LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Juozas Žilinskas
SERGANČIŲJŲ PRIEDANČIO
AUDINIŲ UŽDEGIMU
NEUTROFILŲ OKSIDACINĖS
FUNKCIJOS BEI KRAUJO
REDUKCINIŲ SAVYBIŲ
TYRIMAS
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, odontologija (08 B)
Disertacija ginama eksternu. Mokslinis konsultantas
prof. habil. dr. Ričardas Kubilius (Lietuvos sveikatos mokslų universi-tetas, biomedicinos mokslai, odontologija – 08 B)
TURINYS
1. 2. 3. 3.1 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.4. 3.4.1. 3.4.2. 3.4.3. 4. 4.1. 4.2. 4.2.1. 4.2.2. 4.2.3. Įvadas ... Darbo tikslas ...… Darbo mokslinis naujumas ...… Literatūros apžvalga ...….. Priedančio audinių uždegiminių ligų epidemiologija ... Priedančio audinių uždegiminių ligų etiopatogenezė ..…Mikroorganizmų įtaka priedančio audinių uždegimo vystymuisi ... Virusų vaidmuo priedančio audinių uždegimo
etiopotogenezėje ... Sisteminių ligų įtaka priedančio audinių uždegimo vystymuisi ... Genetinių veiksnių įtaka priedančio audinių uždegimo vystymuisi ... Aplinkos veiksnių įtaka makroorganizmo atsakui į mikrobus ... Aktyviosios deguonies formos ...…
Aktyviųjų deguonies formų šaltiniai
makroorganizme ………... Būtinosios sąlygos neutrofilams gaminti aktyviąsias deguonies formas in vivo ... Antioksidacinė makroorganizmo sistema ...
Kai kurių svarbių antioksidantų trumpa
charakteristika ... Biologinių skysčių bendro antioksidacinio aktyvumo įvertinimo būdai ... Augalinių preparatų, turinčių antioksidacinį
priešuždegiminį poveikį, paieškos ... Medžiaga ir metodai ...… Tiriamųjų kontingentas ... Tyrimai ... Klinikiniai tyrimai ... Neutrofilų oksidacinės funkcijos įvertinimas nuo luminolo ir lucigenino priklausomos chemiliumines-cencijos metodais...…………. Preparato Traumeel S poveikio in vitro periferinio kraujo, kraujo plazmos ir serumo redukcinėms
savybėms nustatymas ... 5 7 8 9 10 11 11 12 13 13 14 15 21 21 22 25 26 27 29 29 29 30 31 34
4.3. 4.4. 5. 5.1. 5.2 5.2.1. 5.2.2. 5.2.3. 5.3. 6. Reagentai ... Statistinė analizė ... Rezultatai ...….
Klinikinių ir laboratorinių tyrimų duomenys ... Periferinio kraujo neutrofilų, veikiamų preparatu
Traumeel S in vitro, nuo luminolo ir lucigenino
priklausomos chemiliu-minescencijos tyrimų
duomenys... Tiriamųjų grupių asmenų periferinio kraujo
neaktyvintų neutrofilų, veikiamų preparatu Traumeel S
in vitro, nuo luminolo ir lucigenino priklausomos
chemiliumines-cencijos tyrimų duomenys ... Tiriamųjų grupių periferinio kraujo neutrofilų
aktyvintų neopsonizuotomis Escherichia coli ir veikiant preparatu Traumeel S in vitro nuo luminolo priklausomos chemiliuminescencijos tyrimų
duomenys... Tiriamųjų grupių periferinio kraujo neutrofilų
aktyvintų neopsonizuotomis Escherichia coli ir veikiant preparatu Traumeel S in vitro nuo lucigenino priklausomos chemiliuminescencijos tyrimų
duomenys... Preparato Traumeel S poveikio in vitro periferinio kraujo, kraujo plazmos ir serumo redukcinėms savybėms
nustatymas... Rezultatų aptarimas ...….. Išvados ...….. Darbo praktinė reikšmė ...… Bibliografijos sąrašas ...… Mokslinių straipsnių disertacijos tema sąrašas ... Straipsniai disertacijos tema ... Kiti straipsniai ... 35 35 36 36 38 38 42 53 64 65 72 73 74 97 97 97
ĮVADAS
Priedančio audinių uždegimas yra viena sunkiausiai sprendžiamų visuomenės sveikatos problemų [30]. Sergant priedančio audinių uždegimu, pažeidžiami minkštieji ir kietieji dantį supantys ir jį palaikantys audiniai. Dėl to, priedančio audinių uždegimas yra viena pagrindinių dantų netekimo priežasčių. Pastarųjų dešimtmečių mokslinių tyrimų duomenys rodo, kad vyresniems nei 40 metų amžiaus žmonėms dėl priedančio audinių uždegimo dantys šalinami dažniau nei dėl ėduonies [12, 219].
Pasaulinėje medicinos literatūroje plačiai nagrinėjami priedančio audinių uždegimai ir išaiškinta nemažai veiksnių (sutrikęs chemotaksis, fagocitozė, perteklinė aktyviųjų deguonies formų gamyba), turinčių įtakos jų vystymuisi [32, 44, 59, 80, 144, 181]. Tačiau minėtų ligų etiopatogeneziniai mecha-nizmai dar nepakankamai ištirti [42, 215, 259, 280]. Apibendrindamas pastarųjų dešimtmečių mokslinių tyrimų rezultatus, Williams (1998) pateikė šiuolaikinį priedančio audinių uždegimo išsivystymo modelį [290]. Pagal šį modelį svarbiausias vaidmuo skiriamas makroorganizmo imuniniam atsakui į dantų apnašo mikroorganizmus.
Priedančio audinių apsauginę funkciją atlieka neutrofilai. Makroorga-nizmo reakcija į dantenų mikroorganizmus yra neutrofilų antplūdis. Tai yra vienas iš svarbiausių žingsnių makroorganizmo gynyboje [240]. Šios ap-sauginės ląstelės sudaro didžiąją dantenų vagelės ar kišenės leukocitų dalį, be to, jos yra svarbiausios ląstelės, apsaugančios priedančio audinius nuo patogeninių mikroorganizmų [188]. Asmenys su žymesniais kokybiniais (sutrikęs chemotaksis, fagocitozė) ar kiekybiniais (įgimta ar įgyta neutro-penija) jų funkcijos defektais yra linkę sirgti priedančio audinių uždegimu [206]. Neutrofilų migracija į uždegimo vietą yra lydima pakitusio jų funkcinio aktyvumo, sugebėjimo išskirti į aplinką lizosominių granulių turinį bei toksiškas aktyviąsias deguonies formas [21], kurios vaidina svarbų vaidmenį ląstelių metabolizme, jų tarpusavio ryšiuose [24] ir dalyvauja įvairių uždegiminių sutrikimų patogenezėje [178].
Žalingas aktyviųjų deguonies formų efektas, sukeliantis potencialius bio-loginius pažeidimus, vadinamas oksidaciniu stresu. Greitai besikaupiantys mokslinių tyrimų duomenys patvirtina, kad oksidacinis stresas, aktyvin-damas neutrofilus ir didinaktyvin-damas jų oksidacinį efektyvumą, respiratoriniu pliūpsniu gali skatinti sisteminio uždegimo išsivystymą [140, 273].
Cheminiai ir ląsteliniai antioksidantai surenka (nukenksmina) aktyviąsias deguonies formas, kurios generuojamos kaip atsakas į uždegiminius stimulus. Eksperimentais įrodyta, kad sutrikęs antioksidacinis organizmo
pajėgumas yra susijęs su padidėjusia aktyviųjų deguonies formų produkcija [72].
Lėtinėms uždegiminėms ligoms gydyti, taip pat ir atliekant eksperimen-tinius tyrimus, aktyvioms deguonies formoms surišti bei jų gamybai blo-kuoti yra naudojamos įvairios medžiagos: vitaminai (E, C, A), nesteroidiniai vaistai nuo uždegimo (aspirinas, indometacinas, ibuprofenas ir kt.), hor-monai [55, 110, 139, 280]. Pastaraisiais metais daug dėmesio skiriama augalinės kilmės aktyviųjų deguonies formų rišikliams, pasižymintiems antioksidaciniu, antibakteriniu, antivirusiniu, senėjimą stabdančiu poveikiu, priešvėžiniu aktyvumu, bei išsiskiriantiems kitais farmakologiniais efektais [46, 131, 158, 183, 217].
Vis didesnio įvairių medicinos sričių klinicistų susidomėjimo susilaukia homeopatinis preparatas Traumeel S („Biologische Heilmittel Heel GmbH“).
Traumeel S – tai kompleksinis homeopatinis preparatas, sudarytas iš
daugelio vaistažolių ekstraktų:Arnica montana, Calendula officinalis, Achil-lea millefolium, Matricaria chamomilla, Symphytum officinale, Atropa belladonna, Aconitum napellus, Bellis perennis, Hypericum perforatum, Echinacea angustifolia, Echinacea purpurea, Hamamelis virginiana, Mercu-rius solubilis Hahnemanni, and Hepar sulfuris. [204]. Solidi klinikinė patirtis patvirtina jo efektyvumą gydant įvairias traumas [25], uždegiminius ir degeneracinius procesus [22, 236, 237], dėl chemoterapijos išsivysčiusius stomatitus [136], priedančio audinių uždegimus [101] ir kitais atvejais.
Negausūs eksperimentinių tyrimų duomenys rodo, kad šie preparatai slopina aktyvintose ir neaktyvintose imuninėse ląstelėse uždegimo media-torių IL-1β, IL-8 ir TNF-α sekreciją [213]. Mes neaptikome literatūroje duomenų apie šio preparato antioksidacinį aktyvumą. Daugelis autorių [213, 136] rekomenduoja toliau tęsti eksperimentinius Traumeel S tyrimus, norint išaiškinti jo veikimo mechanizmą. Be to, yra žinoma [42, 107, 233], kad asmenų su sveikais priedančio audiniais ir sergančių priedančio audinių uždegimu neutrofilams būdingas skirtingas funkcinis oksidacinis aktyvu-mas. Todėl tikslinga atlikti palyginamuosius šių asmenų grupių periferinio kraujo neutrofilų oksidacinės funkcijos tyrimus, įvertinant vieno iš homeopatinių preparatų Traumeel S poveikį neutrofilų oksidacinei funkcijai.
1. DARBO TIKSLAS
Įvertinti sergančiųjų priedančio audinių uždegimu periferinio kraujo neutrofilų oksidacinės funkcijos bei periferinio kraujo, plazmos ir serumo redukcines savybes.
Pagrindiniai darbo uždaviniai:
1. Ištirti ir palyginti sveikų asmenų ir asmenų, sergančių priedančio audinių uždegimu, periferinio kraujo aktyvintų ir neaktyvintų neut-rofilų, gaminamų aktyvių deguonies formų, kiekį.
