „Kampo medicinoje" [14; 158]. Laikui bėgant, sukaupta daug empirinių žinių apie šio augalo vaistinės žaliavos ir iš jos pagamintų preparatų poveikį žmogaus organizmui. Pastaraisiais metais užsienio šalyse atlikta daug moksliškai pagrįstų eksperimentinių tyrimų ir nustatytas P. frutescens preparatų antimikrobinis, imunostimuliuojantis, priešalerginis, desensibilizuojantis, priešnavikinis veikimas [57; 64; 73; 91; 176].

Yra mažiausiai devyni augalo panaudojimo būdai: sėklos vartojamos pašarų gamybai ar žmonių maistui; sėklų aliejus - kaip degalai, taip pat valgių gaminimui; lapai - kaip prieskoniai, maisto papuošimui bei medicinoje; iš lapų išskirtas, distiliuotas aliejus - kaip eterinis aliejus parfumerijoje [105]. P. frutescens (L.) Britton. var. crispa Decne. forma

purpurea Makino augalų lapai yra tamsiai raudonos spalvos, todėl vartojami konservuojant

vaisius (kriaušių, obuolių) spalvai išsaugoti [50; 105].

1800 m. perilė atvežta į JAV emigrantų iš Azijos šalių. Ten greitai adaptavosi ir šiuo metu pietuose ir rytuose paplitusi kaip vienmetė piktžolė, užauganti iki 1 metro aukščio, arba dėl didelių raudonų karpytų bei pūkuotų lapų ir stipraus mėtų aromato naudojama parkų, sodų

apželdinimui. Lapai kartais būna tokie dideli ir raudoni, jog primena supjaustytą jautieną, todėl perilė dažnai vadinama bifštekso augalu. Sėklas brandina ankštyse, kurios vėjuje stipriai barška (todėl dar vadinama gyvatės barškuolės piktžole) [50; 64; 130].

Lietuvoje krūminė perilė auginama nuo 1990 m. kaip dekoratyvinis augalas parkuose, skveruose, darželiuose. Jau 1998 m. įrodyta, kad tai perspektyvus vaistinis augalas — imunomoduliatorius, introdukuojamas Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sodo Vaistinių augalų kolekcijoje ir ekspozicijoje. Dabar tiriamos šios rūšies biologinės farmakognostinės savybės, įvertinama vaistinės žaliavos kiekybė, kokybė bei jos antioksidacinis aktyvumas [23; 126; 134; 157].

Botaninė charakteristika

Perilla L. gentyje yra šešios rūšys, kurios paplitusios šiltuose subtropiniuose ir

tropiniuose Azijos regionuose. Perilla L. - tai vienamečiai, o kartais ir daugiamečiai žoliniai augalai arba puskrūmiai [4]. Lietuvoje auginama tik viena jos rūšis – tai krūminė perilė (Perilla frutescens (L.) Britton.). Tai - vienametis žolinis, vaistinis notrelinių (Lamiaceae

Lindi.) šeimos, 80-90 cm aukščio augalas, o kultūroje išauga daugiau kaip 100 cm. Jos stiebas

šakotas, tuščiaviduris, briaunotas. Lapai žali arba tamsiai raudonai violetiniai, raukšlėtu paviršiumi, širdiško pamato, nusmailėjusia viršūne, dantyti (1 pav.).

1 pav. Perilla frutescens (L.) Britton. augalo vaizdas (http://em.ca/garden/ann-photos.html)

2 pav. Žydinti krūminė perilė (http://em.ca/garden/ann-photos.html)

Žiedų koteliai ilgi, siekia iki 25 cm. Patys žiedai smulkūs, cilindro formos, gausūs, purpurinės spalvos. Žiedai - dvilyčiai, susitelkę poromis viršutinių lapų pažastyse, zigomorfiniai. Apyžiedis sudėtinis, penkianaris. Žiedų visuma sudaro tankų viršūninį varpos pavidalo žiedyną (2 pav.).

Krūminės perilės vaisius - sausasis riešutėlis, 1000 vaisių masė -2,6-3,9 g. Augalas žydi liepos-spalio mėnesiais, vaisiai bręsta rugsėjo-spalio mėnesiais, augalas nunyksta tik gruodžio mėnesį [3; 33; 50; 65; 132].

Gamtoje perilė - nuodingas augalas, todėl raguočiai juo neminta. Labiausiai toksiškas vasaros pabaigoje. 1977m. Wilson’as išskyrė toksiną -“perilės ketoną”, kuris daugeliui gyvūnų sukelia plaučių edemą. Japonijoje su perile dirbantiems darbuotojams (20-50 proc.), dėl kontakto su perillaldehidu, išsivysto dermatitai [130]. Tačiau medicinoje šis augalas yra labai vertingas.

Biologiškai aktyvūs junginiai.

Įvairių P. frutescens dalių cheminė sudėtis skirtinga. Augalo lapuose yra apie 0,2% įvairios cheminės struktūros eterinių aliejų. Pagal tai perilė skirstoma į keletą skirtingų chemotipų :

perilės aldehidinis chemotipas (PA), dažniausiai auginamas ir vienintelis, kuris naudojamas maisto gamyboje. Pagrindinis komponentas (75%) yra perillaldehidas (p-mentadien-1,8(9)-al(7)is), kuris dažnai sukelia odos alergines reakcijas. Taip pat, tik

mažesniais kiekiais išskiriami limonenas (13%), linalolis, β-kariofilinas, l-mentolis, α-pinenas, perilenas (2-metil-5-(3-oksolanil)-2-pentenas) ir elemicinas;

perilės ketoninis chemotipas (PK), kurio pagrindinis komponentas yra perilla ketonas, dėl kurio augalas yra toksiškas, tačiau kartu turintis vidurius laisvinantį poveikį. Dar randama izoegomaketono ir perileno;

perilės elsholzia ketoninis chemotipas (EK), kurio sudėtyje pagrinde randama elsholzia bei naginata ketonų;

perilės perileninis chemotipas (PL), kurio sudėtyje didžiausia dalis tenka perilenui ir šiek tiek mažiau - citraliui, perilla ketonui ir izoegomaketonui;

perilės fenilpropanoidinis chemotipas (PP), toks pat toksiškas kaip ir perilės ketoninis chemotipas, kurio sudėtyje daugiausiai randama fenilpropanoidų: dilapiolio, elemicino, safrolio ir miristicino. Pastarasis turi haliucinogeninių savybių;

perilės citralinis chemotipas (C), kurio pagrindinis komponentas yra citralis, malonaus citrinų kvapo ir skonio medžiaga, dažnai naudojama parfumerijos ir maisto pramonėje, o mažesniais kiekiais - perilenas, perilla ketonas, izoegomaketonas.

Yra dar vienas chemotipas, turtingas rozfuranu, kuris gali būti naudojamas kaip pigesnis pakaitalas rožių aliejui parfumerijoje [130].

P. frutescens antžeminėje dalyje kaupiasi eterinis aliejus, kurio sudėtyje yra

perilaldehido, perilketono, miristicino, dilapiolio, limoneno, alfapineno; perilozidų (A - D), citrusino C; flavonoidų (apigenino ir liuteolino glikozidai); antocianinų; mineralinių medžiagų; raugų [4, 21; 34; 115; 126]. Žolėje susikaupęs perilaldehido vienas iš darinių, perillartinas, pasižymi tuo, jog apie 2000 kartų saldesnis nei cukrus ir aštuonis kartus už sachariną, todėl Japonijoje naudojamas kaip dirbtinis saldiklis [56; 169]. Be to, augalas turtingas pseudotaninais ir antioksidantais, būdingais mėtinių šeimos augalams, apigeninu, askorbinine rūgštimi, β-karotinu, kofeinine rūgštimi, luteolinu, dilapioliu, protokatechine rūgštimi, kvarcetinu, rozmarinine rūgštimi [64; 95; 130].

