LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS MEDICINOS AKADEMIJA
Vacis Tatarūnas
GENETINIŲ VEIKSNIŲ TYRIMAS
INDIVIDUALIZUOJANT GYDYMĄ
ANTIKOAGULIANTAIS IR
ANTIAGREGANTAIS: VARFARINO IR
KLOPIDOGRELIO FARMAKOGENETIKA
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, biologija (01B)
Kaunas, 2012
Disertacija rengta 2007–2011 metais Kauno medicinos universiteto (nuo 2010 metų rugsėjo 1 d. Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos) Kardiologijos institute.
Mokslinis vadovas
prof. habil. dr. Vaiva Lesauskaitė (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
Konsultantas
prof. habil. dr. Pranas Grybauskas (Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademija, biomedicinos mokslai, biologija – 01B)
TURINYS
SANTRUMPOS ...5
ĮVADAS...6
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI ...7
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS...8
3. DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ ...9
4. LITERATŪROS APŽVALGA ...10
4.1. Varfarinas...10
4.1.1. Varfarino farmakokinetika ...10
4.1.2. Varfarino farmakodinamika ...11
4.1.3. Geno CYP2C9 polimorfizmas ir varfarino farmakokinetika...11
4.1.4. Geno CYP4F2 polimorfizmas ir vitamino K farmakokinetika...13
4.1.5. Geno VKORC1 polimorfizmas ir varfarino farmakodinamika ...14
4.1.6. Klinikiniai veiksniai, turintys įtakos varfarino dozei ...16
4.1.6.1. Vaistai, lėtinantys varfarino metabolizmą...17
4.1.6.2. Vaistai, skatinantys varfarino metabolizmą ...17
4.1.6.3. Vitaminas K ...18
4.1.6.4. Veiksniai, veikiantys varfarino terapinį efektyvumą po širdies vožtuvų operacijos18 4.1.7. Varfarino dozavimo algoritmai ...19
4.2. Klopidogrelis...20
4.2.1. Klopidogrelio farmakokinetika ir farmakodinamika ...20
4.2.2. Geno polimorfizmo įtaka klopidogrelio terapiniam efektui ...21
4.2.3. Klinikiniai veiksniai, turintys įtakos varfarino dozavimui ...23
4.2.4. Vaistai, turintys įtakos klopidogrelio terapiniam efektyvumui...24
5. TIRTASIS KONTINGENTAS IR TYRIMŲ METODIKA ...26
5.1. Ligonių, gydytų varfarinu po širdies vožtuvų operacijos, ištyrimas ...27
5.1.1. Ligonių, gydytų stacionare po širdies vožtuvų operacijos, ištyrimas ...27
5.1.2. Ligonių, kurie praėjus daugiau nei 3 mėnesiams po atliktos širdies vožtuvų operacijos vartojo varfariną, ištyrimas ...28
5.2. Ligonių gydytų klopidogreliu po įvykusių ūmių išeminių sindromų, ištyrimas ...29
5.3. Genų CYP2C9*1,*2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910), VKORC1 (G–1639A) (rs9923231), VKORC1 (G3730A) (rs7294), CYP4F2 (G1347A) (rs2108622) ir CYP2C19*1, *2 (rs4244285) polimorfizmo tyrimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu ...30
5.3.1. Genominės DNR išskyrimas iš kraujo ...30
5.3.2. Geno polimorfizmo nustatymas tikro laiko PGR metodu ...31
5.4. Trombocitų agregacijos tyrimas optinės agregometrijos metodu ...31
5.5. Biocheminių kraujo tyrimo rezultatų vertinimas ...32
5.6. Statistinė duomenų analizė...32
6. PAGRINDINIAI DARBO REZULTATAI ...33
6.1. Klinikinių ir genetininių veiksnių įtaka vidutinei paros varfarino dozei ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu, atlikus širdies vožtuvų operaciją...33
6.1.1. Gretutinės patologinės būklės ir jų įtaka vidutinei varfarino paros dozei...33
6.1.2. Ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu vartojamų vaistų įtaka vidutinei varfarino paros dozei...33