2. Ištirti ir palyginti sveikų asmenų ir asmenų, sergančių priedančio audinių uždegimu, periferinio kraujo aktyvintų ir neaktyvintų neut-rofilų, gaminamų superoksido anijonų, kiekį.
3. Ištirti ir palyginti sveikų asmenų ir asmenų, sergančių priedančio audinių uždegimu, periferinio kraujo, plazmos ir serumo redukcinį potencialą bei nustatyti homeopatinio preparato Traumeel S poveikį redukcinėms periferinio kraujo, plazmos ir serumo savybėms in
vitro.
4. Palyginti sveikų asmenų ir asmenų, sergančių priedančio audinių uždegimu, periferinio kraujo aktyvintų ir neaktyvintų neutrofilų aktyvių deguonies formų gamybą veikiant homeopatiniu preparatu
Traumeel S in vitro.
5. Palyginti sveikų asmenų ir asmenų, sergančių priedančio audinių uždegimu, periferinio kraujo aktyvintų ir neaktyvintų neutrofilų superoksido anijonų gamybą, veikiant homeopatiniu preparatu
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS
− Pirmą kartą atliktas asmenų grupių, turinčių skirtingą neutrofilų funkcinį aktyvumą (sergančių priedančio audinių uždegimu ir sveikų as-menų), lyginamasis periferinio kraujo neaktyvintų ir aktyvintų neutrofilų oksidacinės funkcijos tyrimas. Tyrimams buvo panaudoti labai jautrūs nuo luminolo ir lucigenino priklausomos chemiliuminescencijos metodai.
− Pirmą kartą įrodytas homeopatinio preparato Traumeel S antioksi-dacinis poveikis in vitro, reikšmingai mažinantis sergančiųjų priedančio audinių uždegimu kraujo neutrofilų generuojamo superoksido anijono kiekį. − Pirmą kartą tirtas sergančių priedančio audinių uždegimu ir sveikų asmenų periferinio kraujo, plazmos ir serumo redukcinis potencialas, įvertinant homeopatinio preparato Traumeel S poveikį redukciniam poten-cialui in vitro.
− Tyrimų rezultatai papildo žinias ir apie priedančio audinių uždegimo patogenezę.
3. LITERATŪROS APŽVALGA
Priedančio audinių uždegiminėmis ligomis žmonės serga nuo senovės. Viename seniausių žinomų žmonijos raštų – Ajurvedoje – daugiau kaip prieš penkis tūkstančius metų pateikiamos pirmosios žinios apie burnos, tarp jų ir priedančio, ligas. Teoriniais šio sveikatos mokymo teiginiais vėliau rėmėsi Kinijos, arabų, antikinės Graikijos ir Romos medicinos teorija ir mokyklos [45]. Paleontologinių tyrinėjimų duomenys rodo, kad dar prieš 4000 metų Egipto ir Pietų Amerikos gyventojai jau turėjo alveolinio kaulo destrukcijos požymių [225]. Tų metų rašytiniuose šaltiniuose aprašomos dantenų ligos ir nurodomi būdai dantenoms stiprinti vaistais, pagamintais iš vaistingų augalų, mineralų ir medaus [68]. Senovės Kinijos rašytiniuose medicinos šaltiniuose išsamiai aprašomas dantenų uždegimas, išopėjimas, pūliavimas [57]. Kinai pirmieji suprato burnos higienos svarbą ir, norėdami išvengti priedančio ligų, ėmė naudoti dantų krapštukus ir šepetėlius [127].
Senovės Graikijoje Platono, Homero, Aristotelio laikais kultūros ir mokslo raida buvo pasiekusi aukštą lygį. Hipokratas aprašė priedančio ligų atsiradimo priežastis [120]. Vėliau apie burnos ir dantenų ligas rašoma Paracelsoir Eustachijaus veikaluose.
Pirmasis didesnės apimties spausdintas darbas, skirtas burnos ligoms, tarp jų ir priedančio ligoms, nagrinėti, buvo parašytas Fauchard 1746 m. [76]. Jame autorius daug dėmesio skiria dantų apnašoms, pažymi jų valymo svarbą, siūlo paslankių dantų įtvarus. Vėliau šiam klausimui daug dėmesio skyrė J. Hunter [125, 126], J. Rigs [222], B. Gottlieb [95], W.D. Miller [192] ir kiti mokslininkai.
Ypač sėkminga šioje srityje dirbusiems mokslininkams buvo XX am-žiaus antroji pusė, kai buvo moksliškai pagrįsta uždegiminių priedančio ligų išsivystymo mikrobiologinė teorija. Taip pat buvo pastebėtas makroorga-nizmo atsako į mikroorganizmus ir jų gyvybinės veiklos produktus vaid-muo. Tuo laiku didžiausias indėlis priklauso šį klausimą nagrinėjusiems Skandinavijos [67, 161, 162, 164], JAV [84, 85, 209, 240, 250, 252] ir Japonijos [130, 188] mokslininkams.
Įvairiais priedančio ligų etiologijos ir patogenezės tyrimų laikotarpiais to meto mokslinis metodinis lygis lėmė įvairių mokslinių hipotezių susiforma-vimą bei atskirų teorijų, dažnai klaidingų, atsiradimą.
3.1. Priedančio audinių uždegiminių ligų epidemiologija
Priedančio audinių uždegiminės ligos yra viena opiausių Pasaulinės sveikatos organizacijos problemų [30]. Jos yra plačiai paplitusios pasaulyje [194, 255], taip pat ir Lietuvoje [189]. Ši problema yra aktuali net ir tokiose ekonomiškai išsivysčiusiose šalyse kaip JAV ir Prancūzija. Štai JAV priedančio audinių uždegiminėmis ligomis serga apie 116 milijonų gy-ventojų, iš kurių 28 mln. – sunkia forma [67]. Atliktų tyrimų Prancūzijoje duomenys rodo, kad apie 50% suaugusių šios šalies gyventojų būdingi ryškūs priedančio audinių pažeidimai [30]. Sergant priedančio audinių uždegiminėmis ligomis, pažeidžiami minkštieji ir kietieji dantį supantys bei palaikantys audiniai. Dėl to šios ligos, kaip ir dantų ėduonis, yra viena pagrindinių dantų netekimo priežasčių. Pastarųjų dešimtmečių mokslinių tyrimų duomenys rodo, kad vyresniems nei 40 metų amžiaus žmonėms dėl priedančio ligų dantys šalinami dažniau nei dėl ėduonies [12, 219]. Taigi, priedančio ligos tampa socialine ir ekonomine problema. Tuo labiau, kad pastaraisiais metais ne tik didėja priedančio ligų paplitimas tarp suaugusiųjų ir vaikų, bet ir daugėja veiksnių, turinčių įtakos šių ligų vystymuisi (rūky-mas, sisteminės ligos ir kt.).
Pastaraisiais metais priedančio audinių uždegiminėmis ligomis, jų profilaktika ir gydymu susidomėjo ir kitų medicininių specialybių gydytojai (endokrinologai, kardiologai). Sergantieji cukriniu diabetu yra linkę sirgti sunkiomis priedančio audinių uždegimo formomis ir turi perdėtą, ypač įgimtą, organizmo imuninį atsaką [202].
Sunkiais priedančio audinių uždegiminių ligų atvejais priedančio audi-nių išopėjusio epitelio žaizdos apimtis gali siekti iki 50 cm2 [198]. Savaime suprantama, kad tokios didelės apimties žaizdos infekcija/uždegimas papil-domai išryškina organizmo imuninį atsaką, skatindamas diabetinių kompli-kacijų (nefropatijų ir makrovaskulinių sutrikimų) atsiradimą. Todėl priedan-čio ligų gydymas, ypač diabetikams, turi didelę svarbą tų ligonių sveikatai.
Priedančio audinių uždegiminėmis ligomis ypač susidomėjo kardiologai, kai širdies kraujagyslių aterosklerozinėse plokštelėse buvo rasta priedančio audinių patogenų [41, 156, 203, 295, 296], ir buvo nustatyta, kad priedančio audinių destrukcijos laipsnis ženkliai koreliuoja su širdies vainikinių arterijų ligos sunkumu [94]. Visa tai labai suaktyvino epidemiologinius tyrimus, kurių tikslas – išanalizuoti ne tik priedančio ligų paplitimą, bet ir nustatyti sergamumo tendencijas, atsižvelgiant į amžių, lytį, rasę, burnos ertmės higieną ir sisteminius bei aplinkos veiksnius.
3.2. Priedančio audinių uždegiminių ligų etiopatogenezė 3.2.1. Mikroorganizmų įtaka priedančio audinių uždegimo vystymuisi
Priedančio audinių uždegiminių ligų etiologijos ir patogenezės tyrimų raida ilga ir labai prieštaringa. Priedančio uždegiminių ligų infekcinės teorijos pradmenys skelbiami jau 1889 metais Miller‘io darbuose, kuriuose nagrinėjamas ryšys tarp bakterijų ir priedančio audinių ligų. Autorius nurodo, kad „alveolinę piorėją“ sukelia ne specifiniai mikroorganizmai, bet įvairios dantų apnašų bakterijos [192].
Vėliau infekcinė priedančio audinių pažeidimo teorija buvo pamiršta ir iki XX amžiaus vidurio buvo siūlomos vis naujos. Bandyta šias ligas sieti su mityba, hormonų veiksniais, kraujagyslių patologija bei audinių nesuderina-mumu [52, 92, 93, 123]. Tuo laikotarpiu nebuvo bendros priedančio ligų tyrimo krypties, todėl daugybė moksliškai nepagrįstų duomenų apie šias ligas sukėlė painiavą jas interpretuojant ir taikant klinikinėje periodonto-logijoje bei sudarė sąlygas gydymo ir profilaktikos klaidoms atsirasti [168].
XX amžiaus antroje pusėje iš šios padėties išeitį rado Skandinavijos mokslininkai, kurių priedančio uždegiminių ligų etiologijos mokslinę kon-cepciją sudarė kryptingi dantų apnašų vaidmens tyrinėjimai [161, 162, 167]. Buvo atlikta daug tyrimų ir įrodytas glaudus ryšys tarp burnos ertmės higienos ir priedančio audinių uždegiminių ligų [227, 231].
Priedančio audinių ligų, kurioms išsivystyti didelę įtaką turi bakterijos, esančios ant dantų ir subgingivaliniuose paviršiuose [167], infekcinės kil-mės pripažinimas suintensyvino mikroorganizmų paieškų tyrimus bei mik-roorganizmų ir makroorganizmo sąveikos analizę [31, 86, 122, 210, 262].