Švieži perilių lapai yra turtingi sausųjų medžiagų (20,7-23,6 proc), karotino (5,6-7,0 mg/proc), antocianinų (5,1-97,8 proc.). Rentgenoflorescensiniu ir atominės emisijos metodais džiovintuose perilių lapuose nustatytas didelis kiekis kalio (3950 mg/100 g sausosios masės), kalcio (1090 mg/l 00 g), magnio (100mg/100 g), geležies (120 mg/100 g), boro (5,6 mg/100g), molibdeno (0,5 mg/100 g).

Vaisiuose kaupiasi: rozmarino rūgštis, 3,4-dihidroksibenzaldehidas, metil-3,4- dihidroksibenzoatas, kofeino rūgštis, 3,4,5,7-tetrahidroksiflavonas, 6,7-dihidroksikumarinas; pagrindinės aminorūgštys (argininas, histidinas, leicinas, izoleicinas, lizinas, tioninas,

fenilalaninas, treoninas, valinas) [46; 110; 157]. Perilių sėklos turtingos riebalinio aliejaus (39-49 proc.), kurio sudėtyje yra oleino (4 proc.), linolo (53 proc.) ir linoleno (23 proc.) rūgščių [4; 33; 59].

Kiti šaltiniai teigia, kad iš perilės sėklų (40% jų masės) išskiriamas aliejus, turintis didelį kiekį nesočiųjų riebalų rūgščių: iš jų 60% yra linolo rūgšties (omega 6), 15-20% α-linoleno rūgšties (omega 3) ir 15% oleino rūgšties [21; 35; 56; 95].

Linolo ir α-linoleno rūgštys yra nepakeičiamosios riebalų rūgštys (EFAs), kurių organizmas nesintetina ir jas būtina gauti su maistu, kaip ir vitaminus (seniau šios rūgštys vadintos vitaminu F). Jos padeda imuninei sistemai kovoti su infekcija, didindamos peroksidų produkciją, yra būtinos fosfolipidų sintezei, yra prostaglandinų ir leukotrienų biosintezės pirmtakai, reikalingos oksidaciniams ir metaboliniams procesams skatinti bei energijai didinti. Nepakeičiamosios riebalų rūgštys, įeinančios į ląstelės struktūrinių lipidų sudėtį (membraniniai fosfolipidai), yra svarbios susidarant mitochondrijų membranoms. Daug jų yra dauginimosi organuose. Trūkstant nepakeičiamųjų riebalų rūgščių, jų vietą fosfolipiduose ir kituose sudėtiniuose membranų lipiduose užima kitos omega 9 eilės polieninės rūgštys. Žmonėms, kurių maiste trūksta nepakeičiamųjų riebalų rūgščių, prasideda dermatitai, sutrinka lipidų pernaša [35; 56; 59].

Viena nepakeičiamoji riebalų rūgštis - α-linoleno, kitaip vadinama omega 3 riebalų rūgštimi, kartu su derivatais priklausanti omega 3 supernesočiųjų riebalų rūgščių šeimai. Be LNA šiai šeimai dar priskiriamos stearidoninė rūgštis (SDA), eikozapenteninė rūgštis (EPA) ir dokozahekseninė rūgštis (DHA). Jų pakankamai turi žuvų taukai bei linų aliejus, tačiau jie dažnai sukelia nepageidaujamus šalutinius poveikius virškinimo sistemai. Tuo tarpu aliejus, gautas iš P. frutescens, yra ne tik turtingas omega 3 nepakeičiamųjų riebalų rūgščių šaltinis, tačiau kartu neturi jokio šalutinio poveikio, yra puikiai pasisavinamas bei toleruojamas. Moksliniai tyrimai patvirtino, jog, vartojant perilės aliejų kaip omega 3 rūgščių šaltinį, sumažėja lipidų koncentracija kraujuje, kartu ir rizika sirgti ateroskleroze bei koronarine širdies liga, širdies infarktu, aritmija, nes užtikrinama normali kardiomiocitų mityba [34; 50; 64; 95]. Be to, sumažėja uždegiminių citokinų, TNF, arachido rūgšties darinių išsiskyrimas, dėl kurių pasireiškia reumatoidiniai artritai, kolitai, daugelis kitų autoimuninių ligų, atitolinamas ląstelių senėjimas [56; 57; 73; 139; 162; 175; 186].

Perilių aliejus efektyvus gydant krešėjimo sutrikimus. Įrodyta, kad jo veikliosios medžiagos stabdo patologinį kraujo krešėjimą kraujagyslėse, trombocitų agregaciją (trombozę), nutukimus ir alergijas. Poveikis nuo aliejaus vartojimo pradžios pasireiškia po kelių savaičių [56; 130].

Nustatyta, kad P. frutescens augaluose susikaupia mažai žmogaus organizmui kenksmingų azoto druskų (127-919 mg/ kg šviežiosios masės). Ypač maži nitratų kiekiai kaupiasi tamsiai raudonais lapais P. frutescens augaluose [105].

Vaistinė žaliava ir jos vartojimas.

Perilės vaistinė žaliava aprašyta kinų farmakopėjoje [160]. Vaistinę žaliavą sudaro augalo antžeminių dalių komponentai: perilės lapai (Perillae folium), skinami ir žaliavai ruošiami žydėjimo laikotarpiu (rugpjūčio mėnesį), ir vaisiai (Perillae semen), ruošiami brendimo laikotarpiu (rugsėjo pabaigoje - spalio pradžioje).

Antžeminė dalis (nuskinti lapai) paskleidžiami plonu sluoksniu, džiovinami gerai vėdinamoje patalpoje, apsaugotoje nuo tiesioginių saulės spindulių, arba džiovykloje 25-30°C temperatūroje.

Perilės vaisiai bręsta skirtingu laiku: visa antžeminė dalis nuimama ir džiovinama pavėsyje arba aktyvios ventiliacijos įrenginiais (oras įšildomas iki 25°C temperatūros). Išdžiuvę vaisiai iškuliami, valomi ir džiovinami [105; 134].

3.4. Perilla frutescens (L.) Britton. FARMAKOLOGINĖS SAVYBĖS

Gana platus Perilla frutescens vartojimas medicinoje. Azijos tautų vaistinių augalų žinovai perilę skirdavo kaip vaistą nuo kosulio ir kvėpavimo sistemos ligų, apsaugoti nuo gripo infekcijos, esant netaisyklingai subalansuotai mitybai. Jau daugelį metų žinoma, jog perilė pasižymi antibakteriniu, antiseptiniu, karščiavimą mažinančiu, spazmolitiniu, antipriepuoliniu, priešastminiu, kosulį mažinančiu, atsikosėjimą lengvinančiu, atstatomuoju bei tonizuojamuoju poveikiu [46; 105; 115; 132; 169].

Pirmosios žinios apie P. frutescens vartojimą medicininiams tikslams pateikiamos vienoje iš Senovės Kinijos medicinos knygų - „Kampo medicina", kur rašoma, kad žolės užpilai vartojami apsinuodijus jūros maistu (žuvimi ir krabais) [158]. Vėliau, VI amžiuje, pastebėta, kad perilių lapų ir sėklų užpilai teigiamai veikia sergant bronchų astma, paralyžiaus atvejais [47; 56; 169]. Daugiau sukaupta žinių apie gydomąjį perilės preparatų poveikį, atsiradus įvairių sutrikimų: protarpiniam karščiavimui, viduriavimui, ascitui, kraujotakos sutrikimų, mėšlungiui, įvairios lokalizacijos uždegimams, neaiškios kilmės skausmams, bičių bei gyvačių įgėlimams. Perilės žolė vartojama peršalimo ligoms (bronchitas, kosulys, sloga) gydyti [132]. Užfiksuota praktinių pastebėjimų ir moksliškai pagrįstų eksperimentinių tyrimų duomenų. Įrodytas antiseptinis, raminamasis, skausmą malšinantis, priešuždegiminis, prakaitavimą skatinantis veikimas. Be to, perilių preparatai stimuliuoja ir reguliuoja

virškinimą, todėl vartojami skrandžio veiklai reguliuoti, taip pat užkietėjus viduriams. Kinijoje perilės stiebai yra tradicinis vaistas nuo rytinio pykinimo (šleikštulio) [33; 47; 95].