6.1.3. Ligonių genų CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A) ir VKORC1 G3730A, CYP4F2 G1347A polimorfizmo dažnis ir vartojama varfarino paros dozė ankstyvuoju pooperaciniu periodu ...35
6.1.4. Genų variantų derinių įtaka varfarino paros dozei...36
6.1.5. Varfarino dozavimo modelis ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu po širdies vožtuvų operacijos ...39
6.2. Klinikinių ir genetininių veiksnių įtaka vidutinei varfarino paros dozei, kai varfarinas skiriamas 3 mėnesius ir ilgiau po širdies vožtuvų operacijos ...41
6.2.1. Klinikinių veiksnių įtaka vidutinei varfarino paros dozei ilgalaikio gydymo metu ...41
6.2.2. Ilgalaikio gydymo laikotarpiu vartojamų vaistų įtaka vidutinei varfarino paros dozei....43
6.2.3. Ligonių genų CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A) ir VKORC1 (G3730A), CYP4F2 (G1347A) polimorfizmo dažnis ir vartojama varfarino paros dozė...44
6.2.4. Genų variantų derinių įtaka varfarino paros dozei...45
6.2.5. Varfarino dozavimo modelis ...47
6.2.6. CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A) ir CYP4F2 (A1347A) geno polimorfizmo dažnis atsitiktinėje Lietuvos gyventojų imtyje ...49
6.3. Klinikinių ir genetinių veiksnių įtaka klopidogrelio antitrombocitiniam efektui ...49
6.3.1. Klinikinių veiksnių įtaka antiagregaciniam klopidogrelio efektui...49
6.3.2. CYP2C19 (G681A) geno polimorfizmo įtaka klopidogrelio efektyvumui ir šio geno polimorfizmo dažnis atsitiktinėje Kauno gyventojų imtyje...50
7. REZULTATŲ APTARIMAS...52
7.1. Varfarino dozavimas ankstyvuoju pooperaciniu periodu, atsižvelgiant į ligonio klinikinę būklę ...52
7.2. Genų polimorfizmo įtaka varfarino dozei ankstyvuoju pooperaciniu periodu...54
7.3. Dozės įsotinimo modelis gydant varfarinu ligonius po širdies vožtuvų operacijos ...56
7.4. Varfarino dozavimas praėjus daugiau nei 3 mėnesiams po operacijos ...57
7.5. Ligonio klinikinių ir genetinių veiksnių įtaka stabiliam varfarino dozavimui ...61
7.6. Geno polimorfizmo dažnis atsitiktinėje Lietuvos gyventojų ir ligonių imtyse ...62
7.7. Klinikinių veiksnių įtaka klopidogrelio antiagregaciniam poveikiui ...65
7.8. Geno CYP2C19 polimorfizmo dažnis atsitiktinėje Lietuvos gyventojų imtyje ...66
IŠVADOS...68
LITERATŪROS SĄRAŠAS ...69
PUBLIKACIJŲ SĄRAŠAS...89
PRIEDAS ...91
SANTRUMPOS
ABCB1 ATF–surišanti kasetė ADF adenozindifosfatas
AKF angiotenziną konvertuojantis fermentas
CYP1A2 citochromo P 450 superšeimos 1 šeimos A pošeimio 2 polipeptidas CYP2B6 citochromo P 450 superšeimos 2 šeimos B pošeimio 6 polipeptidas CYP2C19 citochromo P 450 superšeimos 2 šeimos C pošeimio 19 polipeptidas CYP2C8 citochromo P 450 superšeimos 2 šeimos C pošeimio 8 polipeptidas CYP2C9 citochromo P 450 superšeimos 2 šeimos C pošeimio 9 polipeptidas CYP3A4 citochromo P 450 superšeimos 3 šeimos A pošeimio 4 polipeptidas CYP4F2 citochromo P 450 superšeimos 4 šeimos F pošeimio 2 polipeptidas COX ciklooksigenazė
DNR deoksiribonukleorūgštis EDTA etilendiamino tetraacto rūgštis FT4 laisvas tiroksinas GOT gliutamat–oksalacetat–transaminazė GPT gliutamat–piruvat–transaminazė IL–1 interleukinas–1 IL–10 interleukinas–10 IL–6 interleukinas–6
NCBI National Center for Biotechnology Information (angl.) PGE2 prostaglandinas E2
PGR polimerazės grandininė reakcija ŠF šarminė fosfatazė
