LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS
MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABORATORIJA
ALINA KONDRATOVIČ
VARFARINO FARMAKOGENETIKA: CYP4F2 RS1558139
GENOTIPO SVARBA DOZUOJANT VARFARINĄ
Magistro baigiamasis darbas
Darbo vadovas
dr. Vacis Tatarūnas
2
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
FARMACIJOS FAKULTETAS
LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS
KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS
MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABORATORIJA
TVIRTINU:
Farmacijos fakulteto dekanas Prof.dr. Vitalis Briedis
Data
VARFARINO FARMAKOGENETIKA: CYP4F2 RS1558139 GENOTIPO
SVARBA DOZUOJANT VARFARINĄ
Magistro baigiamasis darbas
3
TURINYS
SANTRAUKA ... 5 SUMMARY ... 6 SANTRUMPOS ... 7 ĮVADAS ... 8DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ... 9
1. LITERATŪROS APŽVALGA ... 10
1.2. Varfarinas ... 10
1.2.1. Varfarino veikimo mechanizmas ir metabolizmas ... 11
1.2.2. Tarptautinio normalizuoto santykio (TNS) rodiklio įtaka varfarino dozei ... 13
1.2.3. Klinikinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui ... 14
1.2.4. Genetinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui ... 15
1.3. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo principo panaudojimas genų polimorfizmo nustatymui ... 16
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI ... 18
2.1. Tyrimo organizavimas ... 18
2.2. Tyrimo objektas ... 18
2.3. Mėginių imties parinkimas ... 19
2.4. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcija ... 20
2.4.1. Mėginio paruošimas ... 20
2.5. Statistinės analizės metodai ... 23
3. REZULTATAI ... 24
3.1. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amžių ir lytį ... 24
3.2. Amiodarono vartojimo įtaka varfarino dozavimui įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu ... 24
3.3. Genotipų įtaka varfarino dozavimui ... 25
3.3.1. CYP2C9 įtaka dozuojant varfariną ... 25
4
3.3.3. CYP4F2 rs1558139 įtaka varfarino dozavimui ... 28
4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 29
5. IŠVADOS ... 31
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS ... 31
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 32
8. PRIEDAI ... 37
8.1. LSMU KI MKL taikoma DNR ekstrakcijos metodika ... 37
5
SANTRAUKA
A.Kondratovič magistro baigiamasis darbas/ mokslinis vadovas dr. Vacis Tatarūnas; Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorija. – Kaunas.
Pavadinimas: Varfarino farmakogenetika: CYP4F2 rs1558139 genotipo svarba dozuojant
varfariną.
Tyrimo tikslas: Išsiaiškinti, kokią įtaką daro klinikiniai ir genetiniai faktoriai varfarino
dozavimuivartojimo pradžioje ir ilgalaikio gydymo metu ligoniams po širdies vožtuvų operacijos.
Tyrimo uždaviniai: 1. Įvertinti, kokią įtaką amiodarono vartojimas daro varfarino dozavimui
po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu. 2. Ištirti CYP2C9 ir VKORC1 polimorfizmo įtaką varfarino dozavimui po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu. 3. Ištirti CYP4F2 rs1558139 polimorfizmo įtaką varfarino dozavimui po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu.
Tyrimo objektas ir metodai: Šiame tyrime dalyvavo 91 pacientas, kuriam buvo pasiekta ir
mažiausiai 2 palaikyta stabili varfarino dozė, reikalinga normaliam TNS rodikliui (2 – 3,5), iki išrašant pacientus iš ligoninės. Iš viso 72 pacientai, vartoję varfariną mažiausiai 3 mėnesius, dalyvavo tolesniame tyrime. 38 (52,8 %) pacientai buvo vyrai ir 34 (47,2 %) moterys. DNR ekstrakcija, DNR kokybės įvertinimas ir tikro laiko polimerazės grandininė reakcija (TL-PGR) buvo atlikta Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje. Genotipų paplitimas yra išreikštas % (procentais). Varfarino dozė yra pateikta kaip vidurkis ±SD (standartinis nuokrypis). p<0,05 reikšmė buvo laikoma statistiškai reikšminga.
Rezultatai:Vyrai (60,7±12,8) buvo jaunesni nei moterys (67,2±9,2, p=0,01). Amiodarono
nevartojantiems pacientams (87,5%) reikėjo mažesnės varfarino dozės ilgalaikio gydymo metu (5,2±1,9 mg), nei išrašant juos iš ligoninės(6,1±2,8 mg, p=0,05). Hospitalizavimo metu 26 (36,1%) pacientai vartojo amiodaroną, o ilgalaikio gydymo metu – tik 9 pacientai (12,5%).Nebuvo pastebėta ženklaus poveikio varfarino dozei pacientams, turintiems CYP2C9*2, CYP2C9*3 ir VKORC1 C1173T genotipus. Buvo pastebėtas varfarino dozės sumažėjimas pacientams, turintiems CYP4F2 rs1558139 G/G genotipą (nuo 6,3±2,9 mg iki 4,9±2,0 mg, p=0,07). Nebuvo nustatyta daugiau faktorių, turinčių įtakos nuolatiniam varfarino vartojimui indukcijos ir ilgalaikio gydymo metu.
Išvados: 1. Ilgalaikio gydymo metu tiek amiodarono nevartojantiems pacientams, tiek ir jį
6
SUMMARY
A. Kondratovič final master‘s thesis/ research supervisor dr. Vacis Tatarūnas; Lithuanian University of Health Sciences, Institute of Cardiology, Laboratory of Molecular Cardiology – Kaunas.
Title: Pharmacogenetics of warfarin: the impact of CYP4F2 rs1558139 genotype on warfarin
dosage.
The aim of the study: To show the influence of clinical and genetic factors on warfarin
dosage during induction and long-term treatment in patients who followed heart valve surgery.
The objectives of the study: 1. To determine the impact of amiodarone usage on warfarin
dosage after heart valve surgery during induction and long-term treatment. 2. To evaluate the influence of CYPC9 and VKORC1 genetic polymorphism on warfarin dosage after heart valve surgery durint induction and long-term treatment. 3. To determine the impact of CYP4F2 rs1558139 gene polymorphism on warfarin dosage after heart valve surgery durint induction and long-term treatment.
Objects ant methods: This study involved 91 patient who reached stable warfarin dosage
(the therapeutic range of INR (from 2 to 3.5) was achieved and maintained for two days of treatment) during discharge from the hospital. Totally 72 patients, who used warfarin for at least 3 months, were included into the further study. Study involved 38 (52.8 %) men and 34 (47.2 %) women. DNA extraction, DNA quality assessment and real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) were performed at the laboratory of Molecular Cardiology of LUHS.Prevalence of genotypes is presented in % (percent). Warfarin dosage is presented as mean ±SD. A p value<0.05 was considered as significant.
Results: Men (60.7±12.8) were younger than women (67.2±9.2, p=0.01). Amiodarone
non-users (87.5%) required lower warfarin dosages during long-term treatment (LTT) – (5.2±1.9 mg) than during discharge from the hospital - (6.1±2.8 mg, p=0.05). During hospitalization, 26 patients (36.1%) received amiodarone therapy. During LTT it was used by only 9 patients (12.5%). No significant effect on warfarin dosage was determined in carriers of CYP2C9*2, CYP2C9*3 and VKORC1 C1173T genotypes. The tendency in decrease of warfarin dosage was observed in patients, carrying CYP4F2 rs1558139 G/G genotype (from 6.3±2.9 mg to 4.9±2.0 mg, p=0,07). No other factors were identified to have an impact on daily warfarin dosage during induction and during LTT.