Antimikrobinis veikimas. Jau XX a. viduryje nustatyta, kad perilių lapų vandenis užpilas pasižymi detoksikuojančiomis ir dezinfekuojančiomis savybėmis, t. y. tiesioginis bakteriostatinis veikimas. Vėliau dar patikslinta, kad jis veikia prieš auksinį stafilokoką (Staphylococcus aureus), tačiau neveikia gramneigiamų bakterijų. Nustatyta, kad perilių lapų ekstrakto eterinė frakcija stipriai inhibuoja odos grybelių (Trychophyton, Microsporum,

Epidermophyton) augimą ir taip stimuliuoja imuninę sistemą, bet neveikia Saccharomyces ir Candida [57; 73; 118]. Paaiškėjo, kad pagrindinė priešgrybelinė veiklioji medžiaga yra

perilaldehidas [115]. Šių tyrimų duomenys patvirtino kinų liaudies medicinos praktiką žaliais perilių lapais gydyti pirštų vagos trichofitiją [169].

Nustatyta, kad karšto distiliavimo būdu išgautos sudedamosios dalys iš Kalifornijoje auginamų perilių lapų slopina bakterijų ir grybelių augimą, be to, slopina maisto apsinuodijimą sukeliančių gramneigiamų bakterijų (Salmanella choleraesuis) augimą. Eksperimentiniais tyrimais įrodyta, kad perilės lapų ekstraktas apsaugo peles nuo vietinių uždegimų, veikiant arachido rūgštimi, bei leukotrienų išsiskyrimą skatinančiais veiksniais, tačiau yra neveiksmingas esant uždegimui. Eksperimentiškai in vitro ir in vivo nustatyta, kad perilės ekstraktai slopina makrofagų ir labrocitų degranuliaciją ir uždegimo mediatorių: navikų nekrozės faktoriaus, leukotrienų, histamino išsiskyrimą [4; 99; 100; 114; 139; 162; 175].

Nespecifinis desensibilizuojantis veikimas. Tradicinė kinų medicina jau senovėje vartojo P. frutescens ir kitų panašaus veikimo augalų mišinius įvairių alerginių ligų gydymui. XX a. antroje pusėje pastebėta, kad kai kurios alerginio dermatito ir egzemos formos, neįveikiamos Vakarų civilizacijos medicinos priemonių, buvo išgydomos Rytų medicinos augaliniais vaistais, tarp jų ir perilės preparatais [47; 146]. Tradiciškai perilės žolės ekstraktai seniai buvo vartojami bronchų astmos gydymui, be to, kliniškai įrodytas jų slopinamasis poveikis pirmojo tipo hipererginėms reakcijoms [101; 175]. Vėliau įrodyta, kad jie slopina labrocitų degranuliaciją ir histamino išskyrimą [162]. Eksperimentiniais tyrimais in vivo ir in

vitro įrodyta, kad P. frutescens skirtingai veikia imuninės sistemos reguliacijos mechanizmus

[91]. Ypač svarbus poveikis makrofagams, kuomet slopinamas ne tik leukotrienų, bet ir navikų nekrozės faktoriaus išsiskyrimas. Pastarasis yra svarbus alerginių mechanizmų ir uždegimo aktyvacijai [50; 54; 91].

Nustatyta, kad perilių eterinio aliejaus sudėtinės dalys: β - kariofilenas slopina akrilaldehido ir citrinų rūgšties sukeltą alerginį kosulį; 1-mentolis mažina odos niežėjimą ir

vartojamas alerginių odos ligų gydymui [114; 146]. Pastebėtas α-apineno ir β-kariofileno priešuždegiminis veikimas karageninų sukeltai eksperimentinei žiurkės odos edemai, o elimicinas slopina žiurkės odos anafilaksiją ir pirmojo tipo alerginę reakciją. Nurodoma, kad alergijai svarbus yra nesočiųjų riebalų rūgščių disbalansas; α-linoleno rūgšties kiekio padidėjimas gali slopinti leukotrieno LTC4 išsiskyrimą iš granuliocitų ir kartu silpninti uždegimą [54; 101; 141; 148].

Perilės lapų ekstraktas vartojamas alergijai gydyti, taip pat tinka nosies tamponams, odos tvarsčiams, įvairiems kremams bei tepalams. Teigiamas gydymo poveikis pastebimas po kelių dienų, kartais po trijų mėnesių [54; 91].

Remiantis šiais duomenimis, iš perilės pagaminti augalinės kilmės preparatai gali turėti imunosupresinį poveikį alergijų atvejais.

Priešnavikinis veikimas. Augalas yra ypač veiksmingas gydant onkologines ir degeneracines ligas. Perilės aliejus mažina riziką sirgti krūties ir storosios žarnos vėžiu [79; 83; 91; 176]. XX amžiaus pabaigoje Japonijoje padaugėjo žmonių, sergančių onkologinėmis ligomis. Tuo tarpu Korėjoje, ilgiau išlikus senoms tradicijoms, maisto gaminimui dažniau vartojant perilių ir kitų augalinių produktų, mažesnis sergamumas minėtomis ligomis. Manoma, kad perilės eterinis aliejus lėtina piktybinių navikų augimą ir pagreitina jų gydymą. Eksperimentiniais tyrimais nustatyta, kad aliejus slopina dimetilbenzantracenu sukelto žiurkių pieno liaukų naviko, nitrosoureos sukelto storosios žarnos naviko ir metilnitrozoguanidinu sukelto žiurkių storosios žarnos navikų augimą ir plėtimąsi. Tai aiškinama tuo, kad perilių eterinis aliejus sutrikdo arachido rūgšties, kaip TXA2 ir PGE2 kancerogenų pirmtakų išsiskyrimą, o α-linoleno rūgštis, kurios daug randama eteriniame aliejuje, pasižymi priešvėžiniu veikimu [19; 59; 83; 175]. Panašiai veikia ir polisacharidai ar rozmarino rūgštis, gauti iš perilės lapų [86; 119].

Antioksidacinės savybės. Augalo preparatai pasižymi ir stipriomis antioksidacinėmis savybėmis, apsaugo ląsteles ir lėtina jų senėjimo procesus [110; 157]. Perilės lapų ekstraktų antioksidacinį aktyvumą lemia flavonoidai, antocianinai, kavos rūgšties dariniai, rozmarino rūgštis, protokatechinino aldehidas [23; 126; 157].

Kitos savybės. Perilės vaisiuose susikaupia daug baltymų, lipidų, angliavandenių, makroelementų ir mikroelementų (K, Ca, Fe, Zn, Mg ir Mn), kurie yra vertingas maisto šaltinis [14; 95; 169].

Perilės vaisių riebaliniame aliejuje yra nesočiųjų riebalų rūgščių, kurios apsaugo nuo nutukimo, lėtina žiurkių riebalinio audinio augimą, slopindamos lipocitų diferenciacijos fazę. Be to, nesočiosios riebalų rūgštys geriau subalansuoja lipidų santykį, mažina cholesterolio

kiekį kraujyje bei slopina trombocitų agregaciją ir aktyviųjų medžiagų iš jų išsiskyrimą. Tai silpnina aterosklerozės progresavimą ir mažina trombozinių komplikacijų galimybę [79].