Dauguma mikroorganizmų, sukeliančių priedančio ligas, yra dantų ap-našose [17, 86, 109, 208, 290], kurių sudėtis priklauso nuo sudėtingų mikro-organizmų tarpusavio santykių: konkurencijos, antagonizmo bei komensa-lizmo [205].
Manoma, kad dantų apnašas sudaro trys pagrindiniai komponentai [153]:
1) kariesogeniniai mikroorganizmai;
2) priedančio ligas sukeliantys mikroorganizmai;
3) adjunvantai ir supresinės medžiagos, tarp kurių aktyviausi yra lipopolisacharidai, dekstranai ir kt.
Reikšmingiausi iš priedančio ligas sukeliančių mikroorganizmų yra
Por-phyromonas gingivalis, Bacteroides, Prevotella intermedia ir Actinobacillus actinomycetemcomitans [85].
Dabar apie dantų apnašų įtaką priedančio ligoms atsirasti medicinos literatūroje vyrauja du pagrindiniai požiūriai. Pirmojo požiūrio šalininkai mano, kad dantų apnašose esančios bakterijos ir jų toksinai sudaro „nespecifinį patogeninį potencialą“ [169]. Kiti autoriai teigia, kad atskiri mikroorganizmai gali veikti kaip specifiniai ligos sukėlėjai [5, 18, 69, 99, 100, 246], gamindami toksinus [103, 234, 294] ir sukeldami įvairius biologinius efektus [2, 267]. Dantų apnašų bakterijų gyvybinės veiklos produktai gali sukelti dantenų epitelio degeneracinius pokyčius, kurie didina jo pralaidumą [199, 248]. Kai kurios dantų apnašų bakterijos, tarp kurių ypač išskiriama Actinobacillus actinomycetemcomitans, geba prasiskverbti giliai į audinius, išskirti leukotoksiną, kuris, įsiskverbdamas į biologines membranas, sukelia biologinius jų pokyčius, didina kapiliarų pralaidumą [77, 145]. Pastaraisiais metais atlikti moksliniai tyrimai patvirtina žalojantį dantų apnašų poveikį priedančio audiniams ir mikroorganizmų, sukeliančių priedančio audinių ligas, reikšmę [85].
3.2.2. Virusų vaidmuo priedančio audinių uždegimo etiopatogenezėje Pastarųjų dešimtmečių tyrimų duomenys parodė, kad ir virusinė infekcija turi įtakos priedančio ligų išsivystymui.
Sergant jaunatviniu parodontitu ir kitomis sunkiomis priedančio audinių uždegiminėmis ligos formomis, viruso DNR buvo aptikta ne tik ligos pažeistuose, bet ir sveikuose audiniuose [7, 51, 186]. Kai kuriems autoriams [50, 249] pavyko aptikti ir aktyvias citomegalo viruso formas uždegimi-niuose priedančio audiuždegimi-niuose.
Dantenose esantys žmogaus citomegalo virusas ar Epštein-Barr‘o viru-sas siejasi su padidintu periodontopatinių bakterijų kiekiu šiuose audiniuose [116, 249]. Manoma, kad šie virusai susilpnina makroorganizmo imuninį atsaką, infekuodami B-limfocitus, o citomegalo virusas – priedančio mono-citus/makrofagus ir T-limfocitus [51, 247, 265]. Imuninis atsakas gali būti susilpnintas virusų, ypač pūslelinės viruso, infekcijos. Tai siejama su daugeliu supresinių veiksnių. Jie gali sužadinti audinius žalojančių citokinų išsiskyrimą, sukelti citotoksinius ir imunopatologinius reiškinius, o visa tai sudaro sąlygas daugintis priedančio patologiniams mikroorganizmams [52]. Tolimesni virusų vaidmens priedančio ligų etiopotogenezėje tyrimai gali būti svarbūs šios ligos profilaktikai ir gydymui.
3.2.3. Sisteminių ligų įtaka priedančio audinių uždegimo vystymuisi Be dantų apnašų poveikio, ne mažesnę įtaką priedančio ligoms vystytis turi ir makroorganizmo imuninio atsako į dantų apnašas ypatumai. Šiam imuniniam atsakui turi įtakos sisteminės ligos [20, 180, 202, 229], tarp kurių ypač pažymėtinos:
1) kraujo ligos; 2) endokrininės ligos;
3) medžiagų apykaitos sutrikimai.
Visoms sisteminėms ligoms, siejamoms su priedančio audinių uždegi-minės patologijos vystymusi, būdinga pakitęs makroorganizmo imuninis atsakas į dantų apnašų mikroorganizmus bei jų gyvybinės veiklos produktus [180, 202, 229]. Yra žinoma, kad priedančio audinių uždegimas ir destruk-cija yra makroorganizmo, imlaus dantų apnašų gramneigiamiems mikro-bams, atsako rezultatas. Dauguma bakterijų, kurios gali sukelti priedančio audinių uždegimą, yra identifikuotos [251]. Būdinga tai, kad jų buvimas tvirtai siejamas su destrukciniais priedančio audinių pažeidimais ir jų virulentiškumo faktorius lemia minkštųjų ir kietųjų priedančio audinių destrukciją. Dauguma šių bakterijų neaptinkamos sveikuose priedančio audiniuose arba aptinkamos mažais kiekiais. Kaip bakterijos inicijuoja destrukcinius priedančio audinių pakitimus nėra visiškai aišku, bet galimi mechanizmai šiuo metu yra plačiai tiriami [233].
Kadangi individai nėra vienodai imlūs priedančio audinių infekcijos destruktyviems efektams, darosi aišku, kad makroorganizmo atsakas į infekciją daugiausia lemia šios ligos paplitimą tarp gyventojų [277]. Matyt, tam turi įtakos makroorganizmo apsauginiai mechanizmai, kurie padeda išvengti priedančio audinių uždegimo ir trukdo jo progresavimui, ir žalingi mechanizmai, kurie inicijuoja susirgimą ir palaiko ligos progresavimą [233].
3.2.4. Genetinių veiksnių įtaka priedančio audinių uždegimo vystymuisi
Būdas, kuriuo sveikuose priedančio audiniuose bakterijos sukelia užde-gimą, nėra visiškai aiškus, bet daugelis buvusių sveikų priedančio audinių progresuojančios destrukcijos mechanizmų yra intensyviai tyrinėjami [233]. Kadangi ne visų individų vienodas priedančio audinių infekcijos destruk-cinis efektas, paaiškėja, kad įvairių individų makroorganizmo skirtingas atsakas į mikroorganizmus padeda šios ligos plitimui tarp gyventojų [277].
Dabar yra visuotinai pripažinta, kad priedančio ligų atsiradimas ir vys-tymasis yra makroorganizmo atsako į dantų apnašas sudarančius
mikro-organizmus (ypač į gramneigiamus) pasekmė. Daugelis šių bakterijų yra identifikuotos [251]. Makroorganizmo atsakas į infekciją priklauso nuo patogeno prigimties bei jo virulentiškumo ir yra veikiamas genetinių fak-torių. Makroorganizmo polinkis daugumai ligų priklauso nuo daugelio genų ir aplinkos faktorių sąveikos su patogenais [53, 118]. Šis daugiaveiksnis etiologinis ir patogenezinis priedančio ligų išsivystymo modelis išsamiau paaiškina tam tikrų asmenų jautrumą priedančio audinių uždegimo sukė-lėjams [187].
Dvynių ir jų šeimų tyrimų duomenys rodo, kad genetiniai faktoriai turi didžiulės įtakos priedančio ligų rizikai ir patogenezei. Iš dvynių lėtinių priedančio audinių uždegimų tyrimų duomenų matyti esminis priedančio audinių pažeidimo laipsnio tarp monozigotinių ir dizigotinių dvynių sutapimas ir tai, kad aplinkos faktoriai neturi lemiamos įtakos jų skirtumams [54, 185, 187]. Apie 50% priedančio uždegiminių ligų klinikos skirtumų priklauso nuo genetinių faktorių. Be to, dvynių šeimų su sunkių formų priedančio ligomis tyrimai patvirtina minėtų ligų ir jų klinikinių formų genetinę priklausomybę [173].
Tyrinėtojams iškyla didžiulis uždavinys identifikuoti už priedančio uždegiminių ligų išsivystymą atsakingus genus ir išsiaiškinti, kaip jie sąveikauja vienas su kitu ir su paciento aplinkos sąlygomis keisdami makroorganizmo atsaką į burnos mikroflorą.
3.2.5. Imuninio atsako ypatumai sergant priedančio audinių uždegimu
Priedančio audinių uždegiminių ligų rizikos veiksnių paieškos rodo, kad rūkymas yra vienas potencialiausių šių veiksnių. Iki šiol šio ryšio tikslūs biologiniai mechanizmai nėra pakankamai aiškūs, tačiau rūkymo fiziolo-ginis poveikis kraujagyslėms, audinių revaskulirizacijai, kolageno ir kolage-nazės gamybai, deguonies transportui, žaizdų gijimui ir kt. yra taip pat svarbus ir priedančio audiniuose [9]. Daugelis tyrimų parodė, kad rūkan-čiųjų organizmo atsakas į mikroorganizmus yra žymiai pakitęs. Autoriai, tyrinėję rūkymo įtaką agresyviam priedančio audinių uždegimo išplitimui, pastebi, kad rūkančiųjų priedančio audinių uždegimas pasižymi didesniu išplitimu ir sunkesnėmis klinikinėmis formomis negu nerūkančiųjų [232]. Taip pat buvo nustatytas sumažėjęs specifinių antikūnų kiekis rūkantiems prieš Actinobacillus actinomycetemcomitans lyginant su nerūkančiais. Tai rodo, kad rūkymas gali keisti makroorganizmo imuninį atsaką ir veikti ligos eigą [13]. Taip pat rūkymas gali veikti ir makroorganizmo atsaką į uždegimą. Dėl tabako ir jo šalutinių produktų poveikio kinta neutrofilų
funkcija, įskaitant chemotaksį, fagocitozę, oksidacinį pliūpsnį, superoksido ir vandenilio peroksido gamybą [276]. Tabakas ir jo komponentai gali stimuliuoti prouždegiminių citokinų, kaip IL-1, IL-6, IL-8 bei TNF-α, gamybą, kurie savo ruožtu sukelia audinių fibrozę, kaulinio audinio rezorb-ciją ir mažina kaulinio audinio regenerarezorb-ciją [9, 29, 105, 211, 253]. Yra žinoma, kad neutrofilai, būdami esmine nespecifinio imuniteto grandimi, vaidina pagrindinį vaidmenį makroorganizmo apsauginiuose mechaniz-muose nuo bakterijų [188, 278]. Minėtų ląstelių migracija į dantenų vagelę yra griežtai reguliuojamas imuninis procesas, sutelkiantis jas dantų apnašų mikroorganizmų kaupimosi vietose [266]. Neutrofilai gamina įvairias baktericidines medžiagas, įskaitant defensinus, baktericidinį kraujagyslių pralaidumą didinantį baltymą, laktoferiną, lizocimą ir kt. [34, 102], ir turi su ląstelės membrana susietą daugiakomponentinį fermentų kompleksą, vadinamą NADPH-oksidaze, kuris aktyvintas dideliais kiekiais gamina aktyviąsias deguonies formas [11]. Ramybės būsenos ląstelių NADPH-oksidazė yra neveikli, bet gali greitai būti aktyvinta gausiomis tirpiomis medžiagomis (chemotaksį skatinančiais peptidais bei chemokinais) ar dalelių pavidalo aktyvikliais (bakterijos ir imuniniai kompleksai), kurie reaguoja su lastelės paviršiuje esančiais receptoriais [238, 239].
Kaupiantis uždegimo vietoje neutrofiliniams leukocitams, didėja jų ak-tyvumas ir sugebėjimas išskirti į aplinką savo granulių turinį bei aktyviąsias deguonies formas [266].
Dėl išorės veiksnių poveikio gali suintensyvėti aktyviųjų deguonies formų gamyba ir jos gali turėti įtakos įvairių uždegiminių ligų vystymuisi. Be rūkymo, dar pažymėtini šie išorės veiksniai, darantys poveikį aktyviųjų deguonies formų gamybai: karštis, trauma, ultravioletiniai spinduliai, ultra-garsas, ozonas, išmetamos dujos, radiacija, infekcija, intensyvūs fiziniai pratimai, ypač šaltoje aplinkoje, bei kai kurios gydomosios priemonės (operacijos, dializės) [37, 113]. Klinikoje plačiai žinomas reiškinys, kai po peršalimo paūmėja priedančio uždegiminės ligos. Taigi žema temperatūra, didinanti aktyviųjų deguonies formų gamybą, gali turėti įtakos priedančio uždegiminių ligų eigai. Ląstelių bei audinių homeostazei palaikyti organiz-mas naudoja savo antioksidacinę sistemą [42].
3.3. Aktyviosios deguonies formos
Pastaraisiais metais daugelis mokslininkų savo dėmesį sukoncentravo į laisvųjų deguonies radikalų arba bendriau – aktyviųjų deguonies formų reikšmę daugelio ligų vystymuisi. Iš jų svarbiausios yra širdies ir krauja-gyslių ligos [66], vėžys [271, 274], priedančio audinių ligos [42] ir kitos
ligos. Aktyviosios deguonies formos gali būti gaminamos tiek ląstelės, tiek ir fagolizosomos membranų sienelėse ir išskiriamos į fagolizosomą ar į išorinę aplinką [42, 280]. Teigiama, kad baktericidinių medžiagų, ypač aktyviųjų deguonies formų, išskyrimas į aplinką yra net reikšmingesnis už fagocitozę [292]. Ląstelės išorėje esančias bakterijas iš principo gali sunaikinti nuo deguonies priklausomi baktericidiniai mechanizmai [239, 286]. Aktyvintų neutrofilų gaminamos aktyviosios deguonies formos atlieka svarbų vaidmenį apsaugant makroorganizmą nuo mikrobinės invazijos, bet tuo pačiu jos gali žaloti gretimai esančius makroorganizmo audinius ir sukelti jų uždegimą [42, 114, 274 ].
Todėl aktyviųjų deguonies formų tyrimai, sergantiems įvairiomis uždegiminėmis ligomis, ir medžiagų, slopinančių aktyviąsias deguonies formas, paieškos yra labai svarbūs [213] ir plačiai vykdomi, tiriant įvairių ligų patogenezę.
Aktyviosiomis deguonies formomis (žr. 3.3.1 lentelę) vadinamos mole-kulės ar jų fragmentai, turintys savo atomų ar molekulių orbitose vieną ar daugiau nesuporuotų elektronų [114]. Šie nesuporuoti elektronai aktyvio-sioms deguonies formoms suteikia didelį reaktyvumą.
3.3.1 lentelė. Aktyviosios deguonies formos
Radikalai Neradikalai Superoksidas Hidroksilas Hidroperoksilas Alkoksilas Ariloksilas Arilperoksilas Peroksilas Aciloksilas Acilperoksilas O2·– OH· HOO· RO· ArO· ArOO· ROO· RCOO· RCOOO· Singletinis deguonis Ozonas Hipochloro rūgštis Vandenilio peroksidas 1O 2 O3 HOCl H2O2
Laisvieji deguonies radikalai sudaro svarbiausią šių formų klasę gy-vosiose sistemose [190]. Molekulinis deguonis turi ypatingą elektronų kon-figūraciją ir pats savaime jau yra radikalas. Prie deguonies molekulės pri-dėjus vieną elektroną susidaro superoksido anijono radikalas [81, 128]:
O2 + e− → O2−
Superoksido anijono gamyba daugiausia vyksta ląstelių mitochondrijose [35]. Elektronų transporto grandinė mitochondrijose yra būtina jų gyvybei palaikyti. Vykstant energijos apykaitai, mažas kiekis elektronų „nuteka“ ir
jungiasi su deguonimi, sudarydami superoksido radikalą, kuris gali daly-vauti įvairių ligų patofiziologijoje [141, 271].
Kitas svarbus superoksido anijono šaltinis yra aktyvinti neutrofilai, makrofagai ir žymiai mažesniu kiekiu jį gaminantys eozinofilai ir limfocitai [56, 172]. Neutrofilų membranoje yra daugiakomponentis fermentų kompleksas NADPH-oksidazė. Neaktyvintų ląstelių NADPH-oksidazė yra neveikli, bet gali būti greitai suaktyvinta daugelio tirpiųjų mediatorių (chemotaksį skatinantys peptidai, chemokinai) ar didesnių (bakterijos, imuniniai kompleksai) aktyvatorių, kurie reaguoja su ląstelės paviršiuje esančiais receptoriais [10, 146]. Po leukocitų aktyvinimo, veikiant ląstelės membranos NADPH-oksidazei, vyksta reakcija, kurios metu iš aplinkos paimamas deguonis ir ant ląstelių paviršiaus susidaro aktyvus superoksido anijonas (žr. 3.3.1 pav.), kuris patenka į fagolizosomą ir neląstelinę aplinką [73]:
3.3.1 pav. Bakterijų ir jų produktų vaidmuo neutrofilų aktyviųjų deguonies formų produkcijoje (pagal Chaple ir Matthews, 2007) [42]
Superoksido anijonas yra vienas gausiausiai NADPH-oksidazės gami-namų aktyviųjų deguonies formų [34]. Superoksido anijonas spontaniškai ar veikiant superoksido dismutazei greitai paverčiamas vandenilio peroksidu [58]:
2O2− + 2H+ → O2 + H2O2
Superoksido anijonas ir vandenilio peroksidas dalyvauja vykstant tolesnėms reakcijoms ir yra aktyviųjų deguonies formų pirminės formos.
Neutrofilų – oksidacinis pliūpsnis 1O 2 HOCl OH·– H2O2 Neutrofilų – aktyvinimas (Fc γR, TLR-4)
Varpo formos receptorius 4 (TLR-4)
Tirpūs mediatoriai (lipopolisacharidai ir kt.) Bakterijos, imuniniai kompleksai
Fc-gama receptorius II (Fc γRII)
Veikiant mieloperoksidazei ir dalyvaujant Cl– ir H+
Superoksidas iš NADPH-oksidazės (heksozės-monofosfato) šunto Amino rūgštys Superoksido radikalo dismutacija (spontaniška ar dėl superoksido dismutazės) Singletinis deguonis gaminamas naudojant H2O2 (Fenton arba Haber-Weiss reakcija) Chloraminai
Haber-Weiss‘o reakcijos metu, dalyvaujant geležies ar vario jonams, susi-daro hidroksilo radikalas [163]:
O2− + H2O2 → OH + OH− + O2
Hidroksilo radikalas taip pat gali pasigaminti vykstant Fenton‘o reakcijai [157, 273]:
Fe2+ + H2O2 → OH + OH− + Fe3+
Vykstant Haber-Weiss‘o reakcijai, iš vandenilio peroksido (H2O2) gali susidaryti ir kita labai aktyvi deguonies forma – singletinis deguonis (1O2), pasižymintis stipriai išreikštu biologiniu reaktyvumu [16].
Singletinis deguonis ir hidroksilo radikalas yra labai aktyvios deguonies formos, galinčios sukelti ląstelių ir audinių sužalojimą bei destrukciją. Priedančio audinių ekstraląsteliniai komponentai (daugiausia proteoglikanai ir periodonto raiščių kolagenas) yra ypač jautrūs aktyviųjų deguonies formų poveikiui [212, 280].
Vandenilio peroksidas nėra toks biologiškai aktyvus kaip superoksido ir hidroksilo radikalai ar singletinis deguonis, tačiau jie kartu su mielo-peroksidaze, išsiskyrusia iš neutrofilų pirminių granulių, ir kraujo plazmoje esančiais halogenų jonais (dažniausiai chloru) sudaro stiprų oksidatorių – hipochlorito rūgštį [138].
Dėl mieloperoksidozės poveikio H2O2 oksiduoja halogenus (Cl–, Br–, J–) į hipohalogeno jonus, pasižyminčius dideliu oksiduojančiu poveikiu [138]:
H2O2 + Cl– + H+→ OCl− + H2O
Žinoma, kad osteoklastai, gamindami aktyviąsias deguonies formas gali pagreitinti kaulinio audinio rezorbciją [254, 245]. Kitų autorių nuomone, superoksido anijonas ir vandenilio peroksidas gali netiesiogiai lemti kaulinio audinio rezorbciją priedančio audinių uždegimo metu aktyvindami osteoklastus bei skatindami jų formavimąsi [15, 111, 272].
Pastaruoju metu daug dėmesio skiriama tyrinėti aktyviųjų deguonies formų destrukcinį poveikį organizmo ląstelėms ir neląsteliniams kompo-nentams [42, 280]. Aktyviosios deguonies formos, keisdamos pirminę, antrinę ir tretinę baltymų struktūrą, palengvina jų proteolizę ir gali suardyti ląstelės DNR, mažinti mitochondrijų, viduląstelinių fermentų aktyvumą bei peroksidinti membranų fermentus [148].
Superoksido anijono išskyrimas į neląstelinę aplinką gali aktyvinti che-motaksį ir pagreitinti leukocitų migraciją į infekcijos vietą [148]. Ak-tyviosios deguonies formos gali visiškai slopinti proteinazių inhibitorius.