TNF–α navikų nekrozės faktorius alfa TNS tarptautinis normalizuotas santykis TTH tireotropinis hormonas ŪIS ūminis išeminis sindromas
VKORC1 vitamino K epoksidreduktazės komplekso 1–as subvienetas
ĮVADAS
Skirtingas organizmo atsakas į tą patį vaistą yra aktuali šiuolaikinės medicinos problema, kadangi tie patys vaistai ligonius veikia nevienodai, skiriasi tam pačiam efektui pasiekti reikalinga vaisto dozė [56]. Tobulėjant molekulinės biologijos tyrimo metodams, sparčiai pradėjo vystytis farmakogenetika bei individualizuota medicina, kurios orientuotos į konkretų ligonį ir į jo organizmo atsaką vartojant vaistą. Šiuo metu žinoma, kad vaisto poveikis priklauso nuo ligonio aplinkos, ligonio klinikinės būklės ir vaisto metabolizme ir farmakodinamikoje dalyvaujančių genų polimorfizmo. Tik derinant šiuos veiksnius, galima tiksliai prognozuoti organizmo atsaką į vaistą [44].
Varfarinas ir klopidogrelis yra vieni dažniausiai Lietuvoje bei pasaulyje vartojamų vaistų, skirtų išvengti tromboembolinių komplikacijų [90, 32]. Varfarinas skiriamas esant venų trombozei, plaučių arterijos embolijai, lėtiniam prieširdžių virpėjimui, po širdies vožtuvų operacijos bei kitais klinikiniais atvejais, kai reikalingas ilgalaikis ir gerai kontroliuojamas krešėjimo sistemos aktyvumas. Jo dozavimas sudėtingas dėl siauro terapinio lango. Atskiriems ligoniams skiriamos varfarino dozės gali svyruoti dešimtis kartų [190]. Neretai skiriamos mažesnės vaisto dozės, siekiant išvengti kraujavimo, tačiau tokiu atveju didėja trombozių rizika [74, 167].
Nemažiau aktualus vaistas yra klopidogrelis. Tai antiagregantas, kuris skiriamas miokardo infarkto ar smegenų insulto, periferinių arterijų ligos gydymui, taip pat įdėjus vainikinės arterijos stentą, tam, kad būtų išvengta stento trombozės [136]. Žinoma, kad klopidogrelis veikia neefektyviai maždaug trečdaliui visų juo gydomų europiečių ligonių, o tokių azijiečių ligonių yra dar daugiau [11].
Ištirti svarbiausi klinikiniai ir genetiniai veiksniai, lemiantys varfarino terapinį efektyvumą įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu, ligoniams po širdies vožtuvų operacijos, taip pat nustatyti genetiniai veiksniai, lemiantys klopidogrelio terapinį efektyvumą gydant juo ligonius po ūminių išeminių sindromų. Nustatytas kliniškai reikšmingų genų polimorfizmo dažnis atsitiktinėje lietuvių populiacijos imtyje. Tokių tyrimų iki šiol Lietuvoje nebuvo atlikta.
1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI
Darbo tikslas – įvertinti svarbiausius genetinius ir klinikinius veiksnius,
kurie lemia varfarino ir klopidogrelio terapinį efektyvumą bei nustatyti individualiam šių vaistų dozavimui reikšmingų genetinių žymenų paplitimą atsitiktinėje Lietuvos gyventojų imtyje.
Darbo uždaviniai:
1. Įvertinti genų CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A), VKORC1 (G3730A) ir CYP4F2 (G1347A) polimorfizmo ir klinikinių veiksnių įtaką varfarino dozei įsotinimo metu ligoniams po širdies vožtuvų operacijos.
2. Įvertinti genų CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A), VKORC1 (G3730A) ir CYP4F2 (G1347A) polimorfizmo ir klinikinių veiksnių įtaką palaikomajai varfarino dozei ligoniams, kurie praėjus daugiau nei 3 mėnesiams po atliktos širdies vožtuvų operacijos, vartojo varfariną. 3. Nustatyti genų CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A) polimorfizmo
dažnį atsitiktinėje Lietuvos gyventojų imtyje.