Conclusions: 1. Both amiodarone users and non-users required significantly lower warfarin
7
SANTRUMPOS
KH2 – vitamino K redukuota forma;CYP2C9 – citochromo P450 superšeimos 2 šeimos C pošeimio 9 polipeptidas; VKORC1 – vitamino K oksidreduktazės komplekso 1-as subvienetas;
CYP4F2 – citochromo P450 superšeimos 4 šeimos F pošeimio 2 polipeptidas; DNR – deoksiribonukleorūgštis;
PGR – polimerazės grandininė reakcija;
TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija (angl. Real-time polymerase chain reaction –
RT-PCR);
MKL – molekulinės kardiologijos laboratorija; Ph. Eur. – Europos farmakopėja;
ŽLA – žmogaus leukocitų antigenas (anlg. Human leukocyte antigen – HLA);
8
ĮVADAS
Kraujo krešėjimas – tai viena svarbiausių apsauginių organizmo funkcijų, mechaninio pažeidimo atveju suformuojanti kraujo krešulį ir taip apsaugant nuo nukraujavimo. Ši funkcija pirmąjį kartą buvo paminėta Hipokrato, apie 460-377 metus prieš Kristų [1]. Plačiau kraujo krešėjimas pradėtas nagrinėti XX amžiaus pradžioje, o XX a. antroje pusėje buvo sukurtas „kaskadų“ modelis, paaiškinantis kraujo krešėjimo mechanizmą [2,3].
Itin svarbią vietą tarp šių dienų susirgimų užima kraujo krešėjimo sutrikimas – padidėjusi kraujo koaguliacija. Dėl padidėjusio kraujo krešumo atsirandus tromboembolinėms komplikacijoms ir sutrikus normaliai tam tikro audinio, organo ar viso organizmo kraujotakai pablogėja jų aprūpinimas deguonimi ir kitomis gyvybiškai svarbiomis medžiagomis, kas gali sukelti ląstelių žūtį [4].
Diagnozavus padidėjusio kraujo krešėjimo sutrikimą, svarbu kuo greičiau parinkti efektyvų gydymą. Vienas dažniausiai padidėjusiai kraujo koaguliacijai skiriamų vaistų pasaulyje yra netiesioginio veikimo antikoaguliantas varfarinas [5]. Nepaisant to, kad varfarinas yra dažnai skiriama gana efektyvi ir nebrangi padidėjusios koaguliacijos gydymo priemonė, optimalų efektyvumą yra sudėtinga pasiekti dėl siauro terapinio lango, tai yra, dėl komplikuoto dozavimo [6].
Pastebėjus, kadvienodos varfarino dozės vieniems pacientams sukelia hemoragines komplikacijas, kitiems – kraujo krešėjimo padidėjimą, o trečius veikia optimaliai, buvo imta nagrinėti įvairius faktorius, kurie gali daryti tam įtaką [6]. Siekiant išvengti kraujavimų rizikos ir pasiekti pakankamą varfarino poveikį, labai svarbu nustatyti ir įvertinti visus galimus faktorius, jų poveikius ir atsižvelgiant į vertinimo rezultatus sudaryti dozavimo algoritmą kiekvienam pacientui individualiai.
Šiame darbe yra aptariami ir vertinami klinikiniai ir genetiniai veiksniai, darantys įtaką varfarino dozavimui gydymo pradžioje ir ilgalaikio vartojimo atveju. CYP4F2 rs1558139 genotipo svarba varfarino dozavimui iki šiol nebuvo tirta, todėl šio tyrimo atlikimo metu gauti rezultatai suteikia daugiau informacijos ir padeda paskirti tinkamesnę varfarino dozę CYP4F2 rs1558139 genotipą turinčiam pacientui.
9
DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – Išsiaiškinti, kokią įtaką daro klinikiniai ir genetiniai faktoriai varfarino
dozavimui vartojimo pradžioje ir ilgalaikio gydymo metu ligoniams po širdies vožtuvų operacijos.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti, kokią įtaką daro amiodarono vartojimas varfarino dozavimui po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu.
2. Ištirti CYP2C9 ir VKORC1 polimorfizmo įtaką varfarino dozavimui po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu.
10
1. LITERATŪROS APŽVALGA
1.2. Varfarinas
Varfarinas – vienas plačiausiai vartojamų netiesioginio poveikio antikoaguliantų, peroraliai vartojamas varfarino natrio druskos pavidalu [5, 7]. Varfarino natrio druska (1 pav.), balti, higroskopiški, amorfiniai vandenyje ir etanolyje gerai tirpūs milteliai, yra enantiemerų mišinys, kurį sudaro (R)-varfarino ir (S)-varfarino mišinys [8, 9, 10, 11]. Varfarino (S)-enantiomeras pasižymi stipreniu kraujo krešėjimą stabdančiu poveikiu, nei varfarino (R)-enantiomeras [11].
1 pav. Varfarino natrio druskos struktūrinė formulė [9]
Didžiausia varfarino koncentracija kraujyje yra pasiekiama praėjus 4 valandoms po vaisto peroralinio suvartojimo, tačiau antikoaguliacinis poveikis pasireiškia tik per artimiausias 24 valandas, stipriausias povekis - po 72 – 96 valandų, ir šis trunka nuo 2 iki 5 dienų [12]. Labai didelė absorbuoto varfarino dalis rišasi su kraujo plazmos baltymais, todėl laisvo vaisto koncentracija kraujyje siekia vos 1 % [12].
Kadangi varfarinas neleidžia susidaryti krešuliams ir taip pagerina kraujotaką, jis yra dažnai skiriamas pacientams kaip profilaktinė arba gydomoji priemonė, diagnozavus šiuos sutrikimus:
pasireiškus trumboembolinėms komplikacijoms, kurios atsiranda dėl prieširdžių virpėjimo, skiriant kaip gydomąją priemonę;
tromboembolinių sutrikimų, galinčių atsirasti dėl prieširdžių virpėjimo, atvejais, skiriant kaip profilaktinę priemonę;
esant miokardo infarkto pasikartojimo rizikai, kaip profilaktinė priemonė;
atsiradus tromboembolinėms komplikacijoms po širdies vožtuvo pakeitimo operacijos, kaip gydomoji priemonė;
11
plaučių embolijos gydymui arba profilaktikai;
pacientams po miokardo infarkto, kaip trombozės profilaktikos priemonė, siekiant išvengti tromboembolinių komplikacijų ir sumažinti mirties po miokardo infarkto riziką;
venų tromboembolijos atveju, kaip gydomoji ar profilaktinė priemonė, esant pasikartojančioms tromboembolinėms situacijoms [12].
Pasireiškus per nelyg stipriam antikoaguliaciniam varfarino poveikiui ir atsiradus kraujavimams ar kitiems vaisto šalutiniams poveikiams yra privalu imtis atsargumo priemonių, tokių kaip dozės koregavimas [13]. Ūmių situacijų atvejais varfarino vartojimas nutraukiamas ir yra skiriamas vartoti varfarino antidotas - vitaminas K, kadangi varfarinas dalyvauja vitamino K cikle, kuris yra susijęs su kraujo krešėjimu [13, 14].
1.2.1. Varfarino veikimo mechanizmas ir metabolizmas
Normalaus vitamino K ciklo, susijusio su kraujo krešėjimu, metu vyksta du pagrindiniai procesai:
1) γ-karboksilinimo metu nuo vitamino K priklausomi II, VI, IX, X krešėjimo faktoriai ir krešėjime dalyvaujantys C, S ir Z baltymai iš neaktyvių formų tampa aktyviomis; 2) tuo pat metu turi dalyvauti vitamino K redukuota forma (KH2), kuri proceso metu yra
paverčiama neaktyvią oksiduotą vitamino K forma [13].
Tuomet neaktyvi vit. K forma vitamino K oksido-reduktazės yra paverčiama į vitaminą K, kuris dėl vit. K1 reduktazės (VKORC1) vėliau virsta vitaminu KH2 [13].
Vitamino K antagonisto varfarino veikimas pasireiškia dėl VKORC1 slopinimo (2 pav.), ko pasekoje neaktyvi oksiduota vit. K forma nevirsta redukuotu vitaminu KH2 [14]. Dėl vitamino K
12
2 pav. Varfarino veikimo mechanizmo ir metabolizmo schema [15]
Varfarinas yra metabolizuojamas kepenyse, dalyvaujant citochromo P450 sistemos fermentams [12, 14]. Kadangi vartojamas varfarinas yra (R)-varfarino ir (S)-varfarino enantiomerų raceminis mišinys, tiek (R)-varfarinas, tiek (S)-varfarinas yra metabolizuojamas atskirai [8, 10, 11, 13]. (R)-enantiomero metabolizmo metu didžioji dalis vaisto yra oksiduojama CYP1A2, CYP3A4 ir CYP2C19 kepenų fermentų, likusi dalis virsta alkoholio derivatais, o beveik visas (S)-enantiomero kiekis yra metabolizuojamas CYP2C9 kepenų fermento [13, 14, 15].
13
1.2.2. Tarptautinio normalizuoto santykio (TNS) rodiklio įtaka varfarino dozei
Norint pasiekti optimalų varfarino efektyvumą, dozė turi būti parenkama ir koreguojama atsižvengiant į konkretaus paciento tarptautinio normalizuoto santykio (TNS) rodiklį [14, 16]. Varfarino dozės parinkimą komplikuoja ypač siauras terapinis langas (3 pav.) [6].3 pav. Varfarino terapinis langas [17]
14
1.2.3. Klinikinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui
Parenkant varfarino dozę įsotinimo fazėje ir ilgalaikio vartojimo metu reikia ne tik stebėti TNS rodiklį, bet ir atsižvelgti į klinikinius faktorius, galinčius daryti įtaką vaisto veikimui [20]. Skiriami šie pagrindiniai faktoriai, darantys įtaką varfarino dozei: amžius, kūno masės indeksas, mitybos įpročiai, lėtinės ligos ir kitų vaistų vartojimas, sukeliantis sąveikas [21].
Nors amžiaus, kūno masės ir mitybos įtaka bei mechanizmai nėra visiškai aiškūs, šie faktoriai daro įtaką paciento organizmo atsakui į varfariną [20]. Jautrumas varfarinui dėl minėtų faktorių įtakos nėra siejamas su konkrečiai vienu iš jų [21]. Pavyzdžiui, amžiaus įtaka gali būti susijusi su vitamino K iš maisto gaunamu kiekiu, kuomet sumažėjus gaunamam vitamino K kiekiui sustiprėja varfarino veikimas [21]. Varfarino poveikio pakitimai, taip pat, gali atsirasti dėl su amžiumi mažėjančio plazmos baltymų kiekiu ir/arba didesnio kūno masės indekso [21]. Tačiau mitybos faktorius, o būtent – vitamino K gavimo su maistu trūkumas ar perteklius, gali daryti itin didelę įtaką varfarino poveikiui [21].
Dažniausiai pasitaikančias lėtines ligas, kurios turi įtakos varfarino dozės parinkimui, galima suskirstyti į: 1.kepenų lėtines ligas, 2.inkstų lėtines ligas, 3.skydliakės lėtines ligas, 4.širdies nepakankamumą [21]. Varfarino poveikiui įtaką, taip pat, gali daryti ūminės ligos ir kraujavimai dėl mechaninių pažeidimų [20]. Esant kepenų lėtinei ligai, varfarino poveikis sustiprėja dėl susilpnėjusios aktyvių krešėjime dalyvaujančių faktorių gamybos [12, 22]. Nepaisant to, kad su šlapimu išsiskiria nedidelė dalis nemetabolizuoto varfarino, o inkstų ligos atveju šlapimo išsiskyrimas sutrinka, vaisto dozės koreguoti nėra būtina [12, 21]. Skydliaukės ligos, hipertiroidizmo, atveju varfarino poveikis dažniausiai silpnėja ir prireikia didesnių dozių, kurios pasiekus normalią skydliaukės būklę turi būti mažinamos, o hipotiroidizmo atveju poveikis dažniausiai stiprėja [12, 21, 22]. Tuo tarpu, pacientams, sergantiems širdies nepankamumu, yra rekomenduojamos mažesnės varfarino dozės, o mechaninių pažeidimų atveju vaisto vartojimą rekomenduojama laikinai nutraukti [12, 21, 22].
Bene svarbiausias ir dažniausiai aptinkamas klinikinis faktorius, darantis įtaką varfarino dozės parinkimui, yra vaistų tarpusavio sąveikos, kurių yra skiriama daugiau nei 200 [16, 21]. Pagal poveikį yra išskirti du vaistų tipai, darantys įtaką varfarino dozei: 1.vaistai, mažinantys TNS rodiklį, tai yra, silpninantys varfarino veikimą; 2.didinantys TNS rodiklį, tai yra, stiprinantys varfarino veikimą [21]. Pastarajam tipui priklausė tokie vaistai, kaip acetaminofenas, amiodaronas, acetilsalicilo rūgštis, ciprofloksacinas, citalopramas, diltiazemas, sertralinas ir kt., o pirmajam – merkaptopurinas, ribavirinas ir kt. [16, 23].
15
tinkamai įvertinus visus klinikinius faktorius bus galima palengvinti tinkamos varfarino dozės nustatymą ir išvengti komplikacijų, atsirandančių dėl per silpno ar per nelyg stipraus veikimo.
1.2.4. Genetinių faktorių įtaka varfarino dozės parinkimui
Varfarino optimalios dozės parinkimui ir koregavimui konkrečiam pacientui įtakos turi ne tik klinikiniai faktoriai ir laboratorinė kontrolė, išreikšta TNS rodikliu. Kitas veiksnys, galintis palengvinti tinkamos dozės parinkimą kiekvienam pacientui individualiai, yra genetinių faktorių įtaka.
CYP2C9
CYP2C9 – tai genas, kuris koduoja citochromo P450 sistemos fermentą-monooksigenazę, metabolizuojantį tokius vaistus, kaip ksenobiotikai, ibuprofenas ir (S)-varfarinas [24]. CYP2C9 genotipą turintiems pacientams yra sunkiau stabilizuoti TNS rodiklį ir dėl pakankamai lėto (S)-varfarino enantiomero metabolizmo bei šalinimo, vartojant įprastas (S)-varfarino dozes, yra padidėjusi kraujavimo rizika [16, 25]. Yra skiriami šie CYP2C9 polimorfizmo variantai: CYP2C9*1*1, CYP2C9*1*2, CYP2C9*1*3, CYP2C9*2*2, CYP2C9*2*3 ir CYP2C9*3*3 [16]. Lyginant skirtingų CYP2C9 polimorfizmo variantų varfarino dozes, didžiausių dozių reikėjo *1*1 alelį turintiems pacientams, o mažiausių - *1*3, *2*3 arba *3*3 alelį turintiems pacientams [16, 25]. *1*2 arba *2*2 alelį turintiems pacientams reikėjo mažesnės vidutinės varfarino dozės nei *1*1 alelį turintiems pacientams, tačiau ne tokios mažos, kaip *1*3, *2*3 arba *3*3 alelį turintiems pacientams [16].
VKORC1
16 CYP4F2
CYP4F2 – tai genas, koduojantis citochromo P450 sistemos fermentą-monooksigenazę, kuris inhibuoja vitaminą K, dalyvaujantį kraujo krešėjimo procese [29, 30]. Šiuo metu yra išskirtas vienas CYP4F2 genotipo polimorfizmo variantas, turintis įtakos varfarino dozavimui – CYP4F2 rs2108622 (CC;CT;TT) (V433M) [31]. CYP4F2 rs2108622CC genotipo variantą turintiems pacientams reikėjo mažesnės vidutinės varfarino dozės, nei pacientams, turintiems rs2108622CT arba rs2108622TT genotipo variantą [31]. Rs2108622TT variantą turinčių pacientų vartota vidutinė varfarino dozė buvo didžiausia [31].
Kitas CYP4F2 genotipo polimorfizmo variantas yra CYP4F2 rs1558139, tačiau iki šiol nebuvo atlikta šio genotipo įtakos varfarino dozės dydžiui tyrimų. Šiuo metu yra nustatyta, kad minėtas genotipas yra susijęs su koronarinių širdies ligų vystymusi kinų populiacijos imtyje [32].
1.3. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo principo panaudojimas
genų polimorfizmo nustatymui
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) – tai paprastas ir greitas DNR fragmentų dauginimo metodas, kurio metu yra gaunamas neribotas kiekis DNR fragmento kopijų [33]. 1983 metais mokslų daktaras Kary Mullis suvokė, jog polimerazės grandininės reakcijos metodas gali būti taikomas kaip būdas kopijuoti ir sistetinti didelius DNR kiekius bei konkrečius DNR fragmentus, taiga, po dviejų metų, 1985-ais mokslininkas su tyrėjų komanda pirmą kartą pateikė savo idėją [34, 35].
Polimerazės grandininė reakcija yra atliekama panaudojant DNR šabloną, kuris gali būti sudarytas iš vienos arba dviejų grandinių [36]. Taip pat, yra reikalingi du olegonukleotidų pradmenys, keturių nukleotidų trifosfatai, karščiui atspari polimerazė, magnio jonai ir buferis. Reakcija yra atliekama vykdant temperatūrų ciklus [36]. Aukšta temperatūra (95° C) yra taikoma norint atskirti dvigubos DNR spiralės vijas, tuomet temperatūra yra sumažinama iki 50° C tam, kad pradmenys sukibtų su šablonu, o, galiausiai, temperatūra yra pakeliama iki 72° C, kuri yra yra optimali polimerazei, įtraukiančiai nukleotidų trifosfatus ir taip prailginančiai pradmenis [36].
Polimerazės grandininę reakciją sudaro 3 pagrindinės stadijos:
1. Denatūracijos stadija - šios stadijos metu temperatūra turi siekti apie 95̊ C, norint išlydyti DNR grandinę ir atskirti ją į dvi vijas, o vėliau į vijų fragmentus;
17
3. Elongacijos stadija - jos metu temperatūra pakyla iki 72̊ C, kad pradmenys būtų prailginti polimerazės [36].
Pasibaigus polimerazės grandininei reakcijai yra atliekama gautų produktų analizė elektroforezės metodu [33].
Tikro laiko polimerazės grandininė reakcija – tai tradicinio polimerazės grandininės reakcijos metodo plėtinys, kuris leidžia ne tik sintetinti DNR molekulės fragmentus, bet tuo pačiu ir atlikti nukleorūgščių kiekybinį nustatymą arbą DNR fragmentų genotipavimą [37].
4 pav. Kairėje - nekomplementarus DNR reagentas, dešinėje – komplementarus [36]
18
2. TYRIMO METODIKA IR METODAI
2.1. Tyrimo organizavimas
Magistro baigiamojo darbo tyrimo organizavimas buvo pradėtas nuo teorinio susipažinimo su mėginio paruošimo tvarka ir stadijomis, būtinomis tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo taikymui, tokiomis kaip:
darbo laboratorijoje taisyklės, naudojamos priemonės ir prietaisai bei higienos reikalavimai, taikytini darbui molekulinės kardiologijos laboratorijoje;
teorinis KI MKL taikomo DNR ekstrakcijos metodo nagrinėjimas, aptariant naudojamus reagentus ir kiekvieno iš jų paskirtį, kuomet rašytinės DNR ekstrakcijos metodikos kopija buvo pateikta laboratorijos darbuotojų;
teorinis reakcijos mišinio su DNR paruošimas - reakcijos mišinio su DNR paruošimo metodikos teorinis nagrinėjimas ir kilusių klausimų aptarimas;
kriterijų, pagal kuriuos bus atrenkami DNR mėginiai, pasirinkimas;
DNR mėginių kiekio, kaip visos mėginių imties, pasirinkimas;
DNR mėginių kiekio vienam tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos tyrimui pasirinkimas.
2.2. Tyrimo objektas
Tyrimas buvo atliekamas suLietuvos sveikatos mokslų universiteto ligoninės Kauno klinikų (LSMUL KK) pacientų periferiniu krauju, paveiktu antikoaguliantu. Periferinio kraujo ėminiai, iki DNR ekstrakcijos atlikimo, kambario temperatūroje buvo laikomi ne ilgiau kaip 24 val., o šaldytuve- 4oC ne ilgiau kaip vieną savaitę.
DNR išskyrimas
Paėmus pacientų periferinio kraujo su antikoaguliantu mėginius, buvo atlikta DNR ekstrakcija, remiantis LSMU MA Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijojetaikoma metodika, kuri yra pateikta magistro baigiamojo darbo 8.1 priede.
19
DNR koncentracijos matavimas ir kokybės vertinimas
Buvo lašinama po 2 μl DNR mėginio vandeninio tirpalo ant spektrofotometro celės. Kompiuterinėje programoje pažymimas paciento ID ir spaudžiamas mygtukas „measure“. Prieš ir po matavimo spektrofotometro matavimo celęreikėjo nuplauti vandeniu, o vėliau nusausinti. Atliekant DNR koncentracijos matavimą,buvo įvertinama po ekstrakcijos gauto DNR mėginio kokybė.
Po ekstrakcijos ir išeigos kokybės vertinimo, DNR mėginiai buvo užšaldyti ir laikomi šaldiklyje, -24 oC temperatūroje, iki tol, kol pasirinktos imties kraujo DNR mėginiai buvo pradėti
ruošti tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo tyrimui.
2.3. Mėginių imties parinkimas
Tyrimams atsitiktiniu būdu buvo atrenkami ligonių mėginiai, kurių TNS rodiklis buvo (2,0 - 3,5). Remiantis ligos istorijų duomenimis, atrinktų pacientų stabili varfarino dozė, reikalinga pasirinktam TNS palaikyti, buvo pasiekta ir išlaikyta ne mažiau nei 2 dienas iki paciento išrašymo iš LSMUL KK. Pagal šiuos kriterijus tyrimams atrinktas 91 mėginys.
4 pav. Tyrimo dalyvių pasiskirstymas pagal lytį
Norint įvertinti vartojamo varfarino dozės, reikalingos rekomenduojamam TNS palaikyti, kitimus ilgalaikio gydymo metu, iš 91 paciento, į tolesnį tyrimą įtraukti 72. Tinkamais tolesniam tyrimui buvo laikomi tie pacientai, kurie: 1. Atvyko pakartotinai duoti kraujo tyrimams, 2. vartojo antikoaguliantą varfariną ne mažiau kaip 3 mėnesius po išrašymo iš ligoninės. Iš 72 tolesniam tyrimui atrinktų pacientų 34 (47,2%) buvo vyrai (4 pav.) ir 38 (52,8%) moterys (4 pav.).
47,2% 52,8%
20
2.4. Tikro laiko polimerazės grandininės reakcija
Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos tyrimo eigą sudaro du pagrindiniai etapai: 1) Mėginio paruošimas;
2) Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos instrumentinė tyrimų dalis.
Prieš pradedant tyrimą tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu, pirmiausia buvo nustatomas numatomų tą dieną tirti mėginių skaičius. Nuo to priklausė, kiek bus naudojama reagentų. Pasirinkti mėginiai buvo išimami iš šaldiklio ir paliekami kambario temperatūroje atšilti. Mėginiams atšilus buvo imamas ruošti reakcijos mišinys (RM) su DNR mėginiu TL-PGR ištyrimui.
2.4.1. Mėginio paruošimas
Reakcijos mišinys gali būti ruošiamas dviem būdais:
1) Automatine pipete į plokštelę paeiliui išpilstant kiekvieną reagentą atskirai;
2) Apskaičiavus reagentų kiekius, paruošti bendrą reakcijos mišinio tūrį mėgintuvėlyje, ir tuomet išpilstyti jį į plokštelę.
Tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodo tyrimas MKL buvo pradedamas nuo reakcijos mišiniui reikalingų reagentų kiekio apskaičiavimo. Apskaičiavus reagentų kiekius, pradedamas ruošti reakcijos mišinys.
21
Reakcijos mišinį tikro laiko polimerazės grandininei reakcijai sudaro vanduo, TaqMan genotipavimo fermentų mišinys, 4F2 biožymuo ir tiriamo paciento DNR (5 pav.). Reakcijos mišiniui vienam mėginiui paruošti buvo imama 4,3 μl vandens, 5,3 μl TaqMan genotipavimo fermentų mišinio, 0,2 μl 4F2 biožymens ir 1,0 μl DNR (5 pav.).
Reagentų kiekių (μl) skaičiavimai gali būti išreikšti formule: 1) Vb.r.k..=Vp.r.k.x (nmėg.+1);
Vb.r.k..– bendras reagento (Vb.v.k..=vandens /Vb.Tq.k..= TaqMan /Vb.z.k..= 4F2 biožymens) kiekis (μl), ; Vp.r.k.– pradinis reagento (Vp.v.k.=vandens / Vp.Tq.k.=TaqMan / Vp.z.k.= 4F2 biožymens) kiekis (μl); nmėg.– tiriamų mėginių skaičius.
1 lentelė. Sunaudoti reagentų kiekiai Tyrimo eilės numeris Tiriamų DNR mėginių skaičius (vnt.) Kontrolinių mėginių skaičius (vnt.) Bendras mėginių skaičius (vnt.) Vandens kiekis (μl) TaqMan genotipavimo fermentų mišinys (μl) 4F2 biožymuo (μl) DNR kiekis (vienam mėginiui, μl) 1 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1 2 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1 3 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1 4 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1 5 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1 6 12 1 13 60,2 74,2 2,8 1 Iš viso 72 - - 361,2 445,2 16,8 -
Vandens kiekio apskaičiavimo pavyzdys tyrimams Nr.1-6 (1 lentelė): Vb.v.k..=Vp.r.k.x (nmėg.+1)= 4,3μl x (13+1) = 60,2 (μl)
TaqMan genotipavimo fermentų mišinys kiekio apskaičiavimo pavyzdys tyrimams Nr.1-6 (1 lentelė):
Vb.Tq.k..=Vp.Tq.k.x (nmėg.+1) = 5,3 μl x (13+1) = 74,2 (μl)
4F2 biožymens kiekio apskaičiavimo pavyzdys tyrimams Nr.1-6 (1 lentelė): Vb.z.k..=Vp.z.k.x (nmėg.+1)= 0,2 μl x (13+1) = 2,8 (μl).
22
mėginiųskaičius su 1 kontroliniu mėginiu be DNR (1 lentelė). Apskaičiavus reakcijos mišinio reagentus pagal nmėg., dėl automatinių pipečių tūrio matavimo paklaidų, kitų mechaninio darbo
veiksnių, gali atsirasti reakcijos mišinio trūkumas.Norint išvengti šio trūkumo jį pilstant į reakcijos plokštelę, kaip mėginių skaičius buvo imamas (nmėg.+1), kas padidino reakcijos mišinio tūrį ir taip
užtikrino pakankamą jo kiekį.
Apskaičiavus reagentų kiekius, buvo pradedamas ruošti reakcijos mišinys tikro laiko polimerazės grandininei reakcijai:
1) Laminarinėje traukos spintoje buvo išdėstomi visi reikalingi reagentai (vanduo, TaqMan genotipavimo fermentų mišinys 4F2 biožymuo) ir priemonės, tai yra, reikiamo tūrio automatinės pipetės ir automatinių pipečių vienkartiniai antgaliai,plastikinis „Eppendorf“ tipo mėgintuvėlis bei PGR lizdinė plokštelė. Atšilę kraujo DNR mėginiai užkimštuose „Eppendorf“ tipo mėgintuvėliuose buvo centrifuguojami 5 sekundes, norint sutelkti visą mėgintuvėlio turinį. Tuomet mėgintuvėliai buvo išimami iš centrifugos ir perkeliami į laminarą. Taip pat, buvo paruoštas indas panaudotiems vienkartiniams automatinių pipečių antgaliams išmesti. Visas darbo laboratorijoje procesas buvo vykdomas mūvint gumines pirštines.
2) Paruoštas „Eppendorf“ tipo mėgintuvėlis buvo atkemšamas, pagal apskaičiuotus reagentų kiekius nustatomas tam tikro reagento automatinės pipetės paimamas skysčio tūris ir užmautas vienkartinis antgalis. Į mėgintuvėlį buvosupilami paimti vandens (60,2μl), TaqMan genotipavimo fermentų mišinio (74,2μl) ir 4F2 biožymens (2,8μl) kiekiai (1 lentelė), pakeičiant vienkartinį automatinės pipetės antgalį po kiekvieno reagento įpylimo. Pipečių antgaliai buvo keičiami po kiekvieno reagento, siekiant išvengti reagentų originaliose talpyklėse užteršimo.
3) „Eppendorf“ mėgintuvėlis buvo užkemšamas, jo turinys buvo mechaniškai suplakamas ir yra tokiu būdu buvo paruoštas išpilstymui į PGR plokštelę.
23
4) Automatinės pipetės paimamas skysčio tūris buvo nustatomas ties 9,7 μl ir užmaunamas vienkartinis pipetės antgalis. Į kiekvieną iš 13 (1 lentelė) pasirinktų PGR plokštelės (7 pav.) lizdų automatine pipete buvo pilama po 9,7 μl reakcijos mišinio. Kadangi į visus PGR plokštelės lizdus buvo pilamas pagamintas reakcijos mišinys, pipetės antgalis nebuvo keičiamas po skysčio įpylimo į kiekvieną iš lizdų, tačiau buvo pakeistas užpildžius visus reikiamus lizdus reakcijos mišiniu.
5) Tuomet automatinės pipetės paimamas skysčio tūris buvo nustatomas ties 1,0 μl ir išpilstomi pasirinkti kraujo DNR mėginiai. Vienas DNR mėginys buvo pilamas į vieną PGR plokštelės lizdą, kiekvieną kartą įpylus pakeičiant pipetės antgalį. Mėgintuvėliai, kuriuose laikoma DNR, buvo atkemšami tik mėginiui automatine pipete paėmimui, o iškart po paėmimo vėl užkemšami. Taip buvo supilama 12 DNR mėginių į 12 lizdų, o 1 buvo paliekamas kaip kontrolė.
6) Užpildyta PGR plokštelė (plokštelės dalis) užkemšama specialia plėvele ir centrifuguojama 1500-1700 aps./min. 15 sekundžių.
7) Po centrifugavimo plokštelė su mėginiais patalpinama tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos termocikleryje ir reakcija paleidžiama.
2.5. Statistinės analizės metodai
24
3. REZULTATAI
3.1. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal amžių ir lytį
Iš viso tyrimo imtį sudarė 72 pacientai. Tyrime dalyvavo 38 vyrai ir 34 moterys, taigi vyriškosios lyties atstovai sudarė 52,8 %, o moteriškosios - 47,2 % visos tiriamųjų imties (2 lentelė).
Vidutinis tiriamųjų vyrų amžius siekė 60,76 ± 12,80 m. Moterų amžiaus vidurkis buvo 67,20 ± 9,20 m. (2 lentelė). Vyrai buvo statistiškai reikšmingai jaunesni (p=0,01) nei moterys.
2 lentelė. Tiriamųjų pasiskirstymas pagal lytį ir amžių
Lytis Amžius ± SD (metais) n %
Vyras 60,76 ± 12,80 38 52,8
Moteris 67,20 ± 9,20 34 47,2
Iš viso: 63,82 ± 11,69 72 100,0
3.2. Amiodarono vartojimo įtaka varfarino dozavimui įsotinimo ir ilgalaikio
gydymo metu
Iš visų tyrimo dalyvių, išrašant varfariną vartojančius pacientus iš ligoninės, amiodarono nevartojo 46 pacientai, o ilgalaikio gydymo varfarinu metu – 63. Trumpalaikio gydymo metu amiodarono nevartojantys pacientai sudarė 63,9 %, o ilgalaikio gydymo metu – 87,5 % visų tyrime dalyvavusių pacientų (3 lentelė).
25
3 lentelė. Varfarino dozės pokyčiai skirtingu gydymo laikotarpiu amiodarono nevartojantiems pacientams
Iš viso pacientų
Trumpalaikis varfarino vartojimas Ilgalaikis varfarino vartojimas
n % Varfarino dozė ±SD n % Varfarino dozė ±SD n %
72 100,0 6,1 ± 2,8 mg 46 63,9 5,2 ± 1,9 mg 63 87,5
Trumpalaikio gydymo varfarinu metu amiodaroną vartojo 26 pacientai (36,1 %), o ilgalaikio gydymo metu – tik 9 (12,5 %).
Varfarino dozė išrašant pacientus iš ligoninės siekė 4,7 ±2,2 mg. Pastebėjome tendenciją, kad varfarino dozė šiems ligoniams mažėjo ilgalaikio gydymo metu - 3,3 ±1,6 mg (p=0,09).
4 lentelė. Varfarino dozės pokyčiai skirtingu gydymo laikotarpiu amiodaroną vartojantiems pacientams
Trumpalaikis varfarino vartojimas
Ilgalaikis varfarino vartojimas
Varfarino dozė ±SD n % Varfarino dozė ±SD n % 4,7± 2,2 mg 26 36,1 3,3± 1,6 mg 9 12,5
3.3. Genotipų įtaka varfarino dozavimui
3.3.1. CYP2C9 įtaka dozuojant varfariną
CYP2C9 *2 alelis
Iš 72 pacientų, CYP2C9*2 *1/*1 genotipą turinčių buvo 57 (79,2 %), turinčių CYP2C9 *1/*2 genotipą - 14 (19,4 %), o CYP2C9 *2/*2 genotipas buvo nustatytas tik 1 tiriamajam (5 lentelė).
26
*1*2 turintiems pacientams varfarino dozė ilgalaikio vartojimo metu mažėjo iki 4,0 ± 1,6 mg. Šį variantą turintiems tiriamiesiems išrašymo iš ligoninės metu paskirta varfarino dozė buvo 5,0 ± 2,0 mg, p=0,17 (5 lentelė).
*2*2 turintiems paskirta varfarino dozė išrašant iš ligoninės buvo 2,5 mg. Ilgalaikio gydymo metu dozė didėjo iki 3,2 mg varfarino, p=0,07 (5 lentelė).
5 lentelė. CYP2C9*2 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu
CYP2C9* 2 genotipo variantas Pacientų skaičius Trumpalaikis varfarino vartojimas Ilgalaikis varfarino vartojimas p* n % Varfarino dozė ± SD Varfarino dozė ± SD
*1/*1 57 79,2 5,8 ± 2,8 mg 5,3 ± 1,9 mg 0,26
*1/*2 14 19,4 5,0 ± 2,0 mg 4,0 ± 1,6 mg 0,17
*2/*2 1 1,4 2,5 ± 0,0 mg 3,2 ± 0,0 mg 0,07
Iš viso: 72 100,0 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96mg 0,12 * Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.
CYP2C9 *3 alelis
CYP2C9*1*1 turėjo 59 tiriamieji. Tai sudarė 81,9 % visų tiriamųjų. *1*3 tiriamųjų imtyje buvo nustatyta ženkliai mažiau – tik 13 pacientų, kurie sudarė 18,1 % visos imties (6 lentelė). Varfarino dozės pokytis, išrašant pacientus ir ilgalaikio gydymo varfarinu metu, buvo gana ženklus *1*1 turintiems ligoniams: išrašant iš ligoninės - 5,9 ± 2,7 mg, o ilgalaikio vartojimo metu sumažėjo iki 3,7 ± 1,7 mg, tačiau stebėta tik tendencija p=0,16 (6 lentelė).
27
6 lentelė. CYP2C9*3 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu
CYP2C9*3 genotipo variantas n % Trumpalaikis varfarino vartojimas Ilgalaikis varfarino vartojimas p* Varfarino dozė ± SD Varfarino dozė ± SD 1*1 59 81,9 5,9 ± 2,7 mg 3,7 ± 1,7 mg 0,16 1*3 13 18,1 4,3 ± 2,3 mg 5,3 ± 1,8 mg 0,49 Iš viso: 72 100 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96mg 0,12 * Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.
3.3.2. VKORC1 įtaka varfarino dozavimui
T1173T turėjo 8 tiriamieji (11,1 %), C1173T – 35 tiriamieji (40,3 %), C1173C – 29 tiriamieji, kurie sudarė 40,3 % visos tiriamųjų imties (7 lentelė).
11,1 % tiriamųjų, kurie turėjo VKORC1 TT, išrašant iš ligoninės vartojo mažesnes varfarino dozes, nei ilgalaikio vartojimo metu. Išrašant juos iš ligoninės, varfarino dozė buvo 3,1 ± 1,8 mg, o ilgalaikio vartojimo metu padidėjo iki 4,3 ± 1,1 mg, p=0,16 (7 lentelė).
Pacientai, turintys TC, trumpalaikio vartojimo metu vartojo didesnes varfarino dozes, nei vartojant varfariną ilgą laiką, tačiau dozės pokytis nebuvo ženklus. Trumpalaikio vartojimo metu varfarino dozė buvo 5,2 ± 2,5 mg, o vartojant ilgą laiką sumažėjo iki 4,8 ± 1,8 mg, p=0,44 (7 lentelė).
28
7 lentelė. VKORC1 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu
VKORC1 genotipo variantas Pacientų skaičius Trumpalaikis varfarino vartojimas Ilgalaikis varfarino vartojimas p* n % Varfarino dozė ± SD Varfarino dozė ± SD
T1173T 8 11,1 3,1 ± 1,8 mg 4,3 ± 1,1 mg 0,16
C1173T 35 48,6 5,2 ± 2,5 mg 4,8 ± 1,8 mg 0,44
C1173C 29 40,3 5,4 ± 2,1 mg 6,6 ± 2,7 mg 0,06
Iš viso: 72 100,0 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96 mg 0,12 * Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.
3.3.3. CYP4F2 rs1558139 įtaka varfarino dozavimui
Buvo tirti šie CYP4F2 rs1558139 genotipo variantai: G/G, G/A ir A/A. 30,6 % tiriamųjų imties sudarė G/G polimorfizmo variantą turintys pacientai, 50,0 % sudarė heterozigotinis (G/A) genotipo polimorfizmo variantas. CYP4F2 rs1558139 A/A polimorfizmo variantas apėmė tik 19,4 % visos tiriamųjų imties (8 lentelė).
CYP4F2 rs1558139 G/G variantą turinčių pacientų tarpe buvo pastebėtas varfarino dozės sumažėjimas ilgalaikio gydymo varfarinu metu. Išrašant šiuos pacientus iš ligoninės, buvo skiriama 6,3 ± 2,9 mg varfarino dozė. Po 3 mėnesių vartojama varfarino dozė sumažėjo iki 4,9 ± 2,0 mg, p=0.07 (8 lentelė).
G/A genotipas nedarė reikšmingos įtakos varfarino dozės pokyčiams. Išrašant heterozigotinį rs1558139 genotipo polimorfizmą turinčius pacientus iš ligoninės, varfarino dozė buvo 5,5 ± 2,7 mg, o ilgalaikio vartojimo metu sumažėjo iki 5,1 ± 1,8 mg, p=0,46 (8 lentelė).
29
8 lentelė. CYP4F2 rs1558139 įtaka varfarino dozei skirtingu gydymo laikotarpiu
CYP4F2 rs1558139 genotipo variantas Pacientų skaičius Trumpalaikis varfarino vartojimas Ilgalaikis varfarino vartojimas p* n % Varfarino dozė ± SD Varfarino dozė ± SD
G/G 22 30,56 6,3 ± 2,9 mg 4,9 ± 2,0 mg 0,07
G/A 36 50,00 5,5 ± 2,7 mg 5,1 ± 1,8 mg 0,46
A/A 14 19,44 4,8 ± 2,3 mg 4,9 ± 2,3 mg 0,90
Iš viso: 72 100 5,63 ± 2,74 mg 5,02 ± 1,96 mg 0,12 * Trumpalaikio gydymo metu vs ilgalaikio gydymo metu vartota varfarino dozė.
4. REZULTATŲ APTARIMAS
Dėl tromboembolinių kraujotakos sutrikimų yra kreipiama vis daugiau dėmesio į antikoaguliacinį poveikį sukeliančius vaistinius preparatus. Svarbią vietą tromboembolinių ligų gydyme ima užimti naujieji antikoaguliantai, kurie nereikalauja nuolatinės laboratorinės kontrolės ir todėl yra lengviau dozuojami. Tačiau dėl savo didelės kainos gali būti skiriami pakankamai retai [39]. Naujųjų antikoaguliantų skyrimo galimybes taip pat apriboja tinkamo priešnuodžio nebūvimas, kas yra ypač svarbu vaisto perdozavimo atveju ir nežinomos ilgalaikio vartojimo pasėkmės [39].
Varfarinas ir toliau išlieka vienu dažniausiai skiriamų vaistų padidėjusios kraujo koaguliacijos gydymui. Norint patikslinti ir palengvinti nuolatinės varfarino dozės skyrimą skirtingiems pacientams buvo nagrinėjami klinikiniai ir genetiniai veiksniai, galintys daryti įtaką stabilios varfarino dozės dydžiui [40].
30
pacientų, kuriems buvo atlikta širdies vožtuvo operacija, imtyje taip pat buvo pastebėta varfarino dozės mažėjimas pacientams, kurie vartoja amiodaroną [42]. Pacientams, vartojantiems amiodaroną, varfarino dozė buvo mažinama 0,625 – 1,25 mg [42]. Varfarino dozės mažinimo tendencija taipogi buvo pastebėta Brazilijos pacientų imtyje [43]. Pastebėtas varfarino dozės mažėjimas vartojant amiodaroną yra siejamas su varfarino – amiodarono sąveikos, kurios metu amiodaronas sustiprina varfarino poveikį, inhibuodamas citochromo P450 sistemos fermentus, metabolizuojančius antikoaguliantą varfariną [44].
Kitas apžvelgtas veiksnys buvo genetiniai faktoriai, darantys įtaką varfarino dozei. Vertinant CYP2C9 genotipo polimorfizmo variantus, statistiškai patikimų varfarino dozės pakitimų, galėjusių atsirasti dėl CYP2C9*2 ir CYP2C9*3 genotipo variantų, trumpalaikio ir ilgalaikio gydymo metu nustatyta nebuvo, tačiau buvo pastebėta, kad CYP2C9 *1/*1 variantą (halotipą) turintiems pacientams reikėjo didesnės varfarino dozės nei 2C9*2 bei 2C9*3. Analogiški rezultatai buvo gauti tiek europiečių, tiek kaukaziečių kilmės imtyse [45, 46, 47].
Nagrinėjant VKORC1 genotipo polimorfizmo variantų įtaką varfarino dozės pokyčiui trumpalaikio ir ilgalaikio gydymo metu, taip pat, nebuvo nustatyta varfarino dozės kitimų, kuriuos galima būtų laikyti statistiškai patikimais. Tačiau buvo pastebėta, kad vidutinės varfarino dozės ilgalaikio gydymo metu ėmė didėti pacientams, kuriems nustatyti T1173T ir C1173C VKORC1 genotipo polimorfizmo variantai. Kinų populiacijos imtyje buvo nustatyta, kad VKORC1 genotipo AG ir GG variantus turintiems pacientams reikėjo didesnės varfarino dozės nei AA variantą turintiems pacientams [42, 48]. Mažesnės varfarino dozės poreikio tendencija VKORC1 1173C/T genotipą turintiems pacientams buvo pastebėta ir afroamerikiečių bei europiečių kilmės amerikiečių imtyse, tačiau afroamerikiečių imties atstovams reikėjo kiek didesnių varfarino dozių [49].
Kitas nagrinėtas genotipas, darantis įtaką varfarino dozavimui, buvo CYP4F2. Patvirtinti ir išskirti buvo CYP4F2 rs2108622 genotipo polimorfizmo variantai, turintys įtakos varfarino dozės dydžiui: C/T ir T/T polimorfizmo variantus turintiems pacientams reikėjo didesnių dozių nei C/C variantui [50]. Mažesnės dozės poreikis C/C variantui buvo nustatytas ir italų pacientų imtyje [51]. Rs2108622 genotipo C/T ir T/T variantų didesnės varfarino dozės poreikis gali būti siejamas su minėto genotipo savybe lėčiau metabolizuoti vit.K1, dėl ko kepenyse susidaro didesnė vit.K1 koncentracija ir
31
vartojimo metu (4,9 ± 2,0 mg), palyginti su trumpalaikiu varfarino vartojimu (6,3 ± 2,9 mg), p=0.07. Kadangi p>0,05, šis rodiklis nėra laikomas statistiškai patikimu. Norint patikrinti hipotezę, kad CYP4F2 rs1558139 genotipo G/G variantas ilgalaikio vartojimo metu reikalauja varfarino dozės mažinimo, tyrimą reikėtų pakartoti didesnėje pacientų imtyje. Didesnių varfarino dozių poreikis rs1558139 G/G genotipui, kaip ir rs2108622 CT ir TTgenotipams,gali būti susijęs su savybe lėčiau metabolizuoti vitaminą K1, dėl ko vitaminas K ima kauptis kepenyse.
5. IŠVADOS
1. Ilgalaikio gydymo metu tiek amiodarono nevartojantiems pacientams, tiek ir jį vartojusiems, varfarino dozės reikšmingai sumažėjo, palyginus su išrašymo iš ligoninės metu vartotomis varfarino dozėmis.
2. CYP2C9 *1/*1 (*2 alelis), taip pat kaip ir VKORC1 C1173C genotipą, turintiems pacientams reikėjo reikšmingai didesnių varfarino dozių, nei kitokį genotipą turintiems ligoniams.
3. Mažesnių varfarino dozių reikėjo CYP4F2 rs1558139 G/G genotipą turintiems ilgalaikio gydymo metu, nei įsotinant.
6. PRAKTINĖS REKOMENDACIJOS
Reikia atlikti daugiau tyrimų CYP4F2 rs1558139 G/G genotipo įtakos varfarino dozei įvertinti. Tyrimams turėtų būti parenkamos didesnės tiriamųjų imtys.
32
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS
1. Spronk HMH, Govers-Riemslag JWP, ten Cate H. The blood coagulation system as a molecular machine. Bioessays. 2003 Dec 1;25(12):1220–8.
2. Esnouf MP, Macfarlane RG. Enzymology and the Blood Clotting Mechanism. In: Nord FF, editor. Advances in Enzymology and Related Areas of Molecular Biology [Internet]. John Wiley & Sons, Inc.; 1968 [cited 2016 March 3]. p. 255–315. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470122754.ch6/summary.
3. Davie EW. A Brief Historical Review of the Waterfall/Cascade of Blood Coagulation. J Biol Chem. 2003 Dec 19;278(51):50819–32.
4. Gurudevan SV, Malouf PJ, Auger WR, Waltman TJ, Madani M, Raisinghani AB, et al. Abnormal Left Ventricular Diastolic Filling in Chronic Thromboembolic Pulmonary Hypertension: True Diastolic Dysfunction or Left Ventricular Underfilling? Journal of the American College of Cardiology. 2007 Mar 27;49(12):1334–9.
5. Kurnik D, Loebstein R, Halkin H, Gak E, Almog S. 10 years of oral anticoagulant pharmacogenomics: what difference will it make? A critical appraisal. Pharmacogenomics. 2009 Dec 1;10(12):1955–65;
6. Verheugt FWA. Anticoagulant management in the cardiovascular setting. Fundamental & Clinical Pharmacology. 2012 Feb 1;26(1):11–5;
7. O’Reilly RA. Vitamin K and the Oral Anticoagulant Drugs. Annual Review of Medicine. 1976;27(1):245–61;
8. Toon S, Hopkins KJ, Garstang FM, Aarons L, Sedman A, Rowland M. Enoxacin-warfarin interaction: Pharmacokinetic and stereochemical aspects. Clinical Pharmacology &
Therapeutics. 1987 Jul 1;42(1):33–41.
9. European directorate for the quality of medicines and health care. Warfarin sodium. In: European Pharmacopoeia. 7.0 ed. Strasbourg; 2011. p. 3217–8.
10. Kerr JS, Li H-Y, Wexler RS, Robinson AJ, Robinson CS, Boswell GA, et al. THE CHARACTERIZATION OF POTENT NOVEL WARFARIN ANALOGS. Thrombosis Research. 1997 Oct 15;88(2):127–36.
11. Pérez-Andreu V, Roldán V, González-Conejero R, Hernández-Romero D, Vicente V, Marín F. Implications of pharmacogenetics for oral anticoagulants metabolism. Curr Drug Metab. 2009 Jul;10(6):632–42.
33
445/ND_PG/evidencexpert/ND_B/evidencexpert/ND_AppProduct/evidencexpert/ND_T/evide ncexpert/PFActionId/evidencexpert.DoIntegratedSearch?SearchTerm=warfarin&UserSearchT erm=warfarin&SearchFilter=filterNone&navitem=searchALL#close.
13. Nutescu EA, Burnett A, Fanikos J, Spinler S, Wittkowsky A. Pharmacology of anticoagulants used in the treatment of venous thromboembolism. J Thromb Thrombolysis. 2016;41:15–31; 14. Harter K, Levine M, Henderson SO. Anticoagulation Drug Therapy: A Review. West J Emerg
Med. 2015 Jan;16(1):11–7.
15. Moyer TP, O’Kane DJ, Baudhuin LM, Wiley CL, Fortini A, Fisher PK, et al. Warfarin Sensitivity Genotyping: A Review of the Literature and Summary of Patient Experience. Mayo Clin Proc. 2009 Dec;84(12):1079–94.
16. Ageno W, Gallus AS, Wittkowsky A, Crowther M, Hylek EM, Palareti G. Oral Anticoagulant Therapy. Chest. 2012 Feb;141(2 Suppl):e44S – e88S.
17. Blann AD, Fitzmaurice DA, Lip GYH. Anticoagulation in hospitals and general practice. BMJ. 2003 Jan 18;326(7381):153–6.
18. Lane DA, Lip GYH. Maintaining Therapeutic Anticoagulation: The Importance of Keeping “Within Range.” Chest. 2007 May;131(5):1277–9.
19. Nishimura RA, Otto CM, Bonow RO, Carabello BA, Erwin III JP, Guyton RA, et al. 2014 AHA/ACC guideline for the management of patients with valvular heart disease: A report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 2014 Jul;148(1):e1–132. 20. Daba FB, Tadesse F, Engidawork E. Drug-related problems and potential contributing factors
in the management of deep vein thrombosis. BMC Hematol [Internet]. 2016 Feb 4 [cited 2016 April 2];16. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4743403/. 21. White PJ. Patient Factors That Influence Warfarin Dose Response. Journal of Pharmacy
Practice. 2010 Jun 1;23(3):194–204.
22. Demirkan K, Stephens MA, Newman KP, Self TH. Response to warfarin and other oral anticoagulants: effects of disease states. South Med J. 2000 May;93(5):448–54; quiz 455. 23. Holbrook AM, Pereira JA, Labiris R, et al. SYstematic overview of warfarin and its drug and
food interactions. Arch Intern Med. 2005 May 23;165(10):1095–106.
24. Wen S-Y, Wang H, Sun O-J, Wang S-Q. Rapid detection of the known SNPs of CYP2C9 using oligonucleotide microarray. World J Gastroenterol. 2003 Jun 15;9(6):1342–6.
34
26. VKORC1 vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI [Internet]. [cited 2016 March 23]. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/79001.
27. Militaru F, Vesa S, Pop T, Buzoianu A. Pharmacogenetics aspects of oral anticoagulants therapy. J Med Life. 2015;8(2):171–5.
28. Montes R, Ruiz de Gaona E, Martínez-González MÁ, Alberca I, Hermida J. The c.−1639G > A polymorphism of the VKORC1 gene is a major determinant of the response to
acenocoumarol in anticoagulated patients. British Journal of Haematology. 2006 Apr 1;133(2):183–7.
29. CYP4F2 cytochrome P450 family 4 subfamily F member 2 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI [Internet]. [cited 2016 March 23]. Available from:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/8529.
30. Alvarellos ML, Sangkuhl K, Daneshjou R, Whirl-Carrillo M, Altman RB, Klein TE. PharmGKB summary: very important pharmacogene information for CYP4F2. Pharmacogenet Genomics. 2015 Jan;25(1):41–7.
31. SUN X, YU W-Y, MA W-L, HUANG L-H, YANG G-P. Impact of the CYP4F2 gene polymorphisms on the warfarin maintenance dose: A systematic review and meta-analysis. Biomed Rep. 2016 Apr;4(4):498–506.
32. Yu C, Yan Q, Fu C, Shi W, Wang H, Zeng C, et al. CYP4F2 genetic polymorphisms are associated with coronary heart disease in a Chinese population. Lipids Health Dis. 2014 May 20;13:83.
33. Powledge TM. The polymerase chain reaction. Advances in Physiology Education. 2004 Jun 1;28(2):44–50.
34. Bartlett JS, Stirling D. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Bartlett JS, Stirling D, editors. PCR Protocols [Internet]. Humana Press; 2003 [cited 2016 January 13]. p. 3–6. (Methods in Molecular BiologyTM). Available from: http://dx.doi.org/10.1385/1-59259-384-4%3A3.
35. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, et al. Enzymatic
amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350–4.
36. Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, Forootan A, Jonák J, Lind K, et al. The real-time polymerase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine. 2006 Apr;27(2–3):95–125. 37. Wilhelm J, Pingoud A. Real-Time Polymerase Chain Reaction. ChemBioChem. 2003 Nov
35
38. Fraga D, Meulia T, Fenster S. Real-Time PCR. In: Current Protocols Essential Laboratory Techniques [Internet]. John Wiley & Sons, Inc.; 2008 [cited 2016 April 6]. Available from: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/9780470089941.et1003s08/.
39. Ghijben P, Lancsar E, Zavarsek S. Preferences for Oral Anticoagulants in Atrial Fibrillation: a Best–Best Discrete Choice Experiment. PharmacoEconomics. 2014 Jul 16;32(11):1115–27. 40. Francis B, Lane S, Pirmohamed M, Jorgensen A. A Review of A Priori Regression Models for
Warfarin Maintenance Dose Prediction. PLoS One [Internet]. 2014 Dec 12 [cited 2016 March 31];9(12). Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4264860/.
41. Wang Y, Bajorek B. New Oral Anticoagulants in Practice: Pharmacological and Practical Considerations. Am J Cardiovasc Drugs. 2014 Jan 23;14(3):175–89.
42. Yu Z, Ding Y-L, Lu F, Miao L-Y, Shen Z-Y, Ye W-X. Warfarin dosage adjustment strategy in Chinese population. Int J Clin Exp Med. 2015 Jun 15;8(6):9904–10.
43. Santos PCJL, Marcatto LR, Duarte NE, Gadi Soares RA, Cassaro Strunz CM, Scanavacca M, et al. Development of a pharmacogenetic-based warfarin dosing algorithm and its performance in Brazilian patients: highlighting the importance of population-specific calibration. Pharmacogenomics. 2015 Jun 1;16(8):865–76.
44. Heimark LD, Wienkers L, Kunze K, Gibaldi M, Eddy AC, Trager WF, et al. The mechanism of the interaction between amiodarone and warfarin in humans. Clin Pharmacol Ther. 1992;51:398–407.
45. Wypasek E, Cieśla M, Suder B, Janik Ł, Sadowski J, Undas A. CYP2C9 Polymorphism and Unstable Anticoagulation with Warfarin in Patients Within the First 3 Months Following Heart Valve Replacement. Adv Clin Exp Med. 2015 Aug;24(4):607–14.
46. Rouleau-Mailloux É, Shahabi P, Dumas S, Feroz Zada Y, Provost S, Hu J, et al. Impact of regular physical activity on weekly warfarin dose requirement. J Thromb Thrombolysis. 2016;41:328–35.
47. Limdi NA, Brown TM, Yan Q, Thigpen JL, Shendre A, Liu N, et al. Race influences warfarin dose changes associated with genetic factors. Blood. 2015 Jul 23;126(4):539–45.
48. Yan X, Yang F, Zhou H, Zhang H, Liu J, Ma K, et al. Effects of VKORC1 Genetic Polymorphisms on Warfarin Maintenance Dose Requirement in a Chinese Han Population. Med Sci Monit. 2015 Nov 19;21:3577–84.
36
50. Liang R, Wang C, Zhao H, Huang J, Hu D, Sun Y. Influence of CYP4F2 genotype on warfarin dose requirement–a systematic review and meta-analysis. Thrombosis Research. 2012 Jul 1;130(1):38–44.
51. Borgiani P, Ciccacci C, Forte V, Sirianni E, Novelli L, Bramanti P, et al. CYP4F2 genetic variant (rs2108622) significantly contributes to warfarin dosing variability in the Italian population. Pharmacogenomics. 2009 Feb 1;10(2):261–6.
52. McDonald MG, Rieder MJ, Nakano M, Hsia CK, Rettie AE. CYP4F2 Is a Vitamin K1 Oxidase: An Explanation for Altered Warfarin Dose in Carriers of the V433M Variant. Mol Pharmacol. 2009 Jun 1;75(6):1337–46.
37
8. PRIEDAI
40