Viena iš neutrofilų funkcinio aktyvumo savybių yra sąveikaujant su antigenais atsirandantis „oksidacinis pliūpsnis“, kurio metu vartojant aplin-kos deguonį susidaro didelis kiekis aktyviųjų deguonies formų [58]. Išsiskyrus fermentams ir įvykus „oksidaciniam pliūpsniui“ dėl padidėjusio proteinazių aktyvumo, gali vykti audinių destrukcija [260, 287]. Žalingas aktyviųjų deguonies formų efektas, sukeliantis potencialų biologinių siste-mų pažeidimą, yra vadinamas „oksidaciniu stresu“ [140].
Veikiant mikroorganizmams, sustiprėja citokinų gamyba. Tada jungia-mojo audinio ir imuninės ląstelės gamina daugiau proteolizinių fermentų, kurie gali ardyti kolageninius ir nekolageninius jungiamojo audinio kompo-nentus [280].
Aktyviosios deguonies formos aktyvina kolagenazę ir želatinazę bei, inaktyvindamos α-1 antiproteinazę, netiesiogiai sustiprina metaloproteinazių poveikį [242, 287].
Galima būtų manyti, kad esant mažesniam leukocitų kiekiui priedančio audiniuose gali būti mažiau išreikšti anksčiau minėti efektai. Tačiau moks-liniais tyrimais nustatyta, kad sergantiems cukriniu diabetu, sunkesnės prie-dančio audinių uždegiminių ligų formos koreliuoja su nepakankama neutro-filų funkcija, sutrikusiu neutroneutro-filų chemotaksiu, adhezija ir fagocitoze [174, 207, 291].
Tiriant priedančio audinių uždegimines ligas, didelis dėmesys skiriamas dantenų vagelės skysčio biocheminei ir morfologinei sudėčiai. Nustatyta, kad į dantenų vagelę per 1 minutę patenka apie 30 tūkstančių leukocitų [235], kurių daugiau kaip 90% sudaro neutrofilai. Šių ląstelių skaičius dar daugiau padidėja, jei yra priedančio audinių uždegimas [90].
Po sąveikos su mikroorganizmais neutrofilų citoplazminėse granulėse esantys proteoliziniai fermentai patenka į ekstraląstelinę aplinką, dantenų vagelėje padidėja lizosominių fermentų kiekis [152]. Manoma, kad pro-teazės, ypač elastazė, taip pat gali ardyti įvairius jungiamojo audinio kom-ponentus ir sukelti priedančio audinių destrukcinius pokyčius [152, 220, 269]. Minėtų fermentų kiekis dantų vagelės skystyje tiesiogiai priklauso nuo priedančio audinių uždegimo laipsnio [152, 270]. Dantenų vagelėse ran-dama ir kitų neutrofilų lizosominių fermentų: β-gliukuronidazės [149, 143], arilsulfafatzės [149], katepsino G [143] bei įvairių biologiškai aktyvių medžiagų, kilusių iš neutrofilų: IL-1 [129], IL-6 [134], IL-8 [47], ir PG-E2 [197].
Tačiau atskirų autorių nuomone [62], net ir labai padidėjęs neutrofilų lizosominių fermentų aktyvumas nepajėgus atlikti priedančio audinių
apsauginę funkciją. Todėl aiškinant priedančio audinių etiopatogenetinius mechanizmus, tikslinga ir toliau išsamiai tyrinėti neutrofilų oksidacinės funkcijos aktyvumą, nes spontaniškai išsiskyrę aktyviosios deguonies formos gali sunaikinti mikroorganizmus [42]. Todėl tam tikras jų kiekis yra būtinas priedančio audinių apsaugai. Tačiau padidėjusi aktyviųjų deguonies formų gamyba gali turėti įtakos priedančio audinių destrukcijai bei uždegiminių ligų etiologijai bei patogenezei [72, 272].
3.3.1. Aktyviųjų deguonies formų šaltiniai makroorganizme
Visus aktyviųjų deguonies formų šaltinius organizme galima skirstyti į išorinius ir vidinius. Pagrindiniai išoriniai aktyviųjų deguonies formų šaltiniai yra karštis, trauma, ultravioletiniai spinduliai, ultragarsas, ozonas, rūkymas, išmetamosios dujos, radiacija, infekcijos, intensyvūs fiziniai pratimai bei kai kurios kitos gydomosios procedūros [37, 113].
Pagrindiniai vidiniai (endogeniniai) aktyviųjų deguonies formų šaltiniai yra įvairių audinių ląstelių mitochondrijose vykstančio metabolizmo metu susidarančios aktyviosios deguonies formos [8, 141] bei esant uždegi-miniam organizmo atsakui bei reaktyviesiems imuninių ląstelių tarpusavio reguliuojamiesiems ryšiams neutrofilų gaminamos aktyviosios deguonies formos [78, 289]. Taip pat yra žinoma, kad įvairių tipų nefagocitinės ląstelės, kaip fibroblastai, kraujagyslių lygiųjų raumenų ląstelės, širdies miocitai ir endotelio ląstelės, padedant NADPH-oksidazei, gali gaminti aktyviąsias deguonies formas, kurios reguliuoja tarpląstelines signalines kaskadas [135].
3.3.2. Būtinosios sąlygos neutrofilams gaminti aktyviąsias deguonies formas in vivo
Leukocitams gaminti aktyviąsias deguonies formas in vivo būtinos tam tikros sąlygos (deguonies slėgis ir pH – 7,0-7,5) [4, 82]. Tokios sąlygos yra dantenų vagelėse (kišenėse) [184, 71]. Taigi lėtinė ar perteklinė aktyviųjų deguonies formų produkcija yra galima priedančio audinių pažeidimo vietose. Taip pat daugelio tyrinėtojų duomenys patvirtina sumažėjusį vietinį antioksidacinių fermentų ir kitų antioksidacinių sistemų lygį priedančio ligų atveju [3, 32, 74]. Tai įgalina kauptis aktyviąsias deguonies formas ir sukelti papildomus priedančio audinių pažeidimus. Be to, vietoje aktyviųjų deguo-nies formų produkuojami kiti oksidacijos produktai (kaip mažo tankio ok-siduoti lipoproteinai) gali papildomai skatinti minėtas ląsteles gaminti akty-viąsias deguonies formas [154, 230, 279]. Priedančio audiniuose sukauptas
oksiduotų medžiagų perteklius, skatina neutrofilus lokaliai gaminti akty-viąsias deguonies formas, pavyzdžiui, pažeistuose priedančio audiniuose gali susikaupti dideli kiekiai poliaminų [147, 282], kurie savo ruožtu skatina neutrofilus didinti aktyviųjų deguonies formų gamybą [282, 283]. Antra vertus, neutrofilai yra pajėgūs atsispirti nepalankioms sąlygoms dantenų kišenėse bei funkcionuoti ir pradėti oksidacinio pliūpsnio aktyvumą esant toksiniam sulfidų lygiui ligos paliestose vietose [48].
Aktyviąsias deguonies formas organizme neutralizuoja antioksidantai. Pusiausvyros sutrikimas tarp aktyviųjų deguonies formų gamybos ir jas neutralizuojančių organizmo antioksidacinių sistemų gali turėti įtakos uždegiminių ligų vystymuisi [42, 272].
3.4. Antioksidacinė makroorganizmo sistema
Makroorganizmo antioksidacinei sistemai priskiriami fermentai (super-oksido dismutazė, katalazė ir gliutationo peroksidazė), makromulekulės (albuminai, ceruloplazminas ir feritinas) ir daugelis smulkių molekulių: askorbininė rūgštis, α-tokoferolis, β-karotinas, ubichinolis-10, redukuotas glutationas, metioninas, šlapimo rūgštis ir bilirubinas [132]. Sutrikęs antiok-sidacinis pajėgumas dažnai siejamas su padidėjusia aktyviųjų deguonies formų gamyba [72, 132]. Aktyviųjų deguonies formų žalingas poveikis pasireiškia oksiduojant baltymus [61], peroksiduojant lipidus [268], žalojant DNR [112]. Visa tai rodo organizmo antioksidacinės sistemos svarbą palaikant jo homeostazę.
Antioksidantus priimta skirstyti pagal jų: 1) veikimo būdą (3.4.1 lentelė); 2) buvimo vietą (3.4.2 lentelė); 3) tirpumą (3.4.3 lentelė); 4) struktūrą (3.4.4 lentelė); 5) kilmę (3.4.5 lentelė).
3.4.1 lentelė. Antioksidantų klasifikacija pagal jų veikimo būdą
Veikimo būdas Pavyzdžiai Prevenciniai
antioksidantai Fermentai: superoksido dismutazė (1, 2 ir 3 fermentai), katalazė, glutationo peroksidazė ir kt. Metalo jonus izoliuojantieji: albuminas, laktoferinas, transferinas, haptoglobinas, ceruloplazminas, hemopeksinas, karotenoidai, superoksido dismutazė, katalazė, glutationo peroksidazė, glutationo reduktazė, polifenoliniai flavenoidai, šlapimo rūgštis
Antioksidantai – grandinių smulkintojai
Askorbininė rūgštis (vit. C), karotinoidai (įskaitant retinolį – vit. A) šlapimo rūgštis, α-tokoferolis (vit. E), polifenoliai (flavonoidai), bilirubinas, albuminas, ubichinonas (redukuota forma) redukuotas glutationas ir kiti tiolai
Antioksidantų skirstymas pagal jų veikimą pateiktas 3.4.1 lentelėje. Prevenciniai antioksidaciniai fermentai pašalina superoksido anijoną ir vandenilio peroksidą ar izoliuoja dvivalenčius metalo jonus (Fe2, Cu2) ir, tokiu būdu, neleidžia vykti Fenton‘o reakcijai [115]. Laktoferinas yra galimai svarbesnis dantenų audiniuose, kur dominuoja neutrofilų infiltratai, negu transferinas. Dideli kiekiai jo esti dantenų vagelės skystyje [1].
Grandines trumpinantys antioksidantai svarbesni ekstraląsteliniuose skysčiuose. Lipiduose tirpūs antioksidantai (α-tokoferolis bei karotinoidai) veikia ląstelių membranoje ir apsaugo jos lipidus nuo peroksidacijos, tuo tarpu vandenyje tirpūs antioksidantai svarbesni ekstraląsteliniuose skys-čiuose [42].
3.4.2 lentelė. Antioksidantų klasifikacija pagal jų lokalizaciją
Lokalizacija Pavyzdžiai Intraląstelinė superoksido dismutazė (1 ir 2 fermentai) katalazė, gliutationo
peroksidazė, redukuotas glutationas, redukuota ubichinono forma Ekstraląsteliniai superoksido dismutazė (3 fermentas), seleno gliutationo
peroksidazė, redukuotas gliutationas, laktoferinas, transferinas, haptoglobinas, ceruloplazminas, albuminas, askorbatas, karotenoidai, šlapimo rūgštis
Susieti su ląstelės
3.4.3 lentelė. Antioksidantų klasifikacija pagal jų tirpumą
Tirpumas Pavyzdžiai Vandenyje tirpūs Haptoglobinas, cerulopeazminas, albuminas, askorbatas, šlapimo
rūgštis, polifenoliniai flavonoidai, redukuotas glutationas ir kiti tioliai, cysteinas, transferinas
Lipiduose tirpūs α-tokoferolis, karotenoidai, bilirubinas, chinonai
3.4.4 lentelė. Antioksidantų klasifikacija pagal jų proteguojamas struktūras
Veikimo būdas Pavyzdžiai DNR apsaugantys
antioksidantai
superoksido dismutazė (1 ir 2 fermentai), gliutationo
peroksidazė, DNR atstatantys fermentai, redukuotas gliutationas, cysteinas
Baltymus apsaugantys antioksidantai
superoksido dismutazė (1 ir 2 fermentai), gliutationo
peroksidazė, DNR atstatantys fermentai, redukuotas gliutationas, cysteinas, antioksidaciniai fermentai
Lipidus apsaugantys antioksidantai
α-tokoferolis (vit. E), askorbatas (vit. C), karotenoidai (įskaitant retinolį – vit. A), redukuotas ubichinonas, redukuotas
gliutationas, gliutationo peroksidazė, bilirubinas
Įsidėmėtina, kad daugelis antioksidantų yra dvigubo, o kartais net ir trigubo veikimo. Pavyzdžiui, askorbatas veikia kaip grandines trumpinantis ir radikalų rišiklis, o kaip prevencinis antioksidantas redukuoja α-tokoferolį (vit. E) iš jo oksiduotos formos [200] ir sugeba surišti metalų jonus.
3.4.5 lentelė. Antioksidantų klasifikacija pagal jų kilmę
Kilmė Pavyzdžiai Ekzogeniniai antioksidantai
(gaunami su maistu) Karotinoidai, vit. C, tokoferolis (α, β, γ, δ), polifenoliai, katechinai, folinė rūgštis, cisteinas Endogeniniai antioksidantai
(sintezuojami organizme) Katalazė, superoksido dismutazė, gliutationo peroksidazė, glutationo-S-transferazė, redukuotas gliutationas, ceruloplazminas, transferinas, feritinas, gliukosylazės, peroksisomos, proteazės
3.4.1. Kai kurių antioksidantų trumpa charakteristika
Askorbininė rūgštis (vit. C). Vit. C kaip antioksidanto vaidmuo užde-giminių ligų atvejais yra plačiai diskutuojamas [14, 44, 115]. Jo antiok-sidacinis aktyvumas trumpai gali būti apibūdintas taip:
• naikina vandenyje tirpųjį peroksilo radikalą; • naikina superoksido ir perhidroksilo radikalus; • naikina hipochlorito rūgštį;
• naikina singletinį deguonį ir hidroksilo radikalą;
• apsaugo šlapimo rūgštį nuo žalojančio hidroksilo radikalo poveikio; • atkuria α-tokoferolį iš jo radikalų;
• sumažina Fenton‘o reakcijos galimybes, lėtindamas Fe2+ išsiskyrimą; • apsaugo rūkančiuosius nuo aktyviųjų deguonies formų susidarymo. Pastaraisiais metais buvo išaiškintas vit. C gebėjimas sumažinti C reak-tyvinio baltymo sukeltą monocitų adhezinių molekulių [216, 96] užde-giminių genų ekspresiją [285]. Vit. C kiekis kraujo plazmoje svyruoja nuo 30 iki 60 μM [226] ir būna sumažėjęs rūkančiųjų kraujyje [75]. Tyrimų duomenims reikšmės turi sumažėjęs vit. C vartojimas [297], sumažėjusi absorbcija ar padidėjusi vit. C destrukcija [179]. Vit. C koncentracija dantenų vagelės skystyje yra tris kartus didesnė negu kraujo plazmoje [182] ir vit. C gali padėti išvengti neutrofilų kolagenazės aktyvinimo [257].
Tokoferolis (vit. E). Tai svarbiausias ir efektyviausias lipiduose tirpus antioksidantas in vivo. Jis palaiko ląstelės membranos integralumą, naikina peroksilo radikalus ir padeda išvengti lipidų peroksidacijos [108]. Jo anti-oksidacinis poveikis priklauso nuo vienos fenolinės OH grupės. Jo oksi-duotą formą lipidų aplinkoje gali redukuoti kofermentas Q 10 (ubichinonas) ir vandens aplinkoje vit. C [201]. Vit. E būdingos ir priešuždegiminės, ir antioksidacinės savybės [33]. Jis slopina:
• proteinkinazę C bei trombocitų agregaciją; • azoto oksido produkciją kraujagyslių endotelyje; • neutrofilų ir makrofagų superoksido produkciją.
Rūkančiųjų kraujo plazmoje vit. C ir α-tokoferolio kiekis būna suma-žėjęs [166].
Karotinai. Tai beveik 600 variantų tetraterpinų [261]. Iš jų reikšmin-giausi yra:
• lykopenas; • α-karotinas; • β-karotinas;
• luteinas;
• kriptoksantinas; • retinolis (vit. A1);
• dehidroretinolis (vit. A2).
Plazmoje vyrauja lykopenas [87]. Karotinoidus daugiausia gauname su pomidorais, greipfrutais. Karotinoidai yra lipofiliniai. Kraujo plazmoje jų esti didelė koncentracija ir jie apsaugo nuo įvairių uždegiminių ir piktybinių procesų [261]. β-karotinas yra efektyvus singletinio deguonies naikintojas. Kiti karotinai taip pat pasižymi antioksidacinėmis savybėmis, naikina peroksilo radikalus.
Kofermentas Q10. Jis būna oksiduotos (ubichinonas ar CoQ) ir redu-kuotos (ubichinolis ar CoQH2) formų ir abi jos pasižymi antioksidacinėmis savybėmis [264]. Batino ir kt. [14] pažymi ryškų kofermento Q10 anti-oksidacinį vaidmenį gydant aktyviųjų deguonies formų sukeltas neurode-generacines ligas. Įdomu, kad sergančiųjų priedančio audinių uždegimu dantenose rastas sumažėjęs kofermento Q10 kiekis [117].
Šlapimo rūgštis. Šlapimo rūgštis yra vienas aktyviausių aktyviųjų de-guonies formų naikintojų kraujo plazmoje, šlapime ir seilėse [32]. Jos antioksidacinis poveikis pasireiškia naikinant singletinį deguonį, hidroksilo radikalą [6], hipochlorito rūgštį [293], surišant dvivalentinius metalų jonus ir tokiu būdu blokuojant Fenton reakciją [60]. Paprastai šlapimo rūgštis yra oksiduojama fermentiniu būdu iki alantoino ar hidroksilo radikalo. Alantoino susidarymas yra uratų oksidacijos žymeklis [98].
Polifenoliai. Dabar yra žinoma apie 4000 polifenolinių flavonoidų [214]. Jų gausu augaliniame maiste, raudonajame vyne, arbatoje [221]. Iš jų paminėtini vandenyje tirpūs katechinas, epigalokatechino galatas ir polife-nolis (kvercetinas). Jie naikina radikalus, suriša geležies jonus, padeda atkurti vitaminą C. Tačiau šiuo metu nėra duomenų apie su maistu gaunamų didelių dozių polifenolių įtaką uždegiminėms ligoms [42].
3.4.2. Biologinių skysčių bendro antioksidacinio aktyvumo įvertinimo būdai
Yra sukurta daug metodų, įgalinančių įvertinti kraujo, serumo ir plazmos bei kitų biologinių skysčių antioksodacinį aktyvumą. Šiuos metodus galima suskirstyti į dvi grupes:
1) skirtus atskirų antioksidacinių fermentų ir medžiagų antioksidaciniam aktyvumui įvertinti;
2) skirtus biologinių skysčių bendram antioksidaciniam aktyvumui įver-tinti.
Dauguma mokslininkų tyrimus atlieka naudodami biologinių skysčių bendro antioksidacinio aktyvumo įvertinimo metodus [19, 38, 40, 88, 191, 275, 288]. Tačiau ir šiais atskirais metodais gauti tyrimų duomenys ne visada koreliuoja tarpusavyje [39]. Vertindami šiuo metu esamus bendro antioksidacinio aktyvumo nustatymo metodus, Chapple ir Matthews [42] pažymi, kad tinkamo naudoti kasdieninėje praktikoje „auksinio metodo“ biologinių skysčių bendram antioksidaciniam aktyvumui nustatyti šiandieną dar nėra. Todėl tikslinga ir toliau ieškoti šiam tikslui skirtų metodų.
3.4.3. Augalinių preparatų, turinčių antioksidacinį priešuždegiminį poveikį, paieškos
Gydant lėtines uždegimines ligas bei atliekant eksperimentus, aktyviųjų deguonies formų poveikio sumažinimui yra naudojami įvairūs aktyviųjų deguonies formų rišikliai. Pastaraisiais metais daugelis tyrinėtojų, ieškodami antioksidantų, dėmesį sukoncentravo į augalinės kilmės aktyviųjų deguonies formų rišiklius. Ypač daug dėmesio skiriama flavonoidams [27, 124], pasi-žymintiems gerai išreikštomis aktyviųjų deguonies formų rišiklių savy-bėmis. Žinoma, kad nemažai augalų rūšių turi šių medžiagų ir jos yra svarbūs komponentai kinų tradicinėje medicinoje. Daugiau dėmesio krei-piama į flavonoidus dėl jų įvairių farmakologinių efektų: antioksidacinių, senėjimą stabdančių, antibakterinių, antivirusinių ir turinčių priešvėžinį aktyvumą [28, 104, 183, 263].
Vis didesnio klinicistų susidomėjimo įvairiose medicinos srityse susi-laukia homeopatiniai preparatai. Vienas iš jų Traumeel S („Biologische Heilmittel Heel GmbH“).
Traumeel S – tai kompleksinis homeopatinis preparatas, sudarytas iš
daugelio vaistažolių (kalninės arnikos (arnica montana), vaistinės medetkos (calendula officinalis), vaistinės ramunės (chamomilla recutita), vaistinės šunvyšnės (atropa belladona), mėlynosios kurpelės (aconitum napellus) ir kt.) ekstraktų ir įvairių mineralinių komponentų [213]. Šis preparatas Šveicarijos, Vokietijos ir Austrijos klinikinėje praktikoje taikomas daugiau kaip 50 metų [204]. Solidi klinikinė patirtis patvirtina jo efektyvumą gydant įvairias traumas [25], uždegiminius ir degeneracinius procesus [22, 236, 237], dėl chemoterapijos išsivysčiusius stomatitus [136], uždegimines prie-dančio audinių ligas [101] ir kitais atvejais.
Negausūs eksperimentinių tyrimų duomenys rodo, kad Traumeel S slopina aktyvintose ir neaktyvintose imuninėse ląstelėse uždegimo
media-torių IL-1β, IL-8 ir TNF-α sekreciją [213]. Mes neaptikome literatūroje duomenų apie šio preparato antioksidacinį aktyvumą. Daugelis autorių [136, 213] rekomenduoja toliau tirti Traumeel S poveikį organizmo įmuniniam atsakui, nes šio preparato veikimo mechanizmas nėra iki galo ištirtas.
Apibendrinus pateiktus literatūros duomenis, galima daryti išvadą, kad nors ir atlikta daug mokslinių tyrimų, priedančio uždegiminių ligų etiopatogenetiniai mechanizmai kol kas nėra galutinai ištirti. Dėl to nėra atrasti ir veiksmingi gydymo metodai, visiškai išgydantys šias ligas. Neutrofilų oksidacinės funkcijos tyrimai ir efektyvių antioksidantų paieška yra viena svarbiausių pastarųjų metų mokslinių tyrimų krypčių.
4. MEDŽIAGA IR METODAI
4.1. Tiriamųjų kontingentasTyrimas buvo atliekamas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Dantų ir žandikaulių ortopedijos klinikoje bei Biochemijos katedroje, gavus Kauno regioninio biomedicininių tyrimų etikos komiteto leidimą (Nr. BE-2-21).
Tyrimams atlikti buvo sudarytos dvi asmenų grupės: sergančių prie-dančio audinių uždegimu ir sveikų asmenų (su sveikais prieprie-dančio audiniais). Sergančių priedančio audinių uždegimu asmenų grupė buvo atrinkta iš daugelio pacientų, kurie kreipėsi į Kauno medicinos universiteto konsultacinę odontologijos polikliniką ir į J. Žilinsko privačią odontologijos kliniką dėl priedančio audinių uždegimo gydymo. Šiems pacientams buvo atlikti klinikiniai ir rentgenologiniai tyrimai. Į sergančiųjų priedančio audinių uždegimu grupę buvo įtraukti tik tie pacientai, kurie turėjo ryškių priedančio audinių uždegimo požymių (PI>5). Tyrimams atlikti įtraukti pacientai nesirgo sisteminėmis ligomis, nerūkė, per pastaruosius du mėnesius nevartojo antibiotikų ir priešuždegiminų vaistų.
Sergančiųjų priedančio audinių uždegimu tiriamąją grupę sudarė 32 pacientai. Šių asmenų amžius buvo 31–50 metų. Iš jų moterų buvo 17, tai sudarė 53,1 %, o vyrų 15, arba 44,4 % .
Sveikųjų grupę sudarė 36 Lietuvos sveikatos mokslų universiteto dar-buotojai ir studentai, nesergantys priedančio audinių bei sisteminėmis ligomis, nerūkantys ir per pastaruosius du mėnesius nevartoję antibiotikų ir priešuždegiminų vaistų. Sveikieji asmenys buvo 22–48 metų amžiaus, moterų buvo 20 (55,6 %), o vyrų 16 (46,9 %).
Iš pateiktų duomenų matyti, kad tiriamosiose grupėse daugumą sudarė moterys. Tai galima paaiškinti tuo, kad rūkymas trukdė įtraukti daugiau vyrų į tiriamąsias grupes.
4.2. Tyrimai
Tiriamųjų grupių asmenims buvo atlikti klinikiniai, periferinio kraujo neutrofilų oksidacinės funkcijos, kraujo, plazmos ir serumo antioksidacinio pajėgumo bei homeopatinio preparato Traumeel S įtakos jiems tyrimai in
4.2.1. Klinikiniai tyrimai
Kiekvieno tiriamojo tyrimų duomenys buvo surašomi specialioje an-ketoje, sudarytoje iš kelių skyrių: dokumentinės dalies, anamnezės duo-menų, objektyvaus tyrimo duoduo-menų, taip pat klinikinių, laboratorinių, bio-cheminių bei imunologinių tyrimų duomenų.
Priedančio audinių būklės įvertinimas
Priedančio audinių pažeidimo laipsniui įvertinti naudotas Russell‘o prie-dančio audinių indeksas – PI [228]; jo vertinimo kriterijai pateikti 4.2.1.1 lentelėje.
Priedančio audiniai sveiki, kai PI = 0–0,2 balo, gingvitas – PI = 0,3–2,0 balai, priedančio audinių uždegimas – PI = 2,1–8 balai.
Žandikaulio alveolinės ataugos kaulo būklei įvertinti naudota ortopanto-mograma ir atskirų dantų (11, 16, 24, 31, 36, 44) kontaktinės rentgeno nuotraukos.
4.2.1.1 lentelė. Russell‘o priedančio audinių indekso požymiai ir jų įvertinimas
Balai* Klinikiniai požymiai Radiologinių tyrimų duomenys 0 Nėra priedančio audinių uždegimo, funkcija
nesutrikusi –
1 Lengvo laipsnio gingvitas, dalies laisvojo dantenų
krašto uždegimas –
2 Gingvitas, viso laisvojo dantenų krašto
uždegimas, epitelinė jungtis nesuardyta –
4 Sunkaus laipsnio gingivitas, vietomis pažeista epitelinė jungtis
Pradinė tankiosios plokštelės rezorbcija
6 Sunkaus laipsnio gingvitas, pažeista epitelinė jungtis ir susiformavusios dantenų kišenės. Kramtymo funkcija nepažeista, dantys nepaslankūs
Išreikšta horizontali kaulo rezorbcija
8 Sunkaus laipsnio priedančio audinių uždegimas su funkcijos pažeidimu: paslankūs dantys
Ryški horizontali ir vertikali kaulo rezorbcija, siekianti daugiau kaip 1/3 danties šaknies ilgio
*PI = Balų suma/dantų skaičius
Laboratoriniai kraujo tyrimai
Nustatyta tiriamųjų morfologinė periferinio kraujo sudėtis: eritrocitų skaičius, hemoglobino kiekis kraujyje, bendras leukocitų skaičius – F. Bayer‘io hematologiniu kraujo analizatoriumi ADVIA 2120 (Siemens Healthcare Diagnostics, Dublin, Ireland).
4.2.2. Neutrofilų oksidacinės funkcijos įvertinimas nuo luminolo ir lucigenino priklausomos chemiliuminescencijos metodais
Leukocitų paruošimas
Leukocitai išskirti spontaninės sedimentacijos Hirschhorn‘o ir Weiss-mann‘o (1965) metodu [121] iš sergančių priedančio audinių uždegimu (n=22) ir su sveikais priedančio audiniais asmenų (n=21). Rytą iš neval-giusių tiriamųjų steriliais švirkštais buvo paimama 12–15 ml periferinio kraujo. Krešėjimo procesui sustabdyti vartotas heparinas (20 vv/ml). Plastikiniai mėgintuvėliai su krauju buvo dedami į šaldytuvą ir laikomi 90
min. esant 4ºC. Po to gausi leukocitais plazma buvo nusiurbiama ir nustatomas joje leukocitų skaičius bei jų morfologinė sudėtis. Panaudojus neląstelinę plazmą, gautą nucentrifūgavus (esant ×2500 g) likusį kraują, neutrofilų skaičius plazmoje prilyginamas 1×106 ląstelių/ml. Taip paruošta plazma išpilstoma po 1 ml į chemiluminescencijai tirti skirtus mėgin-tuvėlius.
Neutrofilai sudaro pagrindinę leukocitų suspensijos, paruoštos tirti chemiliuminescensijos metodu, dalį [160], todėl aktyvintos ar neaktyvintos chemiliuminescencijos intensyvumas tiesiogiai priklauso nuo neutrofilų skaičiaus leukocitų suspensijoje. Neutrofilų sukelta chemiliuminescencija gali būti apskaičiuojama pagal formulę [139] iš bendros leukocitų chemi-liuminescencijos:
INL =Ileuk×100 V
vcn.
Čia INL – neutrofilų chemiliuminescencija; Ileuk – leukocitų suspensijos chemiliuminescencija; V – tyrimams naudoto indelio tūris; v – suspensijos kiekis (ml); c – leukocitų kiekis; n – neutrofilų procentas.
Mes atsisakėme Ficoll-Hypague gradiento metodo gryniems neutrofiams išskirti, kadangi yra duomenų [218], jog šiuo metodu gauti neutrofilai esti aktyvinti.
Mūsų pasirinkti leukocitų išskyrimo ir chemiliuminescencijos mėginių paruošimo būdai leidžia sukurti sąlygas, atitinkančias dantenų vagelių są-lygoms.
Daugelis medžiagų yra naudojama, kad aktyviųjų deguonies formų skleidžiamą energiją paverstų šviesa (chemiliuminescencija). Luminolas (5-amino-2,3-dihidro-1,4-ftalazindionas) ir lucigeninas (bis-N-metilokridino nitratas) yra dažniausiai naudojami atliekant aktyviųjų deguonies formų tyrimus dėl palyginti nesudėtingos tyrimo metodikos ir didelio jautrumo [58]. Taikant šią metodiką, galima registruoti bendrą (intraląstelinę ir ekstraląstelinę) aktyviųjų deguonies formų gamybą. Vienas svarbus šio metodo požymių – luminolo skleidžiamą šviesą sužadina mieloperoksidazės metabolitai [256]. Mieloperoksidazė sudaro nuo deguonies nepriklausomą neutrofilų oksidacinės baktericidinės sistemos dalį.
Nuo deguonies priklausomos leukocitų oksidacinės baktericidinės siste-mos pirmtakas yra superoksido anijonas, kuris pasigamina deguonies ir leukocitų membranoje esančios NADPH-oksidazės reakcijos metu [11]. Jam nustatyti naudojama lucigenino tyrimo metodika [91, 256].
Neutrofilams aktyvinti naudojami įvairūs tirpūs ar dalelių pavidalo aktyvikliai: opsonizuoti ir neopsonizuoti mikroorganizmai, chemoatrak-tantai, kai kurie citokinai, forbolio esteriai, kalcio jonoforos bei įvairūs lek-tinai. Mes neutrofilams aktyvinti pasirinkome neopsonizuotas Escherichia coli (ATCC25922) bakterijas, kaip vienas iš gramneigiamų fakultatyviųjų
anaerobinių bakterijų.
Aktyviųjų deguonies formų gamybos nustatymui luminolu mes taikėm Dahlgren‘o ir Karlsson‘o (1999) pasiūlytą metodiką [58], o lucigeninu – Korkinos ir kt. (1992) pasiūlytą metodiką [139].
Traumeel S poveikio in vitro aktyviųjų deguonies formų gamybai
įvertinimas nuo luminolo priklausomos chemiliuminescencijos metodu Reakcija atliekama Dahlgren‘o ir Karlsson‘o (1999) pasiūlytu metodu [58]. Į chemiliuminescencijai skirtus mėgintuvėlius įpilame po 1,0 ml plazmos su 1×106 leukocitų ir laikome 5 min. vandeniniame termostate esant 370C. Po to į kontrolinius mėgintuvėlius įdedame 10 μl luminolio ir matuojame neaktyvintų neutrofilų aktyviųjų deguonies formų gamybą. Į tiriamuosius mėgintuvėlius sudedame po 10 μl Traumeel S tirpalo ar buferio ir inkubuojame 10 min. Vėliau dedame 10 μl luminolio ir matuojame
Traumeel S poveikį neaktyvintų neutrofilų aktyviųjų deguonies formų
gamybai. Po to dedame 10 μl Escherichia coli (1×108 ląstelių/ml) ir kas 10 min. matuojame leukocitų chemiliuminescencijos lygį (blyksniai/min.). Matavimas atliekamas 120 min., Lietuvos sveikatos mokslų universiteto medicinos akademijos biochemijos katedroje, – sinciliaciniu ß-skaitikliu
(Delta-300, Tracor Analytic, Elk Grove, Illinois, USA).
Traumeel S poveikio in vitro superoksido anijono gamybai įvertinimas
nuo lucigenino priklausomos chemiliuminescencijos metodu.
Nuo lucigenino priklausoma chemiliuminescencija yra specifinis neutrofilų produkuojamo superoksido anijono įvertinimo metodas [256]. Nuo lucigenino priklausoma chemiliuminescencija matuojama analogiškai nuo luminolo priklausomos chemiliuminescencijos metodui, tik vietoj luminolo dedama 10 μl lucigenino.
Traumeel S in vitro įtakos tiriamųjų grupių periferinio kraujo
neut-rofilams nuo luminolio- ir lucigenino-priklausomos chemiliuminescencijos matavimai buvo atlikti Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos Biochemijos katedroje, – sinciliaciniu ß-skaitikliu (Delta-300,
4.2.3. Preparato Traumeel S poveikio in vitro periferinio kraujo, plazmos ir serumo redukcinėms savybėms nustatymas
Kraujo mėginių ruošimas
Tiriamiesiems asmenims (n=21 sergančiųjų priedančio audinių užde-gimu ir n=22 sveikų asmenų grupės) iš ryto, nevalgius steriliais švirkštais buvo paimama 15–20 ml periferinio kraujo. Krešėjimo procesui sustabdyti vartotas heparinas (20 vv/ml).
Nitromėlio tetrazolio kraujo redukcijos reakcijos atlikimas
Nitromėlio tetrazolio redukcijos reakcija buvo atlikta pagal Demehin ir kt. (2001) pasiūlytą metodiką [65]. Į 6 mėgintuvėlius buvo supilstoma po 1,6 ml paimto kraujo ir sudedame į 3 mėgintuvėlius Traumeel S tirpalo
(galutiniame 10–4 praskiedime) į kitus 3 – atitinkamą kiekį fosfatinio buferio ir inkubuojame 10 min. Po to įdedama nitromėlio tetrazolį (galutinė koncentracija 100 μM). Mėgintuvėliai buvo inkubuojami vandeniniame termostate 20 min. esant 37°C temperatūrai. Po to mėgintuvėliai buvo centrifuguojami 10 min. (esant 1500 g) ir supernatantas buvo tiriamas spektrofotometru CF-26 (LOMO, Russia) (bangos ilgis 570nm, kiuvetės storis 2 mm). Gauti duomenys buvo vertinami šviesos laidumo pokyčio procentais.
Nitromėlio tetrazolio kraujo plazmos redukcijos reakcijos atlikimas Mėgintuvėlis su likusiu krauju (10-15 ml) buvo dedamas į šaldytuvą ir laikomas 60 min. esant 4°C. Po to plazma buvo nusiurbiama ir nustatomas joje leukocitų skaičius bei jų morfologinė sudėtis. Panaudojus kraujo serumą, gautą nucentrifūgavus (10 min., esant ×2500 g) likusį kraują, neutrofilų skaičius tiriamoje plazmoje prilyginamas 1×106 ląstelių/ml. Taip paruošta plazma išpilstoma po 0,8 ml į 6 plastikinius mėgintuvėlius. Nitromėlio tetrazolio redukcijos reakcija buvo atlikta analogiškai pagal anksčiau aprašytą metodiką
Nitromėlio tetrazolio kraujo serumo redukcijos reakcijos atlikimas Likęs serumas buvo išpilstomas po 0,8 ml į 6 plastikinius mėgintuvėlius ir tyrimas atliekamas pagal anksčiau aprašytą metodiką. Šiuo atveju galutinė nitromėlio tetrazolio koncentracija siekė 40 μM.
Kiekvieno tiriamojo kraujas buvo tiriamas spektrofotometru. Spektrofo-tometro kalibracija buvo atlikta kiekvienam tyrimui individualiai atsižvel-giant į tai, kad kiekvieno tiriamojo kraujas turėjo specifinius kraujo spalvos ypatumus.
4.3. Reagentai
Luminolas, lucigeninas, Hanks‘o subalansuotas druskų tirpalas, dimetil-sulfoksidas ir nitromėlio tetrazolis buvo įsigyti iš „Sigma chemical Co St. Luis Mo“ (JAV), chemiliuminescencijai skirti mėgintuvėliai ir kitos plas-tikinės priemonės – iš „Care Rot GmbH and Co KG“.
Preparatas Traumeel S (injekcijų tirpalas ampulėse) buvo įsigytas iš
Biologische Heilmittel Heel GmbH (Baden-Baden, Germany). Tiriant buvo naudotas 1:10000 Traumeel S tirpalas Hanks‘o subalansuotame druskų
tirpale. Literatūroje nurodoma [213], kad didžiausias šio preparato efekty-vumas išryškėja jo praskiedimui esant 1:1000-1:1000000.
Escherichia coli štamo ATCC25922 paros kultūra buvo išauginta
Lietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų mikrobiologijos laboratorijoje. Prieš naudojant, Escherichia coli kultūrą,
nuo maitinamos terpės buvo nuplaunama Hanks‘o subalansuotu druskų tirpalu ir ląstelių kiekis nuoplovose buvo prilyginamas 8×107/l.
Luminolas ir lucigeninas buvo ištirpinami dimetilsulfokside iki 50 mM. Darbinis jų tirpalas (0,5 mM) buvo atskiedžiamas kiekvieną tyrimo dieną Hanks‘o subalansuotų druskų tirpalu.
4.4. Statistinė analizė
Kiekvieno eksperimento metu buvo atliekami mažiausiai 3 identiški tyrimai. Tai leido gauti mažesnį duomenų išsibarstymą. Skaičiuotos vidu-tinės reikšmės ir standartinė paklaida (v±sp). Statistinių hipotezių reikš-mingumo lygmeniu buvo pasirinkta: 0,05 – statistiškai reikšminga, 0,01 – labai reikšminga.
Duomenų analizė atlikta panaudojant statistinės analizės programas PASW Statistics 18 ir PASS 11. Skirtumams tarp grupių nustatyti buvo taikyta neparametrinė vienfaktorinė dispersinė analizė – tikslus Kruscal Walis testas. Testo galingumas buvo įvertinamas modeliavimo būdu (PASS 11 procedūra „One-Way analyse of Variance (Simulations)“). Daugkartiniai poriniai palyginimai (post hoc) buvo atlikti Dunns’o testu, kurio galingumas buvo įvertinamas taip pat modeliavimo būdu (PASS 11 procedūra “Pair-Wise Multiple Comparisons (Simulations)”).
Imčių dydžių nustatymui buvo pasirinkta I tipo klaida α = 0,05 ir II tipo
klaida β = 0,2. Taikant šiuos metodus buvo nustatyta, kad reikiamas imties
5. REZULTATAI
5.1. Klinikinių ir laboratorinių tyrimų duomenys
Klinikiniai tyrimų duomenys rodo, kad abiejų tiriamųjų grupių asmenys amžiumi reikšmingai nesiskyrė (p>0,05): sveikųjų grupės amžiaus vidurkis sudarė 31,6±4,2 metų, o sergančiųjų priedančio audinių uždegimu – 35,8±4,5 metų. Tiriamųjų grupės reikšmingai (p<0,01) skyrėsi priedančio audinių būklę atspindinčiu priedančio audinių indeksu (PI). Sveikų asmenų PI buvo lygus 0,02±0,01, o sergančiųjų priedančio audinių uždegimu PI – 6,91±0,32.
5.1.1 lentelėje pateikti tiriamųjų grupių periferinio kraujo hemoglobino kiekis, eritrocitų ir leukocitų skaičius. Iš joje pateiktų duomenų matyti, kad minėtų grupių asmenų periferinio kraujo hemoglobino kiekis ir eritrocitų skaičius reikšmingai nesiskyrė (p>0,05), tačiau leukocitų skaičius statis-tiškai patikimai (p<0,05) skyrėsi. Didžiausias leukocitų skaičius 6,7±0,4 buvo sergančiųjų priedančio audinių uždegimu, o sveikų asmenų jis siekė 5,6±0,3.
5.1.1 lentelė. Tiriamųjų grupių asmenų periferinio kraujo tyrimo duomenys
Tiriamosios grupės Hemoglobino
kiekis (g/l) Eritrocitų skaičius (×1012/l) Leukocitų skaičius (×109/l) Sveikųjų n=36 132,3±1,5 4,4±0,3 5,6±0,3 Sergančiųjų priedančio audinių uždegimu n=32 130,1±2,3 4,3±0,2 6,7±0,4 p >0,05 >0,05 <0,05
Atskirų leukocitų formų skaičius bei jų sudėtis procentais pateikta 5.1.2 lentelėje. Iš joje pateiktų duomenų matyti, kad neutrofilų skaičius bei jų sudėtis procentais periferiniame kraujyje – abiejų tiriamųjų grupių asmenų reikšmingai nesiskyrė (p>0,05). Limfocitų skaičius bei jų sudėtis procentais buvo reikšmingai didesnė sergančiųjų priedančio audinių uždegimu kraujyje (p<0,01). Tiriamųjų grupių asmenų periferinio kraujo eozinofilų ir monocitų skaičius bei sudėtis procentais reikšmingai nesiskyrė (p>0,05).