4. Įvertinti geno CYP2C19 (G681A) polimorfizmo ir klinikinių veiksnių įtaką terapiniam klopidogrelio efektyvumui ir nustatyti šio polimorfizmo dažnį atsitiktinėje Lietuvos gyventojų imtyje.
2. DARBO MOKSLINIS NAUJUMAS
Tai pirmoji farmakogenetinė studija Lietuvoje, kurios pagrindu sukurtas personalizuoto ligonių po širdies operacijos gydymo varfarinu modelis. Nauja tai, kad tiriant tą patį ligonių kontingentą, buvo nustatyta, kad genetinių veiksnių įtaka varfarino įsotinimo ir palaikomajai dozei skiriasi. Įsotinant varfarinu ligonius po širdies vožtuvų operacijos didžiausią vaisto dozę didinančią įtaką turi CYP4F2 (G1347A) geno polimorfizmas, o ilgalaikio gydymo metu – VKORC1 (G3730A) geno polimorfizmas. Be to, nustatėme, kad kartu su varfarinu skiriami vaistai (ambroksolis, β2 mimetikai) mažina ligoniui reikalingą varfarino paros dozę.
Pirmą kartą nustatytas atsitiktinės Lietuvos gyventojų imties (n=1231)
CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A) genotipų dažnis. Skirtingai nuo kitų
europiečių populiacijų, lietuviams nustatytas didesnis CYP2C9*1 ir VKORC1 (G–1639A) G alelio dažnis, todėl jiems skiriamos didesnės varfarino paros dozės.
Nustatėme, kad net 23,2 proc. mūsų ištirtų atsitiktinės Lietuvos gyventojų imties (n=276) žmonių turėjo CYP2C19*1/*2 genotipą, kuris sąlygoja mažesnį provaisto virtimą į aktyvų metabolitą ir mažesnį klopidogrelio antiagregacinį efektą. Iš viso 0,4 proc. žmonių nustatytas
*2/*2 genotipas, kuriam esant klopidogrelis yra kliniškai neefektyvus.
3. DARBO PRAKTINĖ REIKŠMĖ
Mūsų atlikto tyrimo metu nustatyti pagrindiniai genetiniai ir klinikiniai veiksniai, kurie daro įtaką varfarino įsotinimui ir palaikomajai dozei po širdies vožtuvų operacijos. Atsižvelgiant į šiuos veiksnius, sukurti varfarino dozavimo modeliai, kuriais remiantis galima lengviau nustatyti varfarino paros dozę.
Nustačius CYP2C19*1/*2 genotipą, galima tiksliau ligoniams parinkti tinkamą antiagregacinį gydymą: kai yra CYP2C19*2/*2 genotipas klopi-dogrelio neskirti, o esant *1/*2 genotipui, atsižvelgiant į trombocitų agregacijos rodiklius, parinkti didesnę klopidogrelio dozę.
4. LITERATŪROS APŽVALGA
4.1. VarfarinasVarfarinas slopina aktyvių krešėjimo faktorių sintezę taip mažindamas tromboembolinių komplikacijų riziką [190, 74, 8].
4.1.1. Varfarino farmakokinetika
Varfarinas yra hidroksikumarinų raceminis mišinys, todėl jo R ir S izomerų formos kepenyse metabolizuojamos skirtingu greičiu ir veikiant skirtingiems fermentams. Organizme susidarę skirtingi varfarino metabolitai (4.1.1.1 lentelė) yra mažiau aktyvūs, bet labiau hidrofiliški ir greičiau pašalinami iš organizmo [155, 198].
4.1.1.1 lentelė. Fermentai, metabolizuojantys varfariną, ir varfarino metabolitai [124]
Varfarino
enantiomeras Metabolizuojantis fermentas Metabolitas S–varfarinas CYP2C9 7–hidroksivarfarinas↑↑↑↑
6–hidroksivarfarinas↑ CYP3A4 10– hidroksivarfarinas CYP2C19 6– hidroksivarfarinas 8– hidroksivarfarinas CYP1A2 6– hidroksivarfarinas R–varfarinas CYP2C9, CYP2C8,
CYP2C19 4– hidroksivarfarinas 7–hidroksivarfarinas
Pastaba: ↑↑↑↑ – 7–hidroksi–metabolito susidaro 4 kartus daugiau, nei 6–hidroksivarfarino↑ S–varfarino metabolizmas trunka nuo 1 iki 1,5 paros, o R–varfarino izomeras metabolizuojamas lėčiau (nuo 1,5 iki 2,5 paros) [197]. Iki 20 proc. visų kepenų CYP 450 superšeimos fermentų sudaro CYP2C9, kuris ir atlieka svarbiausią vaidmenį metabolizuojant varfariną. Daugiausiai susidaro 7–hidroksivarfarino, o net 4 kartus mažiau – 6–hidroksivarfarino [135].
Ilgai vartojant varfariną, kraujo plazmos S–varfarino ir R–varfarino metabolitų koncentracija tampa net iki 5 kartų didesnė už pačio varfarino. Esant sutrikusiam varfarino metabolitų gliukuronidavimo procesui, kuris gali priklausyti nuo UGT1A1 polimorfizmo, šių metabolitų koncentracija kraujo plazmoje dar labiau padidėja, nes jie nėra tinkamai pašalinami iš kraujo. Yra žinoma, kad UGT1A10 iki 7 kartų stipriau sujungia varfarino metabolitus [82], lyginant su kitais UGT1A fermentais. Esant šio fermento
F93A ir V92A polimorfizmui, atitinkamai 3 ir 10 kartų lėčiau sujungiami varfarino metabolitai [125]. Nustatyta, kad būtent neaktyvūs ir negliukuroniduoti varfarino metabolitai dar slopina ir CYP2C9 aktyvumą [124], nes jie su CYP2C9 jungiasi net iki 3 kartų stipriau, nei pats varfarinas [81]. Tai gali būti vienas iš paaiškinimų, kodėl reikia didesnių varfarino dozių pradedant gydymą, o tęsiant gydymą varfarino dozės mažėja.
Fermentai, metabolizuojantys R–varfariną (4.1.1.1 lentelė) ar kontroliuojantys kitus krešėjimo sistemos komponentų gamybos kelius, nėra tokie svarbūs varfarino terapiniam efektui europiečių populiacijoje. Remiantis moksliniais tyrimais, gamma–gliutamilkarboksilazės (GGCX) [158], kalumenino (CALU) [111, 200], CYP3A4, CYP3A5, CYP1A2, CYP2C8, CYP2C19 efektas varfarino poveikiui tarp europiečių išlieka ginčytinas [95, 80, 134].
4.1.2. Varfarino farmakodinamika
Nuo aktyvaus (redukuoto) vitamino K kiekio organizme priklauso šių krešėjimo faktorių: protrombino, VII, IX, X ir natūraliai organizme esančių antikoaguliantų C, Z, S aktyvumas [59]. Vitaminas K veikia kaip pagrindinis krešėjimo sistemos kofaktorius, be kurio nevyksta aktyvių krešėjimo faktorių potransliacinis γ–karboksilinimas, t.y. gliutamo rūgšties liekanų karboksilinimas prijungiant CO2 [152, 159]. Karboksilinimo reakcijos metu krešėjimo sistemos fermentai įgauna savybę jungtis su kraujagyslės endotelio fosfolipidinėmis struktūromis, o šios reakcijos metu oksiduojamas vitaminas K bei susidaro vitamino K 2,3 epoksidas. Varfarinas, savo ruožtu, blokuoja vitamino K epoksidreduktazę (VKORC1), kuri dalyvauja vitamino K 2,3 epoksidą redukuojant į aktyvų vitamino K hidrochinoną. Varfarinas jungiasi su VKORC1, nes yra struktūriškai panašus į vitaminą K, tačiau, skirtingai nei vitaminas K, varfarinas prisijungia negrįžtamai. Taip slopinamas krešėjimo sistemos aktyvumas [8]. S–varfarino izomeras veikia maždaug nuo 3 iki 5 kartų stipriau nei R– varfarinas [9, 87].