Eksperimentiniais tyrimais įrodyta, kad perilių aliejaus turtingas maistas po dviejų žiurkių generacijos kartų turi teigiamą poveikį jų smegenų raidai, o vėliau pagerina jų smegenų funkcijos galimybes. Trečioje kartoje žiurkės geriau atlieka konkrečių veiksmų išmokimo ir vykdymo testus. Jeigu maiste stinga α-linoleno rūgšties, silpnėja nervų sistema, be to, sukelia patologinių pakitimų. Nustatyta, kad žiurkių maiste esant 5 proc. perilės aliejaus, prailgėja žiurkių gyvenimo trukmė 17 proc. [50; 59; 79].

Taigi, dėl savo savybių, Lietuvoje introdukuotos perilės tyrimai atitinka prioritetinę Europos Komisijos ir Lietuvos mokslinių tyrimų ir eksperimentinės plėtros kryptį - „Geros kokybės, saugaus ir ekologiškai švaraus maisto technologijos". Tyrimai atlikti pagal Lietuvos valstybinio mokslo ir studijų fondo remiamo projekto „Augalinės kilmės ekologiški funkciniai ingredientai ir maisto priedai maisto saugai ir kokybei" programą. Šiame darbe apibendrinti perilės lapų ekstrakto savybių tyrimai, siekiant nustatyti maisto priedų ir funkcinių ingredientų veikimą, poveikį imuninei sistemai, didinant organizmo atsparumą.

4. T Y R I M O O B J E K T A S IR M E T O D A I

4.1. Tyrimo objektas – Lietuvoje introdukuotas naujas augalinis vaistų šaltinis -

Perilla frutescens (L.) Britton. ir jo žolės išvalyti sausi ekstraktai, pagaminti iš antžeminės

augalo dalies. Nors šio augalo tėvynė yra Rytų šalys, tačiau kultyvuojamas ir mūsų klimatinės juostos sąlygomis sėkmingai praeina vegetacijos ciklą bei sukaupia veikliąsias medžiagas.

Šio augalo preparatai pasižymi antimikrobiniu, antivirusiniu, priešuždegiminiu, desensibilizuojančiu ir kt.veikimu, be to jie turi įtakos alteraciniams procesams uždegimo židinyje. Jie yra mažiau toksiški už sintetinius analogus, neturi teratogeninių, embriotoksinių bei vietiškai dirginančių savybių [4; 99; 100; 101; 114; 162; 175; 176] .

Siekiant ištirti Lietuvoje išauginto augalo - P. frutescens ekstraktų imunomoduliacinės savybes, buvo naudoti šie laboratoriniai gyvuliukai, gauti iš Lietuvos imunologijos instituto vivariumo:

• Šinšilos veislės 4-6 mėn. triušiai (žolėdžiai),

• baltos BL-57 veislės linijinės laboratorinės pelės (visaėdžiai gyvūnai - jų virškinimo sistema geba įsisavinti augalinės ir gyvulinės kilmės maistą).

Eksperimentams su laboratoriniais gyvūnais gautas „Leidimas mokslo tiriamajam darbui naudoti linijines peles ir triušius“ Nr. 0112, išduotas 2004.05. 05 Lietuvos Respublikos Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos.

Eksperimentiniams gyvuliukams buvo apskaičiuotos optimaliausios Perilla frutescens

(L.) Britton. preparatų dozės, vadovaujantis maisto papildų saugumo rekomendacijomis [98,

143].

Triušiams injekcijoms į raumenis ekstraktų dozė - 0,1 ir 0,01 mg/kg (tyrimai in vivo), skiriant zondu į skrandį buvo po 0,1 mg/kg.

Pelės buvo maitinamos per os vandeniniu P. frutescens ekstraktu po 0,01; 0,1; ir 1,0 mg sauso ekstrakto 1g pelės svoriui, siekiant išaiškinti minimalios, optimalios ir maksimalios preparatų dozių poveikį imuninei sistemai.

Ląstelių kultūrų inkubacijai (tyrimai in vitro) naudotas tirpalas izotoniniame NaCl tirpale, kuriame buvo 50 μl tiriamosios medžiagos.

Dalį šio darbo parėmė Lietuvos valstybinis mokslo ir studijų fondas (sutartis Nr. C-03024). Tyrimai buvo vykdomi pagal mokslo tiriamąjį projektą „Augalinės kilmės funkciniai ingredientai ir maisto priedai saugai ir kokybei“.

Preparatų gamybos technologijos:

Ekstraktai buvo pagaminti KMU Farmacinės chemijos ir farmakognozijos katedroje reperkoliacijos (nenutrūkstamos susmulkintos žaliavos ekstrakcijos) būdu. P. frutescens orasausiai lapai susmulkinami iki 0,1-0,3 cm dalelių ir pasveriamas tikslus jų kiekis. Veikliųjų medžiagų ekstrakcijai buvo naudojama pašildytas išgrynintas vanduo, pašildytas 30 proc. ir 40 proc. etanolis. Perkoliuojama tol, kol žaliava pilnai ekstraguojasi (perkoliatas pasidaro bespalvis). Tuo atveju, kai ekstrakcijai naudojamas išgrynintas vanduo, balastinių medžiagų nusodinimui į 100 ml perkoliato įpilama 5 ml 96 proc. etanolio. Gautos ištraukos paliekamos 3 paras nusistovėti vėsioje vietoje ir filtruojamos. Gauti skysti ekstraktai vakuuminio garinimo aparatu sutirštinami pagal ekstrahuotos žaliavos kiekį santykiu 1:1.

Kad nustatyti sausų medžiagų likutį skystuose ekstraktuose, į plokščiadugnį indą įpilama po 2 ml tiriamojo ekstrakto, sausai išgarinama ant vandens vonios ir džiovinama džiovinimo spintoje 100-105 °C temperatūroje 3 val. Atvėsinama eksikatoriuje virš difosforo pentoksido R ir pasveriama. Rezultatai apskaičiuojami masės procentais arba gramais mililitre.

Vandeninio P. frutescens lapų ekstrakto sausų medžiagų likutis yra 0,32 g/ml (32

proc.).

40 proc. etanolinio P. frutescens ekstrakto – 0,38 g/ml (38 proc.).

II. Liofilizacijos metodu pagamintas P. frutescens lapų ekstraktas.

Vandeninis P. frutescens ekstraktas gaunamas iš sudžiovintos, susmulkintos ir paruoštos žaliavos, liofilizacijos metodu. Žaliava ekstrahuojama purtyklėje (Mylab Platform

Shaker Universal PSU 20) dvikartine karštąja ekstrakcija kambario temperatūroje 2 val. Po to

mišinys filtruojamas Biuchnerio piltuvu ir gautas filtratas liofilizuojamas.

Pagrindinis liofilizacijos principas yra visiškai pašalinti iš produkto drėgmę, paliekant produkto pirminę struktūrą ir likusias sudėtines dalis nepakitusias, vietoj šilumos panaudojimo vykdant tiesioginį ledo išgarinimą. Drėgmės pašalinimui gali būti dvi priežastys: 1. vandens pašalinimas ilgam laikui užkerta kelią produkto gedimui. Produktas genda, kai mikroorganizmai maitinasi produkte esančiomis medžiagomis ir jas skaldo. Be to, bakterijos gali išskirti toksiškus junginius. Kadangi mikroorganizmų augimui reikalingas vanduo, todėl pašalinus vandenį iš produkto, jis negenda. Fermentinėms reakcijomis taip pat reikalingas vanduo, todėl gedimas dėl fermentų poveikio sustabdomas. 2. Liofilizacija labai sumažina produkto masę, nes daugumos maisto produktų didžiąją dalį sudaro vanduo (pvz. daugumos vaisių 80-90 proc.). Dauguma medikamentų greitai suyra vandens ir oro poveikyje, todėl liofilizacija naudojama jų konservavimui. Išdžiovinti produktą labai paprasta.

Pagrindinis vykstantis procesas yra sublimacija – tiesioginis tirpalo perėjimas iš kietos būsenos į dujinę. Tai priklauso nuo temperatūros ir slėgio.

Sausos medžiagos buvo nustatytos perilės filtratą išgarinus džiovinimo spintoje (HS 32A) 100o C temperatūroje. Sausos medžiagos apskaičiuojamos pagal formulę:

S.m. = a – b _{x 100 %} m

kur: a - taros su tiriama medžiaga masė, g (po džiovinimo); b – tuščios taros masė, g;

m – tiriamos medžiagos (filtrato) masė, g.

Atsveriama 30 g perilės ir supilama į 500 ml. talpos konusinę kolbą, užpilama 300ml. verdančio distiliuoto vandens. Purtyklėje purtoma 1 val., nufiltruojama Biuchnerio piltuvu ir ant liekanų užpilama 200 ml verdančio vandens. Dar kartą purtoma purtyklėje 1 val. ir vėl nufiltruojama. Gautas abiejų purtymų filtratas liofilizuojamas liofilizatoriuje (MAXI dry lyo) iki sausos medžiagos apie parą. Sausi ekstrakto milteliai pakuojami į absoliučiai sausą bei drėgmei nelaidžią tarą ir laikomi šaldiklyje iki panaudojimo.

P. frutescens preparatų platus biologinio veikimo spektras gali būti aiškinamas

imuninės sistemos veiksnių stimuliacija, kurią eksperimentiškai įrodyti naudojami tam tikri imunologiniai ir klinikiniai laboratoriniai metodai [2; 44; 187; 190; 193]. Kraujo rodiklių tyrimai atlikti pagal laboratoriniams gyvuliukams modifikuotus klinikinius laboratorinius metodus [68; 89].

4.2.1. Periferinio kraujo leukocitų ir limfocitų skaičiaus kitimo tyrimas

Leukocitų skaičius eksperimentinių gyvuliukų periferiniame kraujyje nustatomas ir vertinamas standartiniu laboratoriniu metodu. Triušių kraujas paimtas iš ausies marginalinės venos (v. auricularis ext.), pelių kraujas imamas iš aortos.

Specialios melanželės (tipas - TY 64-2-51-75) pagalba kraujas skiedžiamas 3% acto rūgšties tirpalu (GOST 61-75, х. ч.) arba Tiurko tirpalu 1:20 santykiu. Praskiestu krauju užpildoma Goriajevo kamera (tipas TY 64-1-816-77, modelis 851) ar kito tipo kamera ląstelėms skaičiuoti. Ji dedama ant mikroskopo stalelio ir leukocitai skaičiuojami kameros tinklelio didžiuosiuose 100 kvadratėliuose (objektyvas 8x, okuliaras 10x arba 15x).

Bendras leukocitų kiekis apskaičiuojamas pagal formulę: X = a × 250 × 20 (10) ; 100

kur: x - leukocitų kiekis 1 mm3;

a - suskaičiuotų leukocitų suma 100-te kvadratėlių; 250 - vieno kvadratėlio tūris 1/250 mm 3;

20 (10) - kraujo praskiedimas melanželėje; 100 - kameros kvadratų skaičius.

Limfocitų kiekis nustatomas pagal modifikuotas standartines laboratorinių tyrimų metodikas Shilling′o metodu skaičiuojant leukocitinę formulę, vadinamą leukograma. Leukograma - tai leukocitų formų santykis, išreikštas procentais [68; 89].

Periferinio kraujo lašas paskleidžiamas ant objektinio stiklelio, išdžiovinamas ore, 10-20 min. fiksuojamas Nikiforovo mišiniu (etilo spirito ir eterio mišinys santykiu 1:1) ar kitu fiksažu, po to dažomas specialioje kiuvetėje vasarą 15-20 min., žiemą 30-40 min. Dažoma Ramanovskio-Gimzos dažais (Azur-eosin-methylene blue solution). Nudažius Diagnostica

MERCK KGaA firmos Gimzos dažais, jų perteklius nuplaunamas, išdžiovinamas ir

skaičiuojamos leukocitų formos mikroskopu, imercine sistema (objektyvas 10x, okuliaras 90x). Suskaičiuojamas limfocitų kiekis (procentais) iš 100 ar 200 visų leukocitų formų.

Eksperimentai atlikti su baltomis BL-57 veislės linijinėmis pelėmis (grupės po 6 gyvūnėlius). Pelės buvo girdytos įvairių koncentracijų P. frutescens sauso ekstrakto, pagaminto KTU, vandeniniu tirpalu. Girdytos 2 savaitės per os po 0,01; 0,1; 1,0 mg sauso ekstrakto /1 g pelės svorio. Organų ląstelių skaičiaus kitimai buvo tirti kas savaitę pagal sekančią metodiką.

Čiobrialiaukės ir blužnies ląstelių skaičiaus kitimas nustatomas pagal imunologijos metodus [2; 109].

Pelėms atlikus distorziją, atpreparuojama čiobrialiaukė ir išėmus pasveriama. Gautą svorio mg skaičių padalinus iš 25, gaunamas praskiedimui reikalingo Henkso tirpalo kiekis ml. Čiobrialiaukė susmulkinama lengvai trinant, gauta masė filtruojama, užpilama reikiamu Henkso tirpalo kiekiu ir centrifuguojama 7-10 min prie 1500 aps/min. Po to supernatantas nusiurbiamas ir dar kartą užpilama Henkso tirpalu ir resuspenduojama. Ląstelių suspensija melanželės pagalba skiedžiama Tiurko tirpalu santykiu 1:20 ir timocitų kiekis skaičiuojamas Goriajevo kameroje. Palyginti kontrolinės grupės pelių, kurios girdytos izotoniniu NaCl tirpalu ir bandomosios grupės pelių, kurios girdytos Perilla frutescens (L.) Britton. ekstrakto tirpalu po 0,1 mg/kg, timocitų skaičiaus kitimai.

Splenocitai išskiriami analogišku būdu kaip ir timocitai. Po distorzijos išimama pelės blužnis, pasveriama. Gautas svorio mg skaičius dalinamas iš 25 - gaunamas praskiedimui reikalingo Henkso tirpalo kiekis ml. Blužnis susmulkinama, užpilama reikiamu Henkso tirpalo kiekiu ir centrifuguojama 7-10 min prie 1500 aps/min. Nusiurbus supernatantą, dar kartą splenocitai užpilami Henkso tirpalu ir resuspenduoti. Splenocitų kiekis suskaičiuojamas Goriajevo kameroje. Įvertinti kontrolinės ir bandomųjų pelių grupių, splenocitų skaičiaus kitimai kas savaitę.

4.2.3. Fagocitozės aktyvumo tyrimas, veikiant Perilla frutescens (L.)Britton. ekstraktais. Tirtas krūminės perilės, išaugintos VDU Kauno botanikos sode, preparatų poveikis fagocitozės aktyvumui. Iš antžeminės dalies buvo pagaminti įvairių koncentracijų skysti bei sausi perilės lapų ekstraktai.

I. Pirmame tyrimų etape eksperimentai buvo atlikti in vitro.

Triušių periferinio kraujo leukocitų ląstelių kultūra buvo inkubuota su perilės ekstrakto tirpalu izotoniniame NaCl tirpale, kuriame buvo 50 μl tiriamosios medžiagos.

Tyrimams vartotas perilės preparatas, pagamintas Kauno technologijos universiteto, Maisto produktų technologijos katedroje.

II. Antrame tyrimų etape in vivo buvo tirtas P. frutescens preparatų poveikis imuninei sistemai, vartojant juos injekcijomis.

Perilės preparatai pagaminti Kauno medicinos universiteto Farmacinės chemijos ir farmakognozijos katedroje. Reperkoliacijos būdu (gamybos technologija 21 p.) pagamintai du preparatai:

1) vandeninis perilės lapų ekstraktas, kurio sausų medžiagų kiekis yra 0,32 g/ml, t. y. 32 proc. sterilus tirpalas;

2) 40° spiritinio perilės lapų ekstrakto vandeninis tirpalas, kuriame sausų medžiagų kiekis yra 0,38 g/ml, t.y. 38 proc. sterilus tirpalas.

Pagal literatūros duomenis bei ankstesnius tyrimus in vivo, apskaičiuota optimali ekstraktų dozė injekcijoms eksperimentiniams triušiams – po 0,1 ml/kg 20 proc. ekstrakto, kuriame sausos medžiagos vandeniniame perilės lapų ekstrakte yra 0,32 g/ml., o spiritiniame ekstrakte - 0,38 g/ml., tirpalai

Tyrimui pasirinktos dvi panašaus svorio (po 2,8-3,2 kg) ir vienodo amžiaus (6 mėn.) Šinšilų veislės triušių grupės. Prieš tyrimus jiems buvo atliktas FA nustatymas (kontrolė).

Pirmos grupės triušiams (n=6) buvo švirkštas į raumenis vandeninio perilės ekstrakto 32 proc. tirpalas, o antrai triušių grupei (n=6) - spiritinio perilės ekstrakto 38 proc. tirpalas po 0,1 ml/kg.

Triušių periferinio kraujo imunologinių rodiklių tyrimai buvo atlikti prieš eksperimentus (kontrolė) ir po jų (po vieno sušvirkštimo po 24 val., po trijų sušvirkštimų po 72 val. ir po savaitės injekcijų).

III. Trečiame eksperimentų etape buvo tirtas sauso P. frutescens ekstrakto, pagaminto KTU Maisto produktų technologijos katedroje, poveikis imuninei sistemai.

Dvi triušių grupės buvo 4 savaites kas dieną zondu girdomos po 2 ml sauso ekstrakto tirpalo. Viena triušių grupė girdoma sauso perilės ekstrakto tirpalu, kuriame veikliųjų medžiagų po 0,01 g/kg, kita – tirpalu po 0,1 g/kg veikliųjų medžiagų.

Triušių fagocitozės aktyvumas tirtas prieš eksperimentus ir po to kas savaitę.

Moksliniai eksperimentai buvo atliekami su 6 mėn. amžiaus Šinšilos veislės triušiais (leidimas naudoti laboratorinius gyvūnus mokslo tiriamajam darbui Nr. 0112, išduotas 2004 05 05 LR Valstybinės maisto ir veterinarijos tarnybos) priede.

FA tyrimo metodika. Nespecifinis ląstelinis imunitetas vertinamas pagal leukocitų funkcijos kokybinę būklę, kurią apsprendžia fagocitozės aktyvumas (FA). Jis tirtas modifikuota metodika pagal I lygio imunologinių testų kompleksą, parodantį triušių

periferinio kraujo neutrofilų sugebėjimą fagocituoti sugebėjimą fagocituoti polistireno latekso daleles, kurių dydis 0,8 μm [193]. FA tyrimo etapai:

I. Leukocitų suspensijos paruošimas. Tyrimui imta po 2 ml periferinio kraujo iš triušių ausų venų į mėgintuvėlius su antikoaguliantu (heparino tirpalas 50 VV/ml fiziologiniame tirpale). Triušių kraujas sumaišomas su antikoaguliantu santykiu 10:1 ir ruošiama leukocitų suspensija: mišinys sumaišomas su 3 proc. želatinos tirpalu ir inkubuojama termostate +370C 30 min. Po to ląstelės atskiriamos Henkso tirpalu centrifuguojant 10 min (1000 aps/min) ir nupilant viršutinį skystį kelis kartus. Taip paruošta leukocitų suspensija.

II. Latekso suspensijos paruošimas. Mikropipete imama 5 μl koncentruotos polistireno latekso suspensijos ir kelis kartus“atplaunama” po 10 ml fiziologinio tirpalo, centrifuguojant po 10 min (1500 aps/min). Viršutinis skysčio sluoksnis nupilamas. Paruoštoje suspensijoje likęs latekso dalelių kiekis turi būti 50 mln./ml koncentracijos, kuri patikrinama skaičiuojant Goriajevo kameroje.

III. Fagocitozės reakcija. Ji atliekama specialioje 96 duobučių mikroplokštelėje, skirtoje imunologinėms reakcijoms. Į kiekvieną mikroplokštelės duobutę sulašinama leukocitų ir latekso dalelių suspensijų po 50 μl ir inkubuojama 30 min. Po to 10 min. kambario temperatūroje dažoma Žadorožnio-Dozmorovo leukocitų dažais, kurie sustabdo fagocitozės reakciją, nudažo leukocitų branduolius ir lizuoja eritrocitus.

FA ir Fi skaičiuoti Goriajevo kameroje. FA -tai latekso daleles fagocitavusių leukocitų procentas iš visų suskaičiuotų neutrofilų.

Fi - parodo kiek latekso dalelių fagocitavo vienas neutrofilas ir apskaičiuojamas pagal formulę: Fi = a⋅1,5 + b⋅3,5 + c⋅5 ;

100

kur a - ląstelių, fagocitavusių 1-2 latekso daleles skaičius; b - ląstelių, fagocitavusių 3-4 latekso daleles skaičius;

c - ląstelių, fagocitavusių 5 ir daugiau latekso dalelių skaičius.

Šiame darbe kiekybinis fagocitinis aktyvumas buvo analizuojamas apskaičiuojant (Fi) indeksą [193]. Be to, dar siūlomi Hamburgero fagocitų procento (leukocitų, įsiurbusių dalelytes santykis su bendru jų skaičiumi), fagocitozės Raito skaičiaus (vidutinis fagocituotų dalelių skaičius vienam fagocitui) tyrimai. Latekso, zimozano ar kitų dalelių fagocitozės nustatymui gali būti naudojamas liuminometras [191].

Eksperimentuojant in vivo su žolėdžiais gyvūnais (triušiais) ir visaėdžiais gyvūnais (pelėmis), buvo tiriamas perilės poveikis eozinofilų kiekiui jų periferiniame kraujyje. Eozinofilų kiekio pokyčiai, veikiant eksperimentinius gyvuliukus P. frutescens preparatais, tirti kraujo leukogramų pagalba, Shiling’o metodu pagal klinikinių laboratorinių tyrimų metodiką [68; 193]. Paruošus standartinį kraujo tepinėlį, mikroskopo imersine sistema skaičiuojamas eozinofilų kiekis (proc.) iš visų 100 leukocitų formų.

I. Eksperimentai buvo atlikti su laboratorinėmis pelėmis. Pirma pelių grupė – intaktinė, girdyta destiliuotu vandeniu, kitos pelių grupės buvo girdytos P.

frutescens vandeniniu sauso ekstrakto, pagaminto Kauno technologijos

universiteto, tirpalu. Girdyta per os 4 savaitės po 0,1 mg sauso ekstrakto /1 g pelės svorio. Eozinofilų kiekio periferiniame kraujyje kitimai buvo tirti kas savaitę.

II. Antrame tyrimų etape in vivo buvo tirtas P. frutescens preparatų poveikis imuninei sistemai, vartojant juos injekcijomis Šinšilų veislės triušiams. Perilės preparatai, pagaminti Kauno medicinos universiteto Farmacinės chemijos ir farmakognozijos katedroje. 1 triušių grupei į raumenis švirkštas vandeninis perilės lapų ekstraktas, kurio sausų medžiagų kiekis yra 0,32 g/ml, t. y. 32 proc. sterilus tirpalas; 2 triušių grupei - 40° spiritinio perilės lapų ekstrakto vandeninis tirpalas, kuriame sausų medžiagų kiekis yra 0,38 g/ml, t.y. 38 proc. sterilus tirpalas po 0,1 ml/kg. Tyrimo grupių triušių svoris po 2,8-3,2 kg.

Triušių periferinio kraujo eozinofilų kiekio tyrimai atlikti prieš eksperimentus (kontrolė) ir po vieno sušvirkštimo po 24 val., po trijų sušvirkštimų po 72 val. ir po savaitės injekcijų.

III Trečiame eksperimentų etape buvo tirtas sauso P. frutescens ekstrakto, pagaminto KTU Maisto produktų technologijos katedroje, poveikis imuninei sistemai.

Dvi triušių grupės 4 savaites kas dieną buvo zondu girdomos po 2 ml sauso ekstrakto tirpalo. Viena triušių grupė girdoma sauso perilės ekstrakto tirpalu, kuriame veikliųjų medžiagų po 0,01 g/kg, kita – tirpalu po 0,1 g/kg veikliųjų medžiagų.

Triušių eozinofilų kiekis nustatytas prieš eksperimentus (kontrolė) ir po krūminės perilės ekstraktų vartojimo kas savaitę.

Tirti krūminės perilės žolės, išaugintos Vytauto Didžiojo universiteto Kauno botanikos sode, vandeninis bei spiritiniai ekstraktai, paruošti Kauno medicinos universiteto Farmacinės chemijos ir farmakognozijos katedroje. Sausi perilės lapai buvo susmulkinti 0,1- 0,3 сm. dydžio ir ekstraguojami distiliuotu vandeniu arba 30о ir 40о etanoliu. Biologiškai aktyvūs junginiai gauti ekstraguojant žolę perkoliacijos metodu. Ekstraguojant destiliuotu vandeniu, balastinės medžiagos buvo nusodinamos po 5 ml. 95о etanolio/100 ml. perkoliatui. Gautas ekstraktas paliekamas 3 paras vėsioje vietoje, po to filtruojamas. Skystas ekstraktas vakuuminės džiovyklos pagalba koncentruojamas iki žaliavos ir tirpiklio konsistencijos santykiu 1:1.

Kauno medicinos universiteto Mikrobiologijos katedrose ištirti ekstraktų poveikiai kai kurioms etaloninėms bakterijų ir grybelių kultūroms. Tirti perilės vandeninio ir spiritinio ekstraktų poveikiai klinikinėms bakterijų padermėms pagal mikrobiologinius tyrimo metodus [120; 183; 194].

Tirtos etaloninių mikroorganizmų padermės: Proteus mirabilis ATCC 12459,

Staphylococcus aureus ATCC 25923, Bacillus cereus ATCC 8035, Enterococcus faecalis

ATCC 79818, Klebsiella pneumoniae ATCC 33499, Candida albicans ATCC 60193,

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27859, Escherichia coli

β

β

Ir klinikinių bakterijų padermės: Staphylococcus aureus ATCC 25399, Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27859, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter spp.

1 lentelė. Etaloninės ir klinikinės mikroorganizmų padermės.

Etaloninės mikroorganizmų kultūros Klinikinės bakterijų padermės (n = 25)

Staphylococcus aureus ATCC 25923 Escherichia coli β-lac (+) ATCC 35218

Escherichia coli β-lac (-) ATCC 25922

Proteus mirabilis ATCC 12459

Pseudomonas aeruginosa ATCC 27859 Bacillus cereus ATCC 8035

Bacillus subtilis ATCC 6623 Candida albicans ATCC 60193

Gramteigiamosios bakterijos:

Staphylococcus aureus ATCC 25399

Gramneigiamosios bakterijos:

Escherichia coli

Pseudomonaas aeruginosa Klebsiella pneumoniae Acinetobacter spp.

Abi mikroorganizmų grupės auginamos standartinėse BBL (Becton Dickinson and Company) maitinimo terpėse. Antimikrobinis veikimas prieš stafilokokus, ešerichijas, pseudomonas ir sporines bakterijas nustatytas sojos triptazės agaro (Mueller Hinton Broth), o prieš Candida albicans – Saburo agaro (Sabourand Liquid Medium) terpėse. Pasėliai Mueller

Hinton Broth terpėje kultyvuoti +37°C temperatūroje 24 val.(1 parą), o Sabourand Liquid Medium terpėje - +20-25°C temperatūroje 72 val. (3 paras). Išaugintos kultūros praplaunamos steriliu 0,9% natrio chlorido tirpalu ir paruošiamos standartizuotos jų suspensijos (0,5 Mc Farland). Į kiekvieną sterilų mėgintuvėlį su terpe pilama po 3 ml P. frutescens ekstrakto, kurio serijinis praskiedimas maitinimoje skystoje bulijono terpėje buvo nuo 16,5 % iki 1,18%, ir buvo sėjamas standartinės mikroorganizmų kiekis.

Įvertinus mikroorganizmų augimą mėgintuvėlių eilėje, buvo nustatytas P. frutescens preparatų įvairių koncentracijų mikrobocidinis (jei mikroorganizmai terpėje neauga) ar mikrobostatinis veikimo minėtiems mikroorganizmams pobūdis, jei sėjant iš mėgintuvėlių be mikroorganizmų augimo požymių į analogiškas standžias Mueller - Hinton Agar (Broth, BBL, Cockkeysville, USA) ir Sabourand Agar terpes, mikroorganizmų augimas slopinamas [183].

4.2.6. Organų morfologinių pokyčių tyrimas.

Kontrolinės ir tiriamųjų grupių triušiai numarinti oro embolijos pagalba. Makroskopiškai įvertinta imuninių organų – užkrūčio liaukos, blužnies ir parenchiminių organų – kepenų, inkstų, antinksčių, širdies ir plaučių forma, dydis, masė ir jų pjūviai.

Histologiniam tyrimui paimti minėtų organų gabaliukai ir fiksuoti 10% neutraliame formalino skiedinyje. Po fiksacijos organų gabaliukus įlieti į parafiną ir rotaciniu mikrotomu padaryti 5 µm pjūviai, kurie nudažyti klasikine hematoksilino ir lozino (H+E) metodika. Nudažytus histologinius preparatus mikroskopavome ir vertinome šviesiniu mikroskopu įvairiais padidinimais iki 400 kartų. Visi histologiniai preparatai padaryti KMU kardiologijos instituto kardialinės patologijos laboratorijoje, jų vaizdus konsultavo licenzijuoti patologai.

5. S T A T I S T I N Ė R E Z U L T A T Ų A N A L I Z Ė

Statistinė duomenų analizė atlikta standartiniais programinės įrangos paketais: „Statistika 6.0“, „Excel 2000“ [Starkus B, Pasmokytė A. 2003] bei statistine programa „SPSS 12,0 Viewer“. Rezultatus vertinant remtasi bandymų statistinio patikimumo p reikšmėmis. Dydžiams vertinti buvo taikytos šios statistinės charakteristikos: vidurkis (x), standartinis nuokrypis (α). Eksperimentų duomenų vidurkių reikšmės nustatytos su ± standartiniu

nukrypimu. Dviejų priklausomų imčių grupių vidurkių skirtumai buvo lyginti naudojant Stjudent’o (t) kriterijų. Bandomųjų ir kontrolinių Mažų imčių reikšmių skirtumai tarp duomenų vidurkių buvo įvertinti naudojant „Mann-Whitney U“ testą. Statistinė duomenų analizė ir apdorojimas atlikti “Windows” aplinkoje, remiantis bandymų statistinio patikimumo p reikšmėmis. Rezultatai laikomi statistiškai patikimi, jei paklaidų tikimybė p< 0,05 [184].

6. T Y R I M Ų R E Z U L T A T A I

Eksperimentų su laboratoriniais gyvūnais in vivo metu tirtas P. frutescens poveikis imuninės sistemos ląsteliniams faktoriams: leukocitų, limfocitų skaičiaus kitimui.

I etapo tyrimų duomenys rodo, kad po P. frutescens ekstraktų injekcijų triušiams (po 0,1 ml/kg kūno masės), periferinio kraujo leukocitų skaičius ir limfocitų proc. statistiškai reikšmingai padidėjo jau po 3 parų, lyginant su kontrole (2 lentelė). Ypač padidėjęs triušių bendras leukocitų skaičius nuo 7,08 ± 0,29⋅ 109/l (kontrolėje) iki 9,82 ± 0,58 (I grupės) ir 9,79 ± 1,64 ⋅ 109/l (II grupės) po 7 dienų injekcijų (p<0,001).

2 lentelė. Triušių periferinio kraujo leukocitų kiekio ir jų formų proc. leukogramoje kitimai po Perilla frutescens (L.) Britton. ekstraktų injekcijų (eksperimentai in vivo) Kraujo tyrimas Triušių Kontrolė prieš I gr. Po 24 val. II gr. Po 24 val. I gr. Po 72 val. II gr. Po 72 val. I gr. Po 1 sav. II gr. Po 1 sav. Leukocitai (x 109/l) 7,083 ± 0,29 7,900 ± 1,45 6,633 ± 0,96 9,060 ± 1,11 7,960 ± 1,11 9,820 ± 0,58 9,790 ± 1,64 p= 0, 039 0,391 0,006 0,016 0,001 0,009 Bazofilai - - - -

(%) Eozinofilai (proc.) p= 2,33 ± 1,12 1,50 ± 0,68 0,023 2,03 ± 0,73 0,628 1,67 ± 0,84 0,036 2,00 ± 1,03 0,670 1,17 ± 0,95 0,014 1,98 ± 1,05 0,067 Mielocitai (proc.) - - - - Lazdeliniai (proc.) p= 0,33 ± 0,04 0,17 ± 0,03 0,523 0,67 ± 0,10 0,847 0,67 ± 0,13 0,673 0,83 ± 0,11 0,702 0,67 ± 0,10 0,847 0,83 ± 0,09 0,465 Segmentuoti (proc.) p= 22,67 ± 4,22 29,33 ± 5,05 0,070 29,17 ± 7,79 0,063 32,50 ± 6,51 0,030 31,17 7,11 0,067 33,50 ± 2,52 0,001 25,50 ± 3,30 0,031 Limfocitai (proc.) p= 54,00 ± 6,00 66,50 ± 5,23 0,035 63,67 ± 7,53 0,059 63,17 ± 7,03 0,065 63,67 ± 7,76 0,049 65,67 ± 3,57 0,033 69,83 ± 2,99 0,009 Monocitai (proc.) p= 1,17 ± 0,06 1,67 ± 0,07 0,337 1,67 ± 0,07 0,337 1,33 ± 0,42 0,715 2,06 ± 0,07 0,127 0,83 ± 0,03 0,338 1,17 ± 0,06 1,00 n 12 6 6 6 6 6 6

I grupė - po vandeninio perilės ekstrakto 32 proc. tirpalo injekcijų triušiams. II grupė - po spiritinio perilės ekstrakto 38 proc. tirpalo injekcijų triušiams. Limfocitų kontrolėje buvo rasta 54,0 ± 6,0 proc., o po 7 dienų jų kiekis statistiškai reikšmingai padidėjo iki 63,67 ± 3,57 proc. (I grupės) ir 69,83± 2,99 proc. (II grupės).

Triušių leukocitų ir jų formų pokyčiai po savaitės injekcijų pavaizduoti grafiškai 3 pav. Abiejų triušių grupių, nepaisant skirtingų rūšių perilės ekstraktų injekcijų, rezultatai panašūs, leukocitų skaičius dėsningai didėja priklausomai nuo vartojimo laiko.

Limfocitų skaičius padidėjo jau po vienos krūminės perilės ekstrakto injekcijos abiejų grupių triušių, ypač statistiškai reikšmingai padidėjo II grupės triušių po 7 injekcijų iki 69,83 ± 2,99, kai kontrolėje buvo 54,00 ± 6,00 proc.

Periferinio kraujo eozinofilų kiekis pakito nedėsningai. Jų rezultatai detaliau aptarti 6.4. skyriuje.

Kitų leukocitų formų (lazdelinių, segmentuotų ir monocitų) kiekis pakito statistiškai nereikšmingai, todėl nustatyta, kad krūminės perilės preparatų vartojimas įtakos jiems neturi.

Leukocitai ±0,96 ±1,45 ±0,29 ±1,11 ±1,11*±0,58* ±1,64* 0 2 4 6 8 10 12 Triušių kontrolė I gr. II gr. x109_/l

po 24 val po 72 val po 1 sav

I grupė - po vandeninio perilės ekstrakto 32 proc. tirpalo injekcijų triušiams. II grupė - po spiritinio perilės ekstrakto 38 proc. tirpalo injekcijų triušiams.

3 pav. Triušių periferinio kraujo leukocitų kiekio kitimai po Perilla frutescens (L.) Britton. ekstraktų injekcijų (0,1 ml/kg)

Limfocitai ±7,53* ±5,23* ±6,00 ±7,76* ±7,03*±3,57* ±2,99* 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Triušių kontrolė I gr. II gr. %

po 24 val po 72 val po 1 sav

I grupė - po vandeninio perilės ekstrakto 32 proc. tirpalo injekcijų triušiam s. II grupė - po spiritinio perilės ekstrakto 38 proc. tirpalo injekcijų triušiam s.

4 pav. Triušių periferinio kraujo limfocitų kiekio (proc.) leukogramoje kitimai po Perilla frutescens (L.) Britton. ekstraktų injekcijų (0,1 ml/kg)

Eozinofilai ±1,12 ±0,68 ±0,73±1,03 ±0,84 ±1,03 ±0,95 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Triušių kontrolė I gr. II gr. %

po 24 val po 72 val po 1 sav

I grupė - po vandeninio perilės ekstrakto 32 proc. tirpalo injekcijų triušiams. II grupė - po spiritinio perilės ekstrakto 38 proc. tirpalo injekcijų triušiams.

5 pav. Triušių periferinio kraujo eozinofilų kiekio (proc.) leukogramoje kitimai po Perilla frutescens (L.) Britton. ekstraktų injekcijų (0,1 ml/kg)

Lazdeliniai ±0,10 ±0,03 ±0,04 ±0,11 ±0,13 ±0,09 ±0,10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Triušių kontrolė I gr. II gr. %

po 24 val po 72 val po 1 sav

I grupė - po vandeninio perilės ekstrakto 32 proc. tirpalo injekcijų triušiams. II grupė - po spiritinio perilės ekstrakto 38 proc. tirpalo injekcijų triušiams.

6 pav. Triušių periferinio kraujo lazdelinių leukocitų kiekio (proc.) leukogramoje kitimai po Perilla frutescens (L.) Britton. ekstraktų injekcijų (0,1 ml/kg)