PUPINIŲ AUGALŲ (FABACEAE L.), JŲ BRANDOS TARPSNIO IR AUGALO DALIŲ ANTIMIKROBINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS

MEDICINOS AKADEMIJA FARMACIJOS FAKULTETAS

MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTAS

JUSTINA KRUKONYTĖ

PUPINIŲ AUGALŲ (FABACEAE L.),

JŲ BRANDOS TARPSNIO IR AUGALO DALIŲ

ANTIMIKROBINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Darbo vadovas prof. dr. Alvydas Pavilonis

Darbo konsultantas prof. dr. Hiliaras Rodovičius

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA

FARMACIJOS FAKULTETAS

MIKROBIOLOGIJOS IR VIRUSOLOGIJOS INSTITUTAS

TVIRTINU:

Farmacijos fakulteto dekanė prof. dr. Ramunė Morkūnienė

PUPINIŲ AUGALŲ (FABACEAE L.),

JŲ BRANDOS TARPSNIO IR AUGALO DALIŲ

ANTIMIKROBINIŲ SAVYBIŲ TYRIMAS

Magistro baigiamasis darbas

Konsultantas Darbo vadovas

Prof. dr. Hiliaras Rodovičius Prof. dr. Alvydas Pavilonis

Data Data

Recenzentė Darbą atliko

Doc. dr. Loreta Kubilienė Magistrantė Justina Krukonytė

Data Data

TURINYS

Antimikrobinės medžiagos ir antimikrobinis atsparumas ... 13

Pupinių augalų apibūdinimas ... 15

Raudonojo dobilo (Trifolium pratense L.) ir Šilinio dobilo (Trifolium medium L.) bendroji charakteristika ... 15

Mėlynžiedės liucernos (Medicago Sativa L.) ir Apyninės liucernos (Medicago lupulina L.) bendroji charakteristika ... 17

Sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia L.) bendroji charakteristika ... 19

. Saldžialapės kulkšnės (A. glycyphyllos L.) ir Ilguolinės kulkšnės (A. cicer L.) bendroji charakteristika ... 20

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS... 22

2.1. Tyrimo objektai ... 22

2.2. Meterologinės sąlygos žaliavų auginimo metu ... 23

2.3. Ekstraktų paruošimas ... 23

2.4. Tirštų ekstraktų antimikrobinio aktyvumo tyrimas ... 24

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS ... 27

3.1. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį ... 27

3.2.Mėlynžiedės liucernos (Medicago sativa L.) ir Sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį bei augalo dalį ... 37

3.3. Raudonojo dobilo, Šilinio dobilo, Mėlynžiedės liucernos, Apyninės Liucernos, Sėjamojo esparceto ir Saldžialapės kulkšnės sėklų antimikrobinio aktyvumo įvertinimas ... 40

4. IŠVADOS ... 48

5. PRAKTINIAI PATARIMAI ... 49

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 50

SANTRAUKA

Pupinių augalų (Fabaceae L.), jų brandos tarpsnio ir augalo dalių antimikrobinių savybių tyrimas. J. Krukonytė. Magistro baigiamasis darbas. Mokslinis vadovas prof. dr. Alvydas Pavilonis. Darbo mokslinis konsultantas prof. dr. Hiliaras Rodovičius. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto. Farmacijos fakulteto. Mikrobiologijos ir virusologijos institutas. Kaunas 2018.

Tyrimo objektas. Daugiamečių pupinių šeimos (Fabaceae L.) augalų: raudonojo dobilo (T.pratense L.) skirtingų augalo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnos, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių), šilinio dobilo (T.medium L.), mėlynžiedės liucernos (M.sativa L.), apyninės liucernos (M. lupulina L.), saldžialapės kulkšnės (A.glycyphyllos L.), ilguolinės kulkšnės (A.cicer L.) ir sėjamo esparceto

(O.viciifolia Scop.) žaliavos.

Tikslas. Ištirti Lietuvoje augančių pupinių (Fabaceae L.) augalų šeimos antimikrobinį aktyvumą, atsižvelgiant į skirtingus brandos etapus bei skirtingas augalų dalis.

Uždaviniai:

- Nustatyti ir palyginti Raudonojo dobilo veislių ir Šilinio dobilo augalų brandos tarpsnių (krūmijimosi, žydėjimo) bei augalo dalių (lapų, stiebų, žiedų) antimikrobinį aktyvumą;

- Nustatyti ir įvertinti Mėlynžiedės liucernos ir Sėjamojo esparceto augalų brandos tarpsnių (krūmijimosi, žydėjimo) bei augalo dalių (lapų, stiebų, žiedų) antimikrobinį aktyvumą;

- Nustatyti ir palyginti Raudonojo dobilo, Šilinio dobilo, Mėlynžiedės liucernos, Apyninės Liucernos, Sėjamojo esparceto ir Saldžialapės kulkšnės sėklų antimikrobinį aktyvumą;

- Remiantis tyrimų duomenimis palyginti ir atrinkti perspektyviausią pupinių augalų šeimos – lyderį – tolimesniems mikrobiologijos tyrimų vystymo etapams.

Tyrimo metodas. Antimikrobinis aktyvumas nustatytas, mikrobiologiškai in vitro, difuzijos į standų mitybinį agarą metodu (CLSI, M07-A9, 2012). Antimikrobinis aktyvumas nustatytas 9 etaloninių, skirtingas biologines savybes turinčias, bakterijų rūšių (S.aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228, E.faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 13883, P.aeruginosa ATCC 27853, P.vulgaris ATCC 8427, B.subtilis ATCC 6633, B.cereus ATCC 11778) ir C.albicans ATCC 10231 grybelio atžvilgiu. Antimikrobinis aktyvumas vertintas nustatant mažiausiąją tirto ekstrakto koncentraciją (mg/ml), kuri slopina etaloninių mikroorganizmų augimą.

Tyrimo rezultatai. Daugiamečių pupinių augalų šeimos tirtų atstovų minimali mažiausia slopinanti koncentracija – 3,594 mg/ml, maksimali nustatyta MSK – 200,833 mg/ml. Antimikrobinis aktyvumas labiau pasireiškia pavienėse augalo dalyse. Aktyviausiai veikianti antimikrobiškai pupinių augalų dalis – žiedai, kiek silpniau veikia stiebai bei lapai. Jautriausias mikroorganizmas Pupinių augalų šeimos atstovams – S.cereus. R. dobilo veislių bei Š. dobilo antimikrobinis veikimas S.cereus buvo stipresnis krūmijimosi tarpsnio metu nei žydėjimo, slopinančioji koncentracija lyginant kiekvieno augalo brandos

tarpsnius skiriasi vidutiniškai 1,78 karto. Tiriant R. dobilo veisles reikšmingų antimikrobinio aktyvumo skirtumų tarp veislių nepastebėta. Aktyviausias antimikrobiškai veikiantis sėklų ekstraktas – S.esparceto (16,461 mg/ml - 55,555 mg/ml).

Išvados. Pupinių augalų šeimos Raudonojo dobilo (T.pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T.medium

L.) antimikrobiniu aktyvumas didžiausias - augalų krūmijimosi tarpsnio metu. Mėlynžiedės liucernos (M.sativa L.) antimikrobinis aktyvumas didžiausias krūmijimosi tarpsnio metu. Sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia Scop.) žiedai yra antimikrobiškai aktyviausi, palyginus su kitomis augalo dalimis.

Stipriausiu antimikrobinu aktyvumu pasižymėjo Sėjamojo esparceto (O.viciifolia Scop.) sėklos. Pupinių augalų žaliavą rekomenduotina ruošti šių augalų krūmijimosi tarpsnyje. Aktyviausiai prieš mikroorganizmus veikia iš pupinių augalo dalių - žiedai. Antimikrobinės savybės labiausiai išreikštos yra S.esparceto (O.viciifolia Scop.), todėl šis augalas rekomenduotinas tolimesniems moksliniams tyrimams.

SUMMARY

The final master‘s thesis/research prepared by Justina Krukonytė and supervised by prof. PhD. Alvydas Pavilonis, advised by prof. PhD. Hiliaras Rodovičius. Institute of Microbiology and Virology. Faculty of Pharmacy, Lithuanian University of Health Sciences. Kaunas, 2018.

Investigation of the antimicrobial properties of legume plants (Fabaceae L.), their maturation stage and the parts of the plant.

Reaserach aim: To assess antimicrobial efficiency of different morphological plant parts (flower, leaf, steam, seeds) in the different stage of maturity (blooming, branching) of Fabaceae (L.) plants samples, collected in Lithuania.

Objectives: Red clover (T.pratense L.) different wild ecotypes (Sadūnai, Vyčiai, Liepsna, Kiršiniai, Kamaniai, Radvilai, Arimaičiai), Zigzag clover (T.medium L.), Alfalfa (M.sativa L.), Black medick (M.

lupulina L.), Sainfoin (O.viciifolia Scop.), Liquorice milkvetch (A.glycyphyllos L.) and Cicer milkvetch (A.cicer L.) different morphological plants samples of flowers, leaves, steams, seeds also all plant sample

collected on blooming and branching stages.

Research methodology: Freeze-dried plants materials (10 - 20 g) were extracted with 70 % ethanol (1:10) using an ultrasonic bath for 30 minutes at 50 - 55°C. The extracts were filtered through Whatman filter paper. The filtrates were concentrated, then evaporated to dryness by placing them in a water bath at 50°C. The concentrated extracts were stored in the dark at 4 – 8°C. The concentrated plants extracts were dissolved in 3 mL of 30% ethanol. One millilitre of the solution was mixed with 9 mL of warmed-up to 45°C Mueller–Hinton agar and poured into sterile petri dishes. Each segment was inoculated with the suspension of the reference strains of 10 different microbial species. The antibacterial activity of plant extracts after 24 hours in thermostat (35°C) was evaluated as a minimum inhibitory concentration (MIC) by using an agar dilution technique.

Conclusions: It was found that Red and Zigzag clovers have the strongest antimicrobial activity on plants branching stage period. The most active antimicrobial properties which has morphological plant part are flowers of the Legumes plants. The most active antimicrobial activity of the seeds extracts has Sainfoin. The most active inhibitory effect of microorganisms has Sainfoin, in comparison with other parts of this plant and other representatives of the Legumes antimicrobial activity, it‘s recommended to proceed experiments with this legume plant.

PADĖKA

Už kantrybę, pagalbą, bei konsultacijas atliekant Farmacijos magistro baigiamąjį darbą norėčiau padėkoti prof. Alvydui Paviloniui, prof. dr. Hiliaras Rodovičiui ir Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Mikrobiologijos ir virusologijos instituto darbuotojams. Taip pat, Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Žemdirbystės institutui už suteiktas kokybiškas tiriamas medžiagas.

SANTRUMPOS

Santrumpa ar sutartinis ženklas Paaiškinimas

A. cice Astragalus cice L.

A. glycyphyllos Astragalus glycyphyllos L.

B. cereus Bacillus cereus ATCC 11778

B. subtilis Bacillus subtilis ATCC 6633

C. albicans Candida albicans ATCC 10231

DCP Disease Control and Prevention

E. coli Escherichia coli ATCC 25922

E. faecalis Enterococcus faecalis ATCC 29212

JAV Jungtinės Amerikos Valstijos

K. pneumoniae Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

K.t. Krūmijimosi tarpsnis

M. lupulina Medicago lupulina L.

M. sativa Medicago sativa L.

mg/ml miligramai militre (koncentracijos reiškimo būdas)

MSK

Mažiausioji slopinančioji tirto augalo ekstrakto koncentracija, mg/ml

O. viciifolia Onobrychis viciifolia L.

P. vulgaris Proteus vulgaris ATCC 8427

P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853

PSO Pasaulinė sveikatos organizacija

R.d. Raudonasis dobilas

S. aureus Staphylococcus aureus ATCC 25923

S. epidermidis Staphylococcus epidermidis ATCC 12228

Š.d. Šilinis dobilas

T. medium Trifolium medium L.

T. pratense Trifolium pratense L.

V.A. Visas augalas

WHO World Health Organization

ĮVADAS

„Sveikata ne viskas, bet be sveikatos nėra nieko“, taip teigė graikų filosofas Sokratas. Per visą žmonijos gyvavimo laikotarpį vidutinė gyvenimo trukmė šiuo metu yra pati ilgiausia, vidutiniškai žmogus pragyvena 70 metų (statistika vertinama pagal pasaulio vidurkį, 2015 m. duomenimis), gyvenimo trukmė toliau vis ilgėja, o nuo 2005 metų pragyvenimo vidurkis pakilo net 3 metais. [1] Sparčiai keičiantis ir tobulėjant pasauliui, gerėjant gyvenimo kokybei susiduriame su naujomis sveikatos problemomis: naujų ligų atsiradimu, lėtinių ligų progresija bei besivystančiu antimikrobiniu rezistentiškumu. Jį, kaip vieną pagrindinių iššūkių sveikatos srityje, pristato Pasaulinės sveikatos organizacija (PSO). [5]

Antimikrobiniai vaistai - vienas sėkmingiausių atradimų XX a. medicinos srityje, kurie per daugiau nei 70 metų išgelbėjo milijonus gyvybių. Tačiau žmonių neracionalus, ilgalaikis antibiotikų vartojimas bei antimikrobinių medžiagų naudojimas gyvulininkystėje, augalininkystėje, maisto ar pašarų gamybos pramonėje iškėlė didelę grėsmę ateities kartoms.[6] Antibiotikai tebėra viena didžiausių vartojamų vaistų klasių, kurios pardavimai pasaulyje kasmet sudaro virš 22 milijardų JAV dolerių. Iš šios sumos 4 - 5 milijardai skiriami antibiotikams, kurie skirti atsparių bakterijų sukeltoms infekcijoms gydyti.

Mikroorganizmai nuolat mutuoja, vis didėja kiekis padermių, atsparių įvairių grupių antibiotikams, dezinfekcinėms medžiagoms bei kitiems baktericidiniams ar bakteriostatiniams poveikiams. Vien Lietuvoje, pagal Europos antimikrobinio atsparumo stebėsenos tinklo duomenis, ligoninėse plintančių bakterijų, galinčių sukelti plaučių uždegimą, sepsį – klebsielių (K. pneumoniae) dauginio atsparumo dažnis 2007 m. - 2,9 proc., o 2011 m. pasiekė net 43 procentus. [7] Europoje fiksuojama daugiau nei 25 000 mirčių kasmet nuo antibiotikams atsparių infekcijų (EMA ir ECDC 2009 duomenimis). [4] Esant tokiam bakterijų rezistentiškumui bei neturint efektyvių antimikrobinių vaistų vis sunkiau užtikrinti saugias medicinines procedūras (organų transplantaciją, vėžio gydymą (pvz. chemoterapiją), chirurgines procedūras (pvz. klubo sąnario keitimą, cezario pjūvį), bei užkirsti kelią infekcinėms ligoms (pvz. tuberkuliozei).

Minėti faktoriai neigiamai veikia visuomenės sveikatingumą. Paskutinį dešimtmetį sparčiai didėja mirtingumas nuo nesukontroliuojamų infekcinių ligų, pacientams reikalinga kur kas intensyvesnė priežiūra, nei anksčiau. Taip patiriamos kur kas didesnės išlaidos norint pasiekti efektyvų gydymą. Europos Sąjungoje minėti kaštai siekia apie 1,5 milijardo eurų kasmet. [4] PSO skelbia galimas problemos sprendimo būdus, kurie turi būti vykdomi kompleksiškai: reguliariai informuoti visuomenę apie antimikrobinių vaistų vartojimo ypatumus, taip pat griežtinti antimikrobinių vaistų paskyrimą ir išdavimą. Lietuvoje šeimos gydytojai net 1 iš 10 pacientų paskiria netinkamus antibiotikus. Dažniausiai netikslingai paskiriami preparatai gydant akių ar šlapimo takų infekcijas. Pasaulinė sveikatos

organizacija taip pat skatina ieškoti naujų veiksmingų antimikrobinių medžiagų, bei atlikti papildomus laboratorinius tyrimus jau sukurtiems vaistams, patvirtinti ar juos vis dar galima racionaliai ir efektyviai vartoti. [2]

Atsižvelgiant į galimus sprendimo būdus, apsvarstomi daug metų vartojami natūralius produktai, kurie gaunami iš augalų. Nuo neatmenamų laikų vartojamos įvairios vaistų formos kaip arbatos, milteliai, tinktūros naudojami ir šiuo metu. Taip pat, vis labiau inicijuojami ir vykdomi eksperimentiniai tyrimai nanobiotechnologijų srityje naudojant natūralius augalinius preparatus. Vienas iš pagrindinių mokslinių darbų tikslų - išgauti efektyvias augalų daleles, kurios turėtų stiprių antimikrobinių savybių. Jas būtų galima naudoti nanostruktūrose (nanovamzdeliuose, nanoemulsijose ir pan.). Šios struktūros turėtų efektyviai ir tikslingai veikti prieš mikroorganizmus. Ateityje planuojama tokius natūralius antimikrobinius junginius naudoti farmacijos srityje.

Viena augalų šeima kelia didelį susidomėjimą mokslinėje srityje, vis daugiau atliekama ir inicijuojama mokslinių tyrimų. tai Pupinių (Fabacea L.) šeima, dar kitaip vadinama ankštinių. Viena labiausiai paplitusi pasaulyje, trečia pagal dydį tarp aukštesniųjų botanikos augalų šeimų, pasižyminti įvairiomis terapinėmis savybėmis, taip pat plačiai vartojama agrokultūros srityje (gerina dirvožemio kokybę, intensyviai fiksuoja azotą). Šių augalų auginimas nereikalauja daug priežiūros bei yra sąlyginai pigus.Augalų vartojimas medicininiams tikslams siekia kelis tūkstantmečius iki mūsų eros. Jau senovės Graikijoje kalbėta apie ankštinių augalų suteikiama papildomą ištvermę superherojui Herakliui. Šiuos augalus verta atrasti iš naujo ir nuodugniai ištirti. Liaudies medicinoje Pupiniai naudojami senai, teigiama, kad jie pasižymi antimikrobiniu poveikiu bei kitomis gydomosiomis savybėmis: antiseptinėmis, antioksidantinėmis, tinka cukrinio diabeto ligos kontroliavimui, taip pat pasižymi estrogeninėmis savybėmis, malšina negalavimus menopauzės metu. Augaliniai preparatai naudojami kaip karščiavimo, plaučių uždegimo, meningito, astmos, egzemos, virškinimo trakto sutrikimų gydymo priemonė. [9, 10, 11] Ankštinių šeimos augalai sukaupia nevienodą biologiškai aktyvių junginių kiekį ir pasižymi skirtingu antimikrobiniu aktyvumu - tam turi įtakos aplinkos, auginimo sąlygos, augimo tarpsnis. Tiksliai įvertinti pupinių augalų antimikrobinį aktyvumą reikalinga atlikti tyrimus - skirtingų brandos laikotarpių ir skirtingų augalų dalių. Eksperimento rezultatai parodytų, kuriuo augalo vegetacijos laikotarpiu tikslinga rinkti šio augalo vaistinę žaliavą, bei kuri augalo dalis turi efektyviausią antimikrobinį aktyvumą.

Darbo tikslas: Ištirti Lietuvoje augančių pupinių (Fabaceae L.) augalų šeimos antimikrobinį aktyvumą, atsižvelgiant į skirtingus brandos etapus bei skirtingas augalų dalis.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti ir palyginti Raudonojo dobilo (T.pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T.medium L.) augalų brandos tarpsnių (krūmijimosi, žydėjimo) bei augalo dalių (lapų, stiebų, žiedų) antimikrobinį aktyvumą, pagal gautus tyrimo duomenis;

2. Įvertinti ir aptarti Mėlynžiedės liucernos (M.sativa L.) ir Sėjamojo esparceto (O. viciifolia Scop.) augalų brandos tarpsnių (krūmijimosi, žydėjimo) bei augalo dalių (lapų, stiebų, žiedų) antimikrobinį aktyvumą;

3. Nustatyti ir palyginti Raudonojo dobilo (T.pratense L.), Šilinio dobilo (T.medium L.), Mėlynžiedės liucernos (M.sativa L.), Apyninės Liucernos (M.lupulina L.), Sėjamojo esparceto

(O.viciifolia Scop.) ir Saldžialapės kulkšnės (A.glycyphyllos L.) sėklų antimikrobinį aktyvumą,

pagal atlikto tyrimo duomenis;

4. Bendrai palyginti ir atrinkti perspektyviausią pupinių augalų šeimos – lyderį – tolimesniems mikrobiologijos tyrimų vystymo etapams, atsižvelgiant į gautus rezultatus.

1. LITERATŪROS APŽVALGA

. Antimikrobinės medžiagos ir antimikrobinis atsparumas

Antimikrobinės medžiagos yra cheminės ir biologinės, slopinančios įvairius mikroorganizmus: bakterijas, grybelius, virusus, parazitus. Dažniausiai kalbant apie antimikrobinės medžiagas omenyje turima antibiotikus ir sintetinės medžiagas, kurių poveikis identiškas antibiotikų veikimo mechanizmams, tačiau yra daug natūralių medžiagų, kurios veikia antimikrobiškai. Mikroorganizmus slopinančios medžiagos pagal savo struktūrą, bei struktūros ypatybes skirstomos į klases. Jos išklasifikuojamos pagal svarbą žmonėms bei gyvūnams (skirstomos į svarbias, labai svarbias ir kritiškai svarbias). (WHO)

Antimikrobinis aktyvumas yra tiriamas ir apibrėžiamas pagal tam tikrus reiškinius ir skirstomas į kategorijas: klinikinius, mikrobiologinius įgytus, įgimtus.

Klinikinis antimikrobinis atsparumas

Klinikinis antimikrobinis atsparumas taikomas norint nustatyti gydymui skirto antibiotiko ir jo dozės poveikį ligos eigai ir baigčiai apibrėžti. Klinikinis atsparumas priklauso nuo biocheminių, farmakokinetinių, farmakodinaminių parametrų organizme. Pagrindinis rodiklis klinikiniam atsparumui įvertinti naudojamas – mažiausia slopinanti antibiotiko koncentracija (MSK), kuri parodo koks mažiausias antibiotiko kiekis slopina bakterijų dauginimąsi in vitro. Koncentracijos rezultatas įvertinamas konkrečiai antimikrobinei medžiagai ir konkrečiam infekcijos sukėlėjui, naudojant pripažintus rodiklius – klinikinius lūžio taškus. Rodikliai aprobuoti Europos antimikrobinio jautrumo tyrimų komiteto. [17] Klinikinis atsparumas susijęs su klinikine praktika, gydant žmones ir gyvūnus. Todėl šis atsparumas yra dažniausiai aprašomas mokslinės, klinikinės praktikos ar kito pobūdžio literatūros šaltiniuose.

Mikrobiologinis atsparumas

Mikrobiologinis atsparumas - atskirų bakterijų padermių gebėjimas toleruoti didelių koncentracijų antimikrobines medžiagas, lyginant su etaloninėmis tos rūšies bakterijų padermėmis, kurios paprastai tiems antibiotikams yra jautrios. Atsparios padermės yra įgavusios atsparumą antimikrobinėms medžiagoms per genų perdavimą arba mutacijų metu. Mikrobiologiniam atsparumui nustatyti yra ištiriama tiriamosios padermės mažiausia slopinanti koncentracija ir lyginama įprastai jautrių tos rūšies bakterijų MSK reikšmėmis. Atsparia šiuo atveju laikoma tokia padermė, kuriai reikalinga didesnė MSK nei nustatyta rodiklinių padermių jautrumo riba (epidemiologinė ribinė reikšmė). Mikrobiologinis atsparumas tikrinamas tikslas - nustatyti ar tam tikroje teritorijoje vystosi bakterijų atsparumas antimikrobinėms medžiagoms. [18]

Įgimtas antimikrobinis atsparumas

Įgimtas antimikrobinis atsparumas - įgimta mikroorganizmų rūšies savybė pasireiškianti atsparumu atskirų klasių antimikrobinėms medžiagoms. Atsparumas gali būti įvairaus pobūdžio, pavyzdžiui, kai bakterijoje nėra tinkamo taikinio, į kurį veiktų antimikrobinė medžiaga. [18]

Įgytas antimikrobinis aktyvumas

Kai kurie mikroorganizmai gali įgyti atsparumą antimikrobinėms medžiagoms per mutacijas arba įgavę genus, koduojančius atsparumo mechanizmus iš išorės, iš kitų bakterijų padermių. Tokie genai gali koduoti fermentus, kurie modifikuoja antimikrobinių medžiagų cheminę struktūrą. paversdami juos neaktyviais. Šie genai paprastai yra nesunkiai perduodami vienų bakterijų kitoms. Perdavimo mechanizmai susiję su konjugacija ir kitais atsparumo perdavimo veiksniais. Plazmidės ar transzpozonai veikiantys, kaip mobilūs elementai. Šios organelės turinčios genetinę informaciją, kurią apsaugo nuo nepalankių veiksnių, bei genetinių pokyčių. [19]

Neracionalus, ilgalaikis antibiotikų vartojimas bei antimikrobinių medžiagų naudojimas gyvulininkystėje, augalininkystėje, maisto ar pašarų gamybos pramonėje iškėlė didelę grėsmę ateities kartoms. [6] Pasaulinės sveikatos organizacija jau yra sudariusiu rekomendacinio pobūdžio monitoravimo sistemas, kuriomis skatina laikytis, kad mikroorganizmų rezistentiškumo mąstai sumažėtų. Sparčiai didėjantis rezistentiškumas tik stabdys medicinos inovacijas. Nes šiuo metu pakankamai lengvai suvaldoma infekcinė plaučių uždegimo liga, gydoma penicilinu, bus nesustabdoma ir reikės ieškoti alternatyvių vaistų problemai išspręsti, jau šiuo metu didėja skaičius naujagimių infekcijų ir sunkiu jų suvaldymu. [4]

Mikroorganizmų rezistentiškumo atsiradimą pagreitina:

• menka antimikrobinio rezistentiškumo priežiūra ir monitoravimo sistemos nebuvimas; • neracionalus antibiotikų vartojimas, įskaitant jų naudojimą gyvulininkystėje;

• savigyda ir menka kontrolė infekcijų gydymui skiriamiems preparatams; • nebaigiamas ar per ilgas gydymo antibiotikais kursas;

• rezistentiškumas plitimas, ląstelių konjugacijų metu (genetinė įtaka); Dėl įvairių priežaščių, kurios sukelia rezistentiškumą vystosi kitos problemos:

• įprastinis gydymas antibiotikais tampa neveiksmingas, pailgėja pacientų gyjimas, pacientams reikalinga atidesnė priežiūra, padidėja mirties rizika;

• pailgėjas sveikimo periodas padidina riziką rezistentiškoms infekcijoms toliau plisti ir perduoti atsparumą;

• dėl neefektyvaus gydymo išauga gydymo kaštai tiek paciento, tiek valstybės atžvilgiu; • toliau sparčiai plintant rezistentiškiems mikroorganizmams didėja rizika atlikti chirurgines

. Pupinių augalų apibūdinimas

Jau daugybę amžių įvairiuose regionuose pupiniai augalai vartojami liaudies medicinoje. Prieš XX amžių, neapdirbti ar beveik gryni ekstraktai buvo vartojami žmonių ir gyvūnų ligų gydymui. Atsiradus cheminės sintezės sukurtiems vaistams augaliniai preparatai kiek prarado populiarumą, tačiau paskutiniuosius metus susidomėjimas, ypatingai mokslinėje srityje, tik didėja. Ieškoma įvairių būdų kaip išgauti kuo gryniausias medžiagas ir jas efektyviai panaudoti.

Ankštiniai augalai - viena didžiausių šeimų pasaulyje, kurią sudaro 730 genčių ir per 19400 rūšių augalų, vis nuodugniau tyrinėjama ir plačiau naudojama. Pupiniuose augaluose randama daug biologiškai aktyvių medžiagų, kurios lemia antimikrobinį poveikį (cheminiai junginiai (flavanoidai (izoflavonai ir 5- deoksi flavonoidai), saponinai, fenolio, kofeino rūgštys bei kitos medžiagos). [13] Flavonoidai vaidina svarbų vaidmenį prieš patogeninius mikroorganizmus, taip pat fiksuoja azotą. Ankštiniai augalai turi gerai išvystytą pagrindinę šaknį, todėl sugeba paimti maisto medžiagas iš gilių sluoksnių. Dažnai net geba įsisavinti tokius junginius kurių kiti augalai nepaima. Lietuva yra turtinga dideliais plotais dirbamų laukų. Dažnai sėjomanai naudojami pupiniai augalai. Šie augalai priskiriami prie dirvožemio ir augalų derlingumą skatinančiųjų, nes sukaupia pakankamai didelį kiekį organinių medžiagų, formuoja sąlygas pasėliui, aktyvina mikrobiologinius procesus. [23, 30] Pupiniai augalai populiarūs ir pramonės srityje, kadangi turi daug baltymų dažnai vartojami kaip pašaras gyvuliams. Medicinos srityje augalai pasižymi priešvėžinėmis, antidiabetinėmis, antireumatinėmis, antiseptinėmis, antibakterinėmis, atsikosėjimo lengvinančiomis, karščiavimą slopinančiomis savybėmis. [20, 21, 22]

. Raudonojo dobilo (Trifolium pratense L.) ir Šilinio dobilo (Trifolium medium

L.) bendroji charakteristika

Dobilų (Trifolium L.) gentis priklauso pupinių (Leguminosae L. / Fabaceae L.) šeimai. Dobilų gentį sudaro net apie 250 augalų rūšių. [33] T. prantesne ir T. medium daugiamečiai, augantys vidutinėse klimato juostose, gali augti sausesniuose dirvožemiuose, kai vyrauja vidutinis dirvos pH. Stiebai žali, kartais net rausvi, dažniausiai kylantys arba pagulę, rečiau statūs, nuo pat pamato vagoti. Pamatinių lapų lapkočiai ilgi, stiebinių trumpesni arba lapai visai bekočiai. Lietuvoje auga pievose, pamiškėse, ganyklose. [24] Žiedai smulkūs, abiejų rūšių - rausvos spalvos, Šilinio dobilo žiedo spalva intensyvesnė, kartais net rausvai violetinė. Šio dvi rūšys dažnai maišomos tarpusavyje. Š. dobilas kur kas rečiau sutinkamas nei Raudonasis. Šilinis dobilas, kitaip dar zigzago dobilas, pasižymi ilgesniu stiebu bei

lapeliais, kurie turi šviesėjančias „V formos“ žymes. (1 pav.) T. medium užaugina didesnį lapų skaičių ir mažesnį stiebų nei T. pratense. [33]

(A) (B)

1 pav. Šilinis dobilas (A) (Trifolium medium L.) ir Raudonasis dobilas (B) (Trifolium pratense L.)

Abu dobilai - daugiamečiai, su stora, išsišakojusia, liemenine šaknimi. Žydėjimo laikotarpis yra

birželio – rugsėjo mėnesiai. [31] Lapai turi prielapius, jų lakštai trilapiai, lapeliai pailgi kiaušiniški arba elipsiški, trumpais koteliai. Žiedai smulkūs, bekočiai, įstriži, susitelkę apvaliose ar plačiai kiaušiniškose, tankiose galvutėse. Turi storas, išsišakojusias liemenines šaknis, todėl gali pasiekti ir pasisavinti daug aktyvių medžiagų.

Raudonųjų dobilų vartojimas patvirtintas PSO monografijoje bei kituose pripažintuose dokumentuose – osteoporozei, menopauzės simptomams mažinti, hiperlipidemijos gydymui, prostatos vėžiui, pasižymi antioksidaciniu poveikiu. [25]

Plačiai naudojami dobilų ekstraktai Liaudies medicinoje, kinų, indų tradicinėje medicinoje. Minima, kad preparatai skiriami, kaip alternatyvi priemonė, cholesterolio mažinimui [27], taip pat naudojami - odos ligų gydymui, žvynelinei, egzemoai slopinti ar bėrimams. Tirpalai vartojami siekiant palengvinti bronchitą ar laringitą. [32]

Pastaruoju metu atlikti moksliniai tyrimai įrodo, kad įvairių dobilų ekstraktai turi antimikrobinį, antioksidacinį ir priešuždegiminį veikimą, gydo egzemą, slopina angiogenezę ir galimas net priešvėžinis veikimas. [16] Vienas iš atliktų tyrimų patvirtino, kad padidėjusį cholesterolio kiekį galima sureguliuoti, eksperimente dalyvavo sergantys triušiai, raudonasis dobilas žymiai sumažino bendrąjį trigliceridų ir MTL-Ch kiekį, bei padidino DTL-Ch kiekį triušių organizmuose. [28]

Pagrindinės aktyviosios medžiagos randamos dobilų žieduose: izoflavonai, biochaninas A ir formononetinas, kvercetinas ir kepferolis. Taip pat šie augalai kaupia ir fenolines medžiagas, tokias kaip kofeiną, rozmariną ir chlorogeno rūgštis. [26] Kaupiamas kumarinas, kuris suteikia antikoaguliacinių savybių. [29] Raudonųjų dobilų ekstraktas standartizuojamas pagal pagrindinių izoflavonų: daidzeino, genisteino, formononetino, biochanino A kiekį. Jų kiekis turėtų buti ne mažiau nei 90 proc. ir ne daugiau nei 110 proc. skaičiuojant nuo sausos medžiagos masės. (Pagal JAV farmakopėją)

Nustatyta, kad Šilinis dobilas lapuose, stiebuose, bei žieduose sukaupia pakankamai reikšmingą kiekį izoflavonų (daugiau nei T. pratense), [36] todėl taip pat yra biologiškai aktyvi rūšis. Skirtingose dobilų augalų dalyse, žieduose, lapuose bei sėklose nustatyta daug lakių skirtingų komponentų, saponinų bei glikozidų. [34] Raudonojo dobilo ir Šilinio dobilo biologinis aktyvumas bei galimas rūšių terapinis poveikis vis dar domina mokslininkus, inicijuojami vis nauji moksliniai darbai ir pradiniai atlikti tyrimai parodo jų biologinį veiksmingumą.

. Mėlynžiedės liucernos (Medicago Sativa L.) ir Apyninės liucernos (Medicago

lupulina L.) bendroji charakteristika

Mėlynžiedė liucerna ir Apyninė liucerna (2 pav.) - žoliniai augalai, turintys trilapius lapus. Gentis priklauso pupinių šeimai. Liucernos ilgaamžės, pasižyminčios gera žolinio pašaro kokybe, todėl daug kur kultivuojamos. Liucernų rūšių atstovai gali augti sausose pievuose, dirvonuose ir pan., nes išvystytas atsparumas ilgai trunkančioms sausroms, tai leidžia augalą naudoti įvairiems tikslams. Taip pat šie augalai atsparūs šalčiams, todėl puikiai tinka augti Lietuvos srityje. Liucernų gentyje yra apie 80 rūšių, Lietuvos augimvietėse šiuo metu auga tik trys rūšys. Šie augalai vidutiniškai žydi nuo balandžio iki rugpjūčio mėnesio. Sėklos yra sunokinamos liepos - rugsėjo mėnesiais. [37]

Apyninė liucerna (Medicago lupulina L.) – dažnai sutinkamas augalas Lietuvos augimvietėse. Žydi geltonais žiedynais, sudarytais iš 15 - 50 žiedų. Žieduose galima atrasti nektaro. Auga nerūgščiuose, karbonatiniuose dirvožemiuose. Pašarinių produktų verte prilygsta raudoniesiems dobilams, dažnai kombinuojama bendra augalų mityba. Atspari šalčiams ir sausroms. A. liucerną ganėtinai lengva supainioti su dobilų arba barkūnų rūšies augalais. Pagrindinis jų skiriamieji bruožai - ilgesnis lapkotis prie centrinio lapelio nei prie šoninių, bei lapelių dantytumo skirtumai. Nuo Geltonžiedės liucernos, taip pat augančios Lietuvoje, atskiriama tuo, kad M. lupulina turi mažesnio skersmens žiedus, o vaisiai ne taip stipriai išlenkti.

Viena pagrindinių M. lupulina dalių – flavonoidai, kurie pasižymi antioksidaciniu, antihistaminiu, priešuždegiminiu, trombocitų agregaciją slopinančiu poveikiu. Pagrindiniai randami junginiai: kemferolis, kvercetinas, miricetinas ir laricitrinas. Kemferolis, kvercetinas ir miricetinas turi

(A) (B)

2 pav. Apyninė liucerna (A) (Medicago lupulina L.) ir Mėlynžiedė liucerna (B) (Medicago Sativa L.)

antinavikinį poveikį, šie flavonoidai gali sukelti vėžinių ląstelių apoptozę, inhibuojant angiogenezę. Flavonoidai slopina uždegiminius procesus. [40] Augalo sudėtyje esantis sojasaponinas ir sojasapogenolis taip pat pasižymi priešuždegiminiu poveikiu, aktyviai veikia navikines ląsteles ir inhibuoja renino sintezę. [41]

Mėlynžiedė liucerna (Medicago sativa L.) - daugiametė, ilgai išsilaikanti pasėlyje (apie 10 metų) ankštinė žolė. Žiedai mėlynos spalvos pasitaiko ir violetinės, susitelkę retose kekėse. Liucerna taip pat atspari šalčiui, gerai pakenčia sausras, augalas sparčiai vystosi tiek kalkintame, tiek ne kalkintame dirvožemyje. [38] Turi gilią šaknį ir pasisavina drėgmę iš gilesnių sluoksnių, ko kiti augalai negali padaryti. Auga nerūgščiose dirvose. Dažnai Lietuvoje naudojama gyvūnų mitybai, kaip pašaras, savo maistine energitine verte lenkia dobilus bei Apyninę liucerną. [37]

M. liucerna pasižymi įvairiu terapiniu poveikiu, kuris yra moksliškai įrodytas. Viena iš augalo savybių - mažinti cholesterolio kiekį kraujyje. Šį teiginį patvirtina 117 įvairių mokslinių publikacijų atlikta analizė (2011 m.), publikacijose buvo nagrinėjami tyrimai skirtingiems gyvūnams, savanoriams, ištirtas poveikis skirtingų augalo dalių (šaknys, žiedai). [39] Taip pat pasižymi antidiabetiniu poveikiu, tai tvirtina vienas iš eksperimentinių tyrimų. Tirti vandeniniai ir metanoliniai M. liucernos ekstraktai. Pastebėtas kasos ląstelėse slopinamas gliukozės išsiskyrimo poveikis, po ekstraktų vartojimo. Liucernos sudėtyje esantis kvercetinas, apigeninas suteikia estrogeninį poveikį, taip pat gali būti vartojamas (dėl tų pačių cheminių medžiagų) kaip hormoninis priešvėžinis medikamentas. Daugelis augalo sudėtyje esančių medžiagų pasižymi antioksidantinėmis savybėmis. [39]

. Sėjamojo esparceto (Onobrychis viciifolia L.) bendroji charakteristika

Sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia Scop.) (3 pav.) – daugiametis, medingas, augalas. Lietuvoje gana retas, palyginus su dobilais bei liucernomis. Auga vidutinio drėgnumo priesmėlio ir priemolio, nerūgščiuose dirvožemiuose. Gerai tinka žvyringo priesmėlio kalvos, (šiose vietose blogiau auga liucernos). Sėjamasis esparcetas yra atsparus šalčiams ir sausroms. Šis augalas dažnai auginamas gryname pasėlyje arba sumaišytas su kitomis daugiametėmis žolėmis. Išauga iki 80 cm aukščio. Žiedai (rausvai raudoni, retai būna balti) sutelkti kekėse. Sėklos spalva gali varijuoti nuo gelsvai žalios iki rudos ar juodos.

Augalas sukaupia daug organinių ir mineralinių medžiagų (alkaloidų, paprastųjų fenolinių rūgščių, amino rūgščių, hidroksibenzoinių bei hidroksicinamono rūgščių, dihidroflavonolių, flavon-C-glikozidų, flavonolių (rutino) izoflavonų, antocianinų ir kt.). Cheminė sudėtis priklauso nuo augalo dalies. Atsparus daugumai ligų bei kenkėjų, lyginant su kitais pupiniais augalais. [42] Žaliavos maistingumas beveik prilygsta dobilams, todėl vartojamas kaip maistingas pašarinis augalas. [37]

3 pav. Sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia L.)

Tiriant gydomąsias augalo savybes didžiausias dėmesys buvo skirtas – fenoliniams junginiams. Daugiausiai augale aptikta arbutina, rutino, katechino, kvercetino, taip pat sudėtyje yra pakankamai daug taninų, kurie sukelia antimikrobinį aktyvumą. 2013 m. atliktame antimikrobiniame tyrime pastebėtas stiprus poveikį gramneigiamai E. coli bakterijai. [44] Taip pat taninai esantys esparcete suteikia antihelmetinių savybių, aktyvumas nustatytas prieš: Teladorsagia circumcincta, Haemonchlus

contortus, ir Trichostrongylus colubriformis. [43] Esparcetas sudėtyje turi kondensuotų bei hidrolizuotų

raugų, kurie sustiprina antioksidacinėmis savybėmis augalą, taip pat didina gliukozės įsisavinimą organizme, o tai gali būti alternatyvus ar papildomas pasirinkimas cukrinio diabeto gydymui. Kondensuotieji raugai pasižymi imunomoduliacinėmis, antibakterinėmis bei antihelmintinėmis savybėmis. Nustatyta, jog iš sėjamojo esparceto lapų išskirti kondensuotieji raugai efektyviai veikia prieš Butyrivibrio fibrisolvens bei Streptococcus bovis bakterijas. [45]

. Saldžialapės kulkšnės (A. glycyphyllos L.) ir Ilguolinės kulkšnės (A. cicer L.)

bendroji charakteristika

Kulkšnių (Astragalus L.) gentis - viena didžiausių pupinių šeimoje (Fabaceae ar Leguminosae). Šioje gentyje yra apie 2500 rūšių, iš kurių 113 auga Europoje. Lietuvos teritorijoje aptinkamos 4 kulkšnių genties rūšys: saldžialapė kulkšnė (A. glycyphyllos L.) (4 pav. A) ilguolinė kulkšnė (A. cicer

L.) (4 pav. B), smiltyninė kulkšnė (A. arenarius L.) ir juodadantė kulkšnė (A. danicus Retz.).

(A) (B)

4 pav. Saldžialapė kulkšnė (A) (A. glycyphyllos L.) ir Ilguolinė kulkšnė (B) (A. cicer L.)

Šiai genčiai priklausanti saldžialapė kulkšnė - daugiametis, 30 - 100 cm augalas, turintis storą, pliką arba plaukeliais apaugusį stiebą. Turi trumpą šaknį, kuri yra stora bei šakota. Lapai neporomis plunksniški, sudaryti iš mažų lapelių. Kulkšnių lapeliai pailgai kiaušiniški arba elipsiški, turintys buką viršūnę. Jų viršutinė pusė plika, žalia, apatinė - šviesesnė, pilkai žalia, padengta plaukeliais. Žiedai dažniausiai būna 7 - 8, gelsvi arba žalsvo atspalvio, įstriži, gulsti, kartais nulinkę, susitelkę

daugiažiedėse, kiaušiniškose ar pailgai kiaušiniškose kekėse. Sėklos netaisyklingai širdiškos ar inkstiškos, suplotos, lygios, šiek tiek blizgančios, žalsvai gelsvos arba rusvos. Saldžialapė kulkšnė auga pievose, ganyklose ir grioviuose.

Saldžialapės kulkšnės sudėtis panaši į kitų pupinių augalų, žaliavoje aptinkama: flavonoidų, terpenoidų, steroidų, aminorūgščių ir peptidų (pagrindiniai komponentai – saponinai, flavonoidai). Cheminė sudėtis priklauso nuo augalo vegetacijos tarpsnio, aplinkos sąlygų augimo metu. Kulkšnyse andami fenoliniai junginiai lemia antioksidantines savybes. Augalo vegetacijos pradžioje, skirtingose auglo dalyse kaupiamos skirtingos medžiagos. Lapuosse - kaupiamas didžiausias flavonolių ir katechinų kiekis, šaknyse - didžiausias kumarinų ir taninų kiekis. Augalo žydėjimo laikotarpiu kumarinai, katechinai, taninai buvo kaupiami stiebuose bei šaknyse. Žieduose nustatytas gausus kiekis flavonolių.

Astragalus cicer L. – daugiametis augalas, įrašytas į Lietuvos raudonąją knygą. [47] Lietuvoje

ilguolinė kulkšnė labai retai aptinkama. Auga sausuose miškuose, pamiškėse, sausuose šlaituose. Nors auga sausose vietovėse, kulkšnės šaknys neįsiskverbia labai giliai į dirvožemį, tik iki 1 m gylio (liucernos šaknys įsiskverbia giliau). Augalo lapai pailgi, lacentiški, sudėtiniai: nuo 10 iki 13 porų lapelių, apaugusių plaukeliais, yra priaugę prie bendro lapkočio. Žiedyną sudaro iki 60 nuo šviesiai geltonos iki baltos 22 spalvos žiedelių. Augalo sėklos – nuo blyškiai geltonos iki juodos spalvos. [48]

Kulkšnies genties augaluose yra alkoholių, aldehidų, rūgščių, esterių, eterių, amidų, halogenintų junginių, aromatinių junginių, hidrokarbonatų ir terpenų. Cheminių medžiagų kieki priklauso nuo augalo dalies, augmino stadijos. Šios genties augalai vartojami liaudies medicinoje. Teigima, kad augalai pasižymi imuninę sistemą stimuliuojančiu bei priešvirusiuniu veikimu. Dažnai kaip žaliava naudojamos – šaknys. Tradicinės medicinos atstovai jas skiria esant nefritui, cukriniam diabetui, hipertenzijai. Kulkšnies genties atstovai naudojami kaip pagalbinės medžiagos vaistinių preparatų gamyboje (kaip stabilizatorius, emulsikliai, klampumą reguliuojančios medžiagos). [49] Dėl augale esančių fenolinių junginių augalai pasižymi antioksidantinėmis savybėmis, kurios padeda pagerinti širdies funkciją, palengvinti širdies ligų simptomus bei mažinti cholesterolio kiekį kraujyje. [50] Taip pat, dėl sudėtyje esančių flavonoidų, polisacharidų bei saponinų kulkšnės ekstraktai pasižymi ir hepatoprotekciniu poveikiu. Vieno eksperimento metu buvo siekiama sumažinti anglies tetrachlorido sukeltą kepenų pažeidą žiurkėms, gauti rezultatai buvo teigiami. [51]

2. TYRIMO METODIKA IR ORGANIZAVIMAS

Pupinių augalų (Fabaceae L.) antimikrobinis aktyvumas nustatytas, mikrobiologiškai in vitro, difuzijos į standų mitybinį agarą metodu (CLSI, M07-A9, 2012). [3] Tyrimo metu naudotas Miulerio-Hintono agaras (Mueller-Hinton Agar, Becton, Dickinson and Company). Antimikrobinis aktyvumas nustatytas pagal atrinktas 9 etalonines, skirtingas biologines savybes turinčias, (Žr. priedus Nr.3) bakterijų rūšis (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228,

Enterococcus faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC

13883, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris ATCC 8427, Bacillus subtilis ATCC 6633, Bacillus cereus ATCC 11778) ir Candida albicans ATCC 10231 grybelio atžvilgį. Antimikrobinis aktyvumas vertintas nustatant jo MSK – mažiausiąją tirto ekstrakto koncentraciją (mg/ml), kuri dar slopina etaloninių mikroorganizmų augimą.

2.1. Tyrimo objektai

Daugiamečiai pupinių šeimos (Fabaceae L.) augalai:

1) Dobilo (Trifolium) genties atstovai: raudonasis dobilas (T. pratense L.) tirtos skirtingos augalo veislės – Sadūnai, Vyčiai, Liepsna, Kiršiniai, Kamaniai, Radvilai, Arimaičiai, taip pat tirtas šilinis ddobilas (T.medium L.);

2) Liucernos (Medicago) genties atstovai: mėlynžiedė liucerna Birutė (M. sativa L.) ir apyninė liucerna Arka (M. lupulina L.);

3) Kulkšnės (Astragalus) genties atstovai: saldžialapė kulkšnė (A. glycyphyllos L.) ir ilguolinė kulkšnė (A. cicer L.) ;

4) Sėjamasis esparcetas (Onobrychis viciifolia Scop.).

Pupinių augalų žaliavos gautos iš Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialo Žemdirbystės instituto. Visos žaliavos užaugintos Lietuvoje, Kėdainių raj. (Dotnuvoje). Vykdant antimikrobinį tyrimą, kurį inicijavo Lietuvos Mokslų Tarybos projektas - „Daugiamečiai pupiniai augalai – pridėtinės vertės ingredientų šaltinis funkciniam maistui“ (SVE-06/2014) kartu su Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centru ir Vilniaus universitetu. Augalų kilmė – Lietuvos augimvietės. Augalų derlius 2013 – 2014 metų. Augalų priežiūrai nebuvo naudota herbicidų. Tyrimams naudotos skirtingos augalo dalys: džiovinimo krosnyje džiovinti ir smulkinti augalų žiedai, lapai, stiebai, sėklos bei visos antžeminės augalo dalies biomasės žaliavos. Surinkti augalų mėginiai prieš tyrimus buvo plaunami vandentiekio vandeniu, skalaujami distiliuotu vandeniu ir nusausinti filtriniu popieriumi. Vėliau žaliavos buvo smulkinamos, 15

minučių laikomos 105°C temperatūroje ir toliau džiovinamos 65 ± 5°C temperatūroje džiovinimo krosnyje. Išdžiovintos žaliavos sumaltos iki dydžio, tinkamo pereiti 1 mm angelių skersmens sietą. Visos augalų žaliavos apdorotos rinkimo dieną.

2.2. Meterologinės sąlygos žaliavų auginimo metu

Vertinant oro sąlygas, 2013 metais vidutinė oro temperatūra Dotnuvoje buvo didesnė už ilgametį vidurkį (1924 – 2013 metų) gegužės, birželio (žolinių augalų žydėjimo tarpsnis), liepos bei rugpjūčio (žolinių augalų krūmijimosi tarpsnis) mėnesiais. Tik tų pačių metų balandžio mėnesį vidutinė oro temperatūra buvo mažesnė 5°C už bei ilgametį temperatūrų vidurkį (5,9°C). 2014 metais vidutinė oro temperatūra Dotnuvoje viršijo ilgametį temperatūrų vidurkį visais mėnesiais nuo balandžio iki rugpjūčio, vėl išskyrus birželio mėnesį, kai vidutinė oro temperatūra buvo mažesnė už 1924 – 2014 metų vidurkį 1,3°C. [46]

Apžvelgus 2013 metų vidutinį kritulių kiekį Dotnuvoje, galima pastebėti, jog jis buvo mažesnis už 1924 – 2013 metų vidurkį gegužės ir birželio mėnesiais. Ilgametį kritulių vidurkį viršijo balandžio, liepos ir rugpjūčio mėnesiais. 2014 metais vidutinis kritulių kiekis balandžio bei liepos mėnesiais buvo mažesnis už nustatytą 1924 – 2014 metų vidurkį, o gegužės, birželio ir rugpjūčio mėnesiais viršijo ilgametį vidurkį. [46]

2.3. Ekstraktų paruošimas

1. Kiekvieno augalo antimikrobinio aktyvumo nustatymui mėginys (8 - 20 g), buvo ekstraguojamas 70 V/V etanolyje santykiu 1:10 naudojant ultragarso vonelę 50 - 55C temperatūroje ir laikoma 30 min.

2. Gautas ekstraktas 50 - 55C temperatūros vandens vonelėje garinamas iki sutirštėjimo ir laikomas šaldytuve +4 - 6ºC temperatūroje. Ekstraguotų augalų (g), gautų tirštų ekstraktų (mg) ir jų kiekiai skiedimuose Miulerio-Hintono agare (mg/ml) nurodyti (Žr. Priedus Nr. 1, 2).

2.4. Tirštų ekstraktų antimikrobinio aktyvumo tyrimas

A) Tiriamųjų mėginių paruošimas antimikrobiniam tyrimui 1. Tiršto ekstrakto mėginai tirpinimi 30 proc. etanolio:

- 2,5 ml – tiriant 1 lentelėje nurodytus augalus, kurie buvo skiedžiami 7-se mėgintuvėliuose, arba

- 2,0 ml – tiriant 2 lentelėje nurodytus augalus, kurie buvo skiedžiami 7-se mėgintuvėliuose, arba

- 3,0 ml – tiriant 3 lentelėje nurodytus augalus, kurie buvo skiedžiami 11-se mėgintuvėliuose. 2. Po to, į kiekvieną mėgintuvėlį, pradedant 2-u ir baigiant paskutiniuoju – 7-u ar 11-u, buvo pilama

po 1 ml 30%V/V etanolio.

3. Tiriant 1 lentelėje nurodytus augalus, kurie buvo skiedžiami 7-e mėgintuvėliuose, į 1-ą mėgintuvėlį buvo įpilta 1 ml ištirpinto tiršto ekstrakto, o į 2-ą mėgintuvėlį – 1,5 ml ištirpinto tiršto ekstrakto iš 2,5 ml. Sumaišius 2-o mėgintuvėlio turinį, 1,5 ml tirpalo buvo supilta į 3-ą mėgintuvėlį. Sumaišius 3-o mėgintuvėlio turinį, 1,5 ml tirpalo supilta į 4-ą mėgintuvėlį. Skiedimai, nurodytu principu, buvo atlikti iki 7 mėgintuvėlio. (5 pav.)

4. Tiriant 2 lentelėje nurodytus augalus, kurie buvo skiedžiami 7-se mėgintuvėliuose, į 1-ą ir 2-ą mėgintuvėlius buvo pilama po 1 ml ištirpinto tiršto ekstrakto iš 2,0 ml. Sumaišius 2-o mėgintuvėlio turinį, 1 ml tirpalo buvo supiltas į 3-ą mėgintuvėlį. Sumaišius 3-o mėgintuvėlio turinį, 1 ml tirpalo supiltas į 4-ą mėgintuvėlį. Skiedimai, nurodytu principu, buvo atlikti iki 7 mėgintuvėlio.

5. Tiriant 3 lentelėje nurodytus augalus, kurie buvo skiedžiami 11-e mėgintuvėliuose, į 1-ą mėgintuvėlį buvo įpilta 1 ml ištirpinto tiršto ekstrakto, o į 2-ą mėgintuvėlį – 2 ml ištirpinto tiršto ekstrakto iš 3,0 ml. Sumaišius 2-o mėgintuvėlio turinį, 2 ml tirpalo buvo supilti į 3-ą mėgintuvėlį. Sumaišius 3-o mėgintuvėlio turinį, 2 ml tirpalo supilti į 4-ą mėgintuvėlį. Skiedimai, nurodytu principu, buvo atlikti iki 11 mėgintuvėlio.

Po 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 30  etanolio

1-as 2-s 3-as 4-as 5-as 6-as 7-as ir kt. skiedimai

6. Po to kiekvieno skiedimo 1 ml tirpalo buvo pilamas (sėjamas) į 9 ml (3 punktas), arba į 10 ml (4 punktas), arba 5 ml (5 punktas) 45 ºC temperatūros skystą Miulerio-Hintono agarą. Sumaišius, visas turinys supilamas į sterilią Petrio lėkštelę ir paliekamas atvėsti iki normalios kambario temperatūros.

B) Etaloninių mikroorganizmų kultūrų paruošimas

7. Tuomet ruošiamos etaloninės bakterijų ir grybelio C. albicans kultūros. Mikroorganizmai buvo auginami 1 parą prieš tyrimą, termostate, 5 ml mėgintuvėliuose. Termostate kultūros laikomos ~24 valandas 35°C. Mikrobų suspensija gaminama iš išaugintų mikrobų kultūrų fiziologiniame natrio chlorido (0,9 proc.) tirpale, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1,5 × 108 _{mikrobų ląstelių).}

8. Petrio lėkštelėje sustingus agarui, Petrio lėkštelės skaidrus dugnas buvo pažymėtas segmentais (viso 10). (6 pav.)

1 segmentas – Staphylococcus aureus ATCC 25923 2 segmentas – Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 3 segmentas – Enterococcus faecalis ATCC 29212

4 segmentas – Escherichia coli ATCC 25922 5 segmentas – Klebsiella pneumoniae ATCC 13883

6 segmentas – Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 7 segmentas – Proteus vulgaris ATCC 8427

8 segmentas – Bacillus subtilis ATCC 6633 9 segmentas – Bacillus cereus ATCC 11778 10 segmentas – Candida albicans ATCC 10231

9. Prieš sėjant patikrinimas mikroorganizmų kultūros suspensijos drumstumas. Standartizuojama Mc Farland indikatoriumi, kuris matuoja mėgintuvėlyje esančios suspensijos drumstumą. Mikrobų suspensija laikoma standartizuota, kai indikatoriaus reikšmė lygi 0,5 (tai reiškia, kad 1 ml mikrobų suspensijos yra 1,5 × 108 _{mikrobų ląstelių). Mikroorganizmų kultūroms atitikus 0,5} Mc Farland’o standartą.

10. Tuomet į kiekvieną segmentą 1 l bakteriologinė kilpele buvo sėjama etaloninė mikroorganizmų kultūra, pagal sudarytą sėjimo schemą. (6, 7 pav.)

C) Mėginių antimikrobinio aktyvumo tyrimas in vitro

11. Kultivuojama (auginama) termostate 20 - 24 val. 35 ºC temperatūroje. 12. Vykdomas vertinimas:

- augimas rodo, kad etaloninė kultūra yra nejautri tiriamajam preparatui tirtose jo koncentracijose, mg/ml.;

- neaugimas (nurodoma slopinanti augimą tiršto ekstrakto koncentracija) rodo, kad etaloninė kultūra yra jautri tiriamojo preparato tam tikrai koncentracijai agare, mg/ml.

13. Kontrolė:

- teigiama kontrolė – agare yra 5 % etanolio, mikroorganizmų kultūros auga; - neigiama kontrolė – agare yra 15 % etanolio, mikroorganizmų kultūros neauga.

14. Po 20 - 24 val. kultivavimo termostate 35ºC temperatūroje buvo vertinamas tirto mėginio antimikrobinis aktyvumas, nustatant jo MSK – mažiausiąją tirto ekstrakto koncentraciją (mg/ml), kuri dar slopina etaloninių mikroorganizmų augimą.

15. Kadangi buvo gautas ribotas tiriamosios medžiagos kiekis, antimikrobinį aktyvumo tyrimą buvo galima atlikti vieną tiriamąjį bandymą, todėl MSK vertės paklaidų nebuvo apskaičiuota.

6 pav. Etaloninių mikroorganizmų kultūrų sėjimo schema

7 pav. Tipiškos etaloninės mikroorganizmų kultūros ant Miulerio-Hintono agaro

3. REZULTATAI IR JŲ APTARIMAS

3.1. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.)

antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį

Dobilai vieni labiausiai paplitusių augalų pasaulyje, jie vartojami kaip maistingas pašaras gyvuliams, taip pat dažnai auginami laukuose, vykdant sėjomainos procesus. Dobilai naudojami nuo seno veterinarijoje ar „liaudies medicinoje“. Vis didesnis dėmesys tenka jiems iš farmacinės mokslo srities. Mokslininkai intensyviai ieško biologiškai aktyvių medžiagų įvairiuose augaluose. Dobilai taip pat kaupia biologiškai aktyvias medžiagas, kurios turi gydomųjų savybių: mažina gliukozės kiekį kraujyje (todėl galima kontroliuoti cukrinio diabeto ligą), veikia kaip antioksidantas, mažina cholesterolio kiekį, taip pat veikia antimikrobiškai. [12] Svarbu atrinkti tinkamą ir visapusiškai veiksmingą veislę, dobilo šeimą, kuri galėtų būti naudojama, kaip medicininė žaliava farmacijos pramonėje. Antimikrobinis tyrimas padėjo nustatyti kada geriau rinkti dobilų žaliavą, bei kuri augalo dalis pasižymi efektyviausiu mikroorganizmus slopinančiu poveikiu.

1.1.1. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį C. albicans atžvilgiu

8 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas (mg/ml) Candida albicans atžvilgiu

Iš Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo išgautų ekstraktų atlikus antimikrobinį aktyvumą (8 pav.) ir susisteminus rezultatus

0,00 25,00 50,00 75,00 100,00 125,00 150,00 175,00 200,00 M S K ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

pagal C. albicans grybelį pastebėtas antimikrobinis poveikis. Stipriausias slopinamasis aktyvumas – Raudonojo dobilo/ Liepsna veislės lapuose – 27,272 mg/ml, kiek mažesniu aktyvumu pasižymėjo šio augalo žiedai (31,454 mg/ml) ir stiebai (33,27 mg/ml). R. d./ Sadūnų veislės augalų brandos tarpsnių (žydėjimo ir krūmijimosi) antimikrobinis aktyvumas toks pat – 53,818 mg/ml. Lyginant augalo dalis (lapus, stiebus, žiedus) Raudonojo dobilo veislių ir Šilinio dobilo stipriausią slopinamąjį poveikį

C.albicans turėjo žiedai (MSK 29,272 – 36,909 mg/ml), iš visų ankštiniu augalų išsiskyrė tik Raudonojo

dobilo/ Arimaičių veislės poveikis, kuris silpnesnis net 4 kartus (134,166 mg/ml) už kitų žiedų ekstraktų aktyvumą. Antimikrobinis poveikis R. d. veislių ir Šilinio dobilo atskirų augalo dalių, t.y. lapų, žiedų, stiebų, buvo stipresnis, nei viso augalo krūmijimosi ir žydėjimo tarpsnių. Silpniausiu slopinamu poveikiu krūmijimosi metu grybeliui C. albicans pasižymėjo dauguma Raudonojo dobilo veislių (R. d./ Radviliai (200,833 mg/ml), R. d./ Arimaičiai 197,916 mg/ml) bei R. d./ Vyčiai (192,5 mg/ml)).

(Žr. priedus, Nr. 5)

1.1.2. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Bacilus cereus atžvilgiu

9 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.)veislių skirtingų veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.). antimikrobinio aktyvumo įvertinimas (mg/ml) Bacillus cereus atžvilgiu

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis poveikis B. cereus buvo 4,205 – 34,727 mg/ml ribose. (9 pav.) Stipriausiu slopinamuoju poveikiu mikroorganizmui pasižymėjo R. d./ Sadūnų veislė, aktyviai antimikrobiškai

0 5 10 15 20 25 30 35 M S K ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

veikė B. cereus krūmijimosi ir žydėjimo metu (MSK 4,205 mg/ml). Kitos šio augalo dalys taip pat slopinančiai veikė mikroorganizmo kultūras (lapai – 4,258 mg/ml, žiedai – 7,09 mg/ml bei stiebai – 13,51 mg/ml).

B. cereus menkai slopino dobilų stiebai (13,51 mg/ml (R. d./ Sadūnai) – 34,727 mg/ml (R.d./

Arimaičiai)) palyginus su kitais dobilų ekstraktais. Raudonojo dobilo veislių bei Šilinio dobilo antimikrobinis veikimas buvo stipresnis krūmijimosi tarpsnio metu (4,205 mg/ml (R.d. Sadūnai) – 11,58 mg/ml (R.d./ Arimaičiai)) nei žydėjimo, slopinančioji koncentracija lyginant kiekvieno augalo brandos tarpsnius skiriasi vidutiniškai 1,78 karto. Šia savybe išsiskyrė tik R. d./ Sadūnų veislė, mažiausia slopinanti koncentracija tokia pat augalo krūmijimosi ir žydėjimo metu (MSK 4,205 mg/ml).

(Žr. priedus, Nr. 5)

Raudonojo dobilo veislių ir Šilinio dobilo augalo dalių rezultatai parodė, kad pagal mikroorganizmą slopinančiu poveikiu dalys pasižymėjo tokia aktyvumo eile: žiedai > lapai > stiebai. 1.1.3. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo

įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Bacillus subtilis atžvilgiu

10 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio atsparumo įvertinimas (mg/ml) Bacillus subtilis atžvilgiu.

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis poveikis B. subtilis buvo 11,871 mg/ml – 54,363 mg/ml. Stipriausiai slopino B. subtilis R. dobilas/ Kiršinių veislės žiedai (MSK 11,871). Silpniausiu B.subtilis slopinimu pasižymėjo R. d./ Vyčių veislės lapų dalis – 54,363 mg/ml. (10 pav.)

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 M S K ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

Lyginant visų tirtų dobilų dalis pagal slopinamą efektą labiausiai pasižymėjo – žiedai. Raudonojo dobilo/ Radvilių veislės tirti lapai, žiedai, stiebai bei visas augalas žydėjimo tarpsnis pasižymėjo beveik labai panašiu antimikrobiniu aktyvumu (MSK 30,545 (Stiebai) - 32,263 (V.A. Ž.t.), visas augalas turi sąlyginai vienodas antimikrobines savybes.

Šilinio dobilo krūmijimosi tarpsnis pasižymėjo stipresniu slopinančiu poveikiu nei žydėjimo tarpsnis (V.A. K.t. – 53,456 mg/ml; V.A. Ž.t. – 39,967 mg/ml). Šilinis dobilas bendrai pasižymėjo vienu mažiausiu slopinančiu poveikiu B. subtilis, lyginant su kitų Raudonojo dobilo veislių duomenimis (Š. d. MSK vid. 41,521 mg/ml). (Žr. priedus, Nr. 5)

1.1.4. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Proteus vulgaris atžvilgiu

11 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas (mg/ml) Proteus vulgaris atžvilgiu

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis poveikis P. vulgaris vyravo nuo min. 11,656 mg/ml (R.d./Sadūnai, visas augalas) iki maks.74,166 mg/ml (R. d./ Arimaičiai, lapai). (11 pav.)

R. d./ Arimačių veislės visi tirti ekstraktai pasižymėjo silpniausiu slopinamuoju poveikiu

P.vulgaris (visų mėginių MSK vidurkis – 54,543 mg/ml.). Silpniausiu antimikrobiniu poveikiu

mikroorganizmui pasižymėjo: lapai (74,166 mg/ml), žiedai (59,626 mg/ml), augalas augintas krūmijimosi tarpsnio metu (53,454 mg/ml) bei visas augalas žydėjimo tarpsnio (50,74 mg/ml), lyginant kitų R. dobilų veislių bei Šilinio dobilo rezultatus.

0 10 20 30 40 50 60 70 M S K ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

Raudonasis dobilas/ Sadūnų veislė tiek krūmijimosi, tiek žydėjimo tarpsnio metu pasiekė tokia pačią mažiausią slopinamąją koncentraciją (MSK 11,656). Kitos šio augalo dalys pasižymėjo silpnesniu slopinimu net 3 kartus. Lapai, stiebai, žiedai turėjo praktiškai vienodą slopinamą poveikį (32,727 mg/ml (žiedai) < 37,454 mg/ml (stiebai)).

Raudonasis dobilas / Kiršinių veislės augalų mėginiai pasižymėjo panašiu antimikrobiniu poveikiu (17,152 mg/ml (V.A./K.t.) – 22,058 mg/ml (V.A./ Ž.t.)). Šilinio dobilo viso augalo krūmijimosi fazė (24,004 mg/ml) buvo kur kas stipriau veikianti antimikrobiškai nei žydėjimo fazė (50,363 mg/ml). Stipriausiu antimikrobiniu poveikiu pasižymėjusi šio augalo dalis – stiebai (30 mg/ml). Taip pat pasižymėjo R.d./ Arimaičių veislės stiebai, jų poveikis buvo stipriausias lyginant su šio augalo kitomis dalimis (lapais, žiedais). Kitų Raudonojo dobilo veislių augalų dalių palyginime lyderiavo – žiedai (R.d./ Sadūnai, R.d./Vyčiai, R.d./Kiršinai, R.d./Kamanai). (Žr. priedus, Nr. 5)

1.1.5. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Pseudomonas aeruginosa atžvilgiu

11 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.). antimikrobinio aktyvumo įvertinimas (mg/ml) Pseudomonas aeruginosa atžvilgiu

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis aktyvumas P. aeruginosa pasireiškė ribose 21,84 mg/ml (R.d. Vyčiai, žiedai) – 74,166 mg/ml (R.d./Arimaičiai, lapai). (11 pav.)

0 10 20 30 40 50 60 70 M S K ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

P. aeruginosa stipriausiai slopina – dobilų žiedai, lyginant augalų dalių slopinimo aktyvumą,

žiedai pasižymėjo mažiausia MSK reikšme (net 5 iš 8 skirtingų dobilų žiedų slopinimas buvo efektyviausias). Visų dobilų stiebai turėjo beveik vienodą antimikrobinį aktyvumą mikroorganizmui (MSK 35 ± 5). Silpniausiai veikusi antimikrobiškai Raudonųjų dobilų ir Šilinio dobilo dalis – lapai.

Dobilų augalo dalys (žiedai, stiebai) turėjo stipresnį slopinamą poveikį mikroorganizmui, nei mėginiai, kuriuose buvo naudota viso augalo žaliava. (Išsiskyrė tik R.d. Kamaniai, kurių V.A./ K.t. (28, 363 mg/ml) ir V.A./ Ž.t. (27,627 mg/ml)).

Raudonasis dobilas/ Sadūnai pasižymėjo panašia MSK (35±5) lyginant visus šio augalo tiriamuosius mėginius 32,323 mg/ml (V.A./K.t) – 37,454 mg/ml (Stiebai) P. aeruginosa veikimo atžvilgiu.

R.d./ Vyčių veislė žydėjimo tarpsniu (36,036 mg/ml) metu kas aktyvesnė slopinamuoju poveikiu P. aeruginosa, nei krūmijimosi tarpsnio metu. (57,037 mg/ml). (Žr. priedus, Nr. 5)

1.1.6. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Kliebsiella pneumonia atžvilgiu

12 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.). antimikrobinio aktyvumo įvertinimas Klebsiella pneumonia atžvilgiu

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis aktyvumas K. pneumonia atžvilgiu (12 pav.) pasireiškė ribose 4,258 mg/ml (R.d./Sadūnai) – 47, 272 mg/ml (Š.d.). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 M S K ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

Stipriausias antimikrobinis aktyvumas K. pneumonia pasireiškė - Raudonojo dobilo Sadūnų veislės mėginiuose, augalo slopinimo stiprumas pasiskirstė taip: V.A./ krūmijimosi tarpsnis (MSK 11, 659) > stiebai (MSK 8,114) > V.A./ Žydėjimo tarpsnis (MSK 7,002) > lapai (MSK 4,258) = žiedai (MSK 4,258).

Šilinis dobilas pasižymėjo silpnesniu antimikrobiniu aktyvumu palyginus su Raudonojo dobilo veislėmis (Šilinio dobilo visų tiriamų dalių MSK vid. 29,353 mg/ml). Visas augalas (krūmijimosi (MSK 14,417), žydėjimo tarpsniai (MSK 18,167)) veikė K.pneumonia aktyviau nei pavienės augalo dalys (stiebai (MSK 30) > žiedai (MSK 36,909) > lapai (MSK 47,272).

Visi dobilai aktyviau slopino mikroorganizmą žydėjimo tarpsniu nei krūmijimosi, išskyrus R.d./ Sadūnų veislę (V.A. K.t. (MSK 11,659) > V.A. Ž. t. (MSK 7,002)). (Žr. priedus, Nr. 5)

1.1.7. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Escherichia coli atžvilgiu

13 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas Escherichia coli atžvilgiu

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis aktyvumas E.coli pasireiškė MSK 21,84 (R.d. Vyčiai/ Žiedai) – 137,083 (R.d. Kiršinai/ V.A./ Ž.t.). (13 pav.)

Lapai, stiebai, žiedai aktyviau veikė mikroorganizmą nei auginti augalai krūmijimosi ar žydėjimo tarpsnių metu.

0 20 40 60 80 100 120 140 M SK ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

Lyginant žiedų ekstraktus su kitomis Raudonojo dobilo veislėmis (Sadūnais, Vyčiais, Liepsna, Kiršinais, Kamaniais, Radviliais) ir Šoliniu dobilu pasižymėjo stipriausiu slopinimu, išsiskyrė tik Raudonasis dobilas Arimaičių veislės (stiebai > lapai > žiedai) bei Šilinis dobilas (stiebai > žiedai > lapai). Visuose augaluose stiebai pasižymėjo gan panašiu veikimu (35±5 mg/ml). Žiedų bei stiebų aktyvumas visuose augaluose buvo lygiagretus, tik R. d./Arimaičių veislės žiedai išsiskyrė kur kas mažesniu aktyvumu, lyginant su kitų Raudonujų dobilų veislėmis (R. d./ Arimaičiai (MSK 89,444) < R.d. / Kamaniai (MSK 29,272). R. d./ Sadūnų žiedai ir lapai E.coli paveikė tokia pačia slopinančia konc. (MSK 32,727). R.d./ Liepsna veislės lapų (MSK 27,272), žiedų (MSK 31,454) bei stiebų (MSK 35,454) antimikrobinis aktyvumas E. coli buvo beveik tapatus (MSK 30±5). R.d./ Kiršinių veislė pasižymėjo mažiausiu slopinamuoju efektu E. coli (Lapai (MSK 115) > V.A. /K. t. (MSK 132,222) > V.A. Ž.t. (MSK 137,083)). (Žr. priedus, Nr. 5)

1.1.8. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Enterococcus faecalis atžvilgiu

14 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas (mg/ml) Enterococcus faecalis atžvilgiu

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis aktyvumas E.faecalis mikroorganizmui nustatytas ribose: MSK 11,606 (R. d./Radviliai, Žiedai) – 132,22 (R.d./ Kiršiniai, V. A./ Ž. t.). (14 pav.) Iš visų tiriamų dobilų dalių labiausiai pasižymėjo antimikrobiniu aktyvumu E.faecalis atžvilgiu – žiedai (aktyviausi net 5-se iš 8 tirtų žiedų mėginių). Dobilų atskirų dalių slopinamasis poveikis mikroorganizmui stipresnis nei viso

0 20 40 60 80 100 120 140 M S K ( m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai

augalo (krūmijimosi/žydėjimo tarpsnių) rinktos žaliavos (tuo pasižymėjo net 5 iš 8 dobilų). Silpniausiu antimikrobiniu aktyvumu pasižymėjo R.d./ Kiršinių veislė krūmijimosi tarpsnio (MSK 88, 146) ir žydėjimo (MSK 132,222) tarpsnio mėginiai. Kiršinių veislės lapų (MSK 115 mg/ml) antimikrobinis poveikis mažesnis nei kitų dobilų lapų ar kitų likusių augalų dalių. Šilinis dobilas pasižymėjo viso augalo žydėjimo (MSK 10,911) > krūmijimosi (MSK 24,004) tarpsnių efektyvesniu antimikrobiniu veiksmingumu, nei to paties augalo lapai ar žiedai. R.d./ Arimaičių augalo dalių aktyvumas buvo sąlyginai tapatus (MSK 30±5) (žiedai (MSK 26,363) > lapai (MSK 29,454) > stiebai (MSK 34,727)). Taip pat R.d./ Kamanių veislės augalo dalys veikė gan tapačiai E. faecalis: žiedai (MSK 29,727) > lapai (MSK 32,363) > stiebai (MSK 35,875). Visų tirtų Raudonojo dobilo veislių stiebų slopinimo poveikiai panašūs (MSK 30 ± 10). (Žr. priedus, Nr. 5.)

1.1.9. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas pagal brandos tarpsnį, bei augalo dalį Staphylococcus epidermidis atžvilgiu

15 pav. Raudonojo dobilo (T. pratense L.) veislių ir Šilinio dobilo (T. medium L.) antimikrobinio aktyvumo įvertinimas (mg/ml) Staphylococcus epidermidis atžvilgiu

Raudonojo dobilo veislių (Sadūnų, Vyčių, Liepsnų, Kiršinių, Kamanių, Radvilų, Arimaičių) ir Šilinio dobilo antimikrobinis aktyvumas S.epidermidis nustatytas MSK 7,09 (R.d./ Sadūnai, Žiedai) – 36,909 (Š. d., Žiedai) ribose. (15 pav.) Stipriausias slopinamas poveikis mikroorganizmui pasireiškė R.d./ Sadūnai augalo mėginiuose: žiedai (MSK 4,258) > V.A./ Ž.t. (MSK 7,002) > lapai (MSK 7,090) > V.A./ K.t. (MSK 11,659). Visų Raudonujų dobilų augalų stiebų mėginiai pasižymėjo silpnesniu antimikrobiniu poveikiu lyginant su kitomis augalų dalimis, tiek ir su viso augalo krūmijimosi ir žydėjimo tarpsnių išreikštais aktyvumais. Žydėjimo tarpsniu rinkti augalai turėjo silpnesnį poveikį prieš

0 5 10 15 20 25 30 35 40 M S K (m g/m l) Augalai V.A. / K.t. V.A. / Ž. t. Lapai Stiebai Žiedai