4.1.3. Geno CYP2C9 polimorfizmas ir varfarino farmakokinetika
CYP2C9 – yra vienas svarbiausių žmogaus organizme esančių fermentų, kontroliuojančių tokių biologiškai aktyvių medžiagų kaip steroidiniai hormonai, arachidono rūgštis, o taip pat ir ksenobiotikų metabolizmą. CYP2C9 be varfarino oksiduoja ir kitus vaistus: peroralinius antidiabetinius (sulfanilšlapalo darinius), nesteroidinius vaistus nuo uždegimo (diklofenaką, ketoprofeną), diuretikus (torazemidą), antiepilepsinius (fenitoiną),
angiotenzino II receptorių blokatorius (losartaną, kandesartaną), kitus antikoaguliantus (acenokumarolį) [219].
Šio fermento genas nustatytas 1995 metais [65]. CYP2C9 fermento geno seka sudaro vieną bendrą sritį kartu su 2C18, 2C19, 2C8. Toje pačioje chromosomoje (10q23.33) nustatytas vienas maždaug 500 tūkst. bazių porų ilgio fragmentas: Cen–2C18–2C19–2C9–2C8–Tel. Kiekvienas iš šį fragmentą sudarančių genų turi po 9 koduojančias sekas (4.1.3.1 pav.) [48].
rs1799853: 8621 agcattgaggacc*gtgttca 8640 1‡ 2‡, 3‡ 4‡, 5‡ 6‡ 7‡ 8‡ 9‡ rs1799853 3 egzonas rs1057910 rs1057910: 47631 agagataca**t 47639
4.1.3.1 pav. Geno CYP2C9 sandara ir jo rs1799853 bei rs1057910 polimorfizmas
Pastaba: ‡ – koduojančios sekos (egzonai); * – Polimorfizmas: rs1799853, genominės DNR sekoje – C8633T, RNR sekoje – C430T, baltymo sekoje – Arg144Cys; ** – Polimorfizmas: rs1057910, genominės DNR sekoje – A47639C, RNR sekoje – A1075C, baltymo sekoje – Ile359Phe; genominės DNR sekos nuoroda: NCBI Reference Sequence: NG 008385.1
Geno sekos analizės metu nustatyta, kad CYP2C9 yra labai polimorfiškas. Skirtingose populiacijose nustatomas skirtingas alelių dažnis, kuris ir charakterizuoja populiaciją. Tarp europiečių svarbiausi šie 3 geno aleliai: CYP2C9*1(wt), *2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910) (4.1.3.1 pav.), dviejų pastarųjų dažnis populiacijoje atitinkamai siekia 15 proc. ir 8 proc.
CYP2C9 *1,*2,*3 alelių dažnis skirtingose šalyse pateikiamas 4.1.3.1
lentelėje. CYP2C9 *2 ir *3 aleliai yra baltymą koduojančiose sekose (egzonuose), todėl minėtas polimorfizmas turi įtakos baltymo struktūros pokyčiams. Afrikiečiams dažnai nustatomi tokie aleliai kaip *5, *6, *8, *9,
*11, *31, kurie kitose populiacijose labai reti [173, 127, 25], o aleliai *2 ir
*3 nustatomi atitinkamai tik iki 4 proc. ir 2 proc. jų populiacijos [22]. Tuo
tarpu azijiečiams nenustatomas *2 alelis, išskyrus Indijos gyventojus, kurių šio alelio dažnis siekia nuo 3 iki 4 proc., o *3 alelis nustatomas nuo 8 iki 9 proc. gyventojų. Iki 5 proc. dažnumu *3 alelis nustatomas Malaizijos gyventojams, o tarp kinų jis gana retas ir nesiekia 1 proc. [103]. Žmonėms, kurie turi bent vieną *2 alelį, CYP2C9 aktyvumas sumažėja 30 proc., o tiems, kurie turi *3 alelį, sumažėja net 95 proc., palyginus su laukinio tipo (*1 arba wt) genotipą turinčiais žmonėmis. Tokiems ligoniams vieni vaistai veikia per stipriai, o kiti išvis neveikia, nes yra blogai metabolizuojami. Vartojant varfariną galima nukraujuoti net vaisto įsotinimo metu, nes varfarino antikoaguliacinis efektas nenuspėjamas ir dozė išlieka nestabili [155, 21].
4.1.3.1 lentelė CYP2C9*1,*2,*3 alelių dažnis įvairiose populiacijose
Populiacija *1 *2 *3 Literatūros šaltinis
Afroamerikiečiai 95,3 2,7 2,0 [170] Belgija 82,5 10,0 7,5 [2] Bolivija 92,2 4,8 3,0 [20] Indija 88,0 4,0 8,0 [83] Kanada 91,0 3,0 6,0 [52] Kinija 96,3 0,1 3,6 [210] Prancūzija 77,0 15,0 8,0 [210]
4.1.4. Geno CYP4F2 polimorfizmas ir vitamino K farmakokinetika
CYP4F2 geno seka identifikuota 13–oje chromosomoje. Šis genas yra sudarytas iš 13 egzonų (koduojančių sekų), kurio 11–ame egzone esantis
rs2108622 C>T polimorfizmas ir lemia skirtingą koduojamo fermento
aktyvumą (4.1.4.1 pav.). CYP4F2 yra vienas pagrindinių fermentų, kuris nustatomas kepenyse, širdyje, plaučiuose, inkstuose, leukocituose bei kontroliuoja 20–hidroksieikozatetraenoinės rūgšties (20–HETE) metaboliz-mą iš arachidono rūgšties [51]. Nustatyta, kad smegenyse 20–HETE skatina smegenų kraujagysles susitraukti bei yra laikomas potencialiu vazokonst-riktorium. Eksperimentiškai paveikus peles, jų organizme sumažėjo 20– HETE gamyba iš arachidono rūgšties. Sukėlus smegenų išemiją, rečiau įvyko infarktas [116]. Kitų autorių pastebėta, kad CYP4F2 veikia ir kaip vitamino K1 oksidazė. Didesnės aktyvaus neoksiduoto vitamino K koncent-racijos nustatytos tiems, kurie turėjo 432M polimorfizmą (T alelį) [23]. T.y. tiems ligoniams, kurie turi CYP4F2 rs2108622 T/T geno polimorfizmą reikia didesnių varfarino dozių, nei turintiems C/C variantą [218, 203].
Tačiau, kai kurių autorių teigimu, nėra sąsajos tarp CYP4F2 genotipo ir ilgą laiką ligonio vartojamos varfarino dozės [186].
Šio geno polimorfizmo dažnis skirtingose populiacijose taip pat nevie-nodas. A alelio dažnis europiečių ir azijiečių populiacijose siekia atitinkamai 34 proc. ir 31 proc., o A/A genotipas nustatomas atitinkamai iki 11 proc. ir iki 9 proc. A alelio dažnis ispanų kilmės žmonėms nustatomas 23 proc., o
A/A genotipą turi tik 5,3 proc. Afrikiečiams nustatomas mažiausias šio geno
polimorfizmo dažnis. A alelį turi iki 12 proc. žmonių, o A/A aptinkamas iš viso retai (1,3 proc.) [170].
Pastaba: ‡ – koduojančios sekos fragmentai (egzonai); Polimorfizmas: rs2108622, genominės DNR sekoje – G23454A, RNR sekoje – G1347A, baltymo sekoje – Val433Met; Genominės DNR sekos nuoroda: NCBI Reference Sequence NG_008385.1
rs2108622: 23443 acaacccagctgtgtggccggaccctga 23470
1‡ 2‡ 3‡ 4‡, 5‡ 6‡7‡ 8‡, 9‡ 10‡, 11‡, 12‡ 13‡
rs2108622
4.1.4.1 pav. Geno CYP4F2 sandara ir jo rs2108622 polimorfizmas
4.1.5. Geno VKORC1 polimorfizmas ir varfarino farmakodinamika
Vitamino K epoksidreduktazės I komplekso subvienetas (VKORC1) yra mažas (jį sudaro 163 amino rūgščių seka) endoplazminio tinklo membraną kertantis baltymas. Nepaisant to, kad kaip baltymas varfarino taikinys buvo nustatytas jau prieš daugiau nei 30 metų, jį išgryninti pasisekė tik 2004 metais [159]. Šio fermento genas yra 16 chromosomoje. Jį sudaro 3 koduojančios sekos (egzonai) [203]. Nustatyta, jog VKORC1 (vitamino K epoksidreduktazės 1 subvieneto) polimorfizmas (G–1639A, C1173T,
G3730A) lemia varfarino antikoaguliacinio poveikio stiprumą [186, 34, 217,
164]. Be to, nustatomos ir naujos mutacijos, kurios gali turėti įtakos varfarino efektyvumui [207]. Kai kurios mutacijos nustatomos tik tam tikrose populiacijose, o kai kuriose jų nerandama [142, 192].
Europiečių populiacijoje dažniausiai nustatomas geno VKORC1 polimorfizmas žymimas *2 aleliu. Bent vieną tokį alelį turi nuo 60 iki 84 proc. žmonių [168, 131, 71]. Tarp azijiečių *2 alelis nustatomas dar dažniau (nuo 98,7 – 99,4 proc.) [121, 128], o juodaodžių populiacijoje jis nustatomas rečiausiai. Tik maždaug 20 proc. visų ištiriamų juodaodžių turi bent vieną
*2 alelį [57]. Europiečiams rečiau nustatomas *3 alelis (vidutiniškai 38
proc.) [16]. Pietų Europoje, pietų Amerikos šalyse, nustatoma mažiau A/A homozigotų (6–8 proc.) [188]. Didesnis A/A genotipo dažnis aptinkamas afrikiečių populiacijose [140]. Rečiausiai tiriamo *4 alelio dažnis tarp europiečių siekia 20 proc. [161]. VKORC1 struktūra bei polimorfizmas pateiktas 4.1.5.1 paveiksle. rs9923231: 3582 tggccgggtgcggtggct 3600 rs9934438: 6391 tcatcgacccttggactag 6409 rs7294: 8941 cctcctgccatacccgcaca 8960 1‡ 2‡ 3‡ rs7294 rs9934438 rs9923231
4.1.5.1 pav. Geno VKORC1 sandara ir jo rs9923231, rs9934438 bei rs7294 polimorfizmas
Pastaba: ‡ – koduojančios sekos fragmentai (egzonai); polimorfizmas: rs9923231, genominės DNR sekoje – G–1639A arba G3588A; polimorfizmas: rs9934438, genominės DNR sekoje – C1173T arba C6399T; polimorfizmas: rs7294, genominės DNR sekoje –
G3730A arba G8956A; Genominės DNR sekos nuoroda: NCBI Reference Sequence
NG_011564.1
Nustačius bent vieną polimorfizmą VKORC1 T381C rs7196161, G–
1639A (arba 3673) rs9923231, G1542C (arba G 6853C) rs8050894, C1173T (arba C6484T) rs9934438 ir C2255T (arba C7566T) (rs2359612), priimta
įvardinti *2 aleliu, nes minėtos mutacijos nustatomos kartu daugiau nei 90 proc. atvejų, todėl dar ir formuoja bendrą haplotipą [157, 117]. Dėl šios savybės dažniausiai tiriamas vienas kuris nors iš išvardintų variantų (dažniausiai 1173 arba –1639) [164]. Asmeniui, kuris turi VKORC1 *2 alelį, nustatoma pakitusi transkripcijos faktoriaus prisijungimo sritis (promotorius neatlieka savo funkcijos), todėl, būna mažesnė VKORC1 raiška ir silpnesnis vitamino K ciklo aktyvumas. Tai ir lemia mažesnių varfarino dozių poreikį [157, 140].
Nenustatyta, kad VKORC1 G3730A (arba G9041A) rs7294 polimor-fizmas (*3 alelis) sudarytų haplotipą su kitais žinomais variantais. Remiantis naujausių tyrimų duomenimis, nustačius šį alelį, tiksliau apibūdinamas konkretaus ligonio VKORC1 aktyvumas bei tiksliau parenkama ligoniui reikalinga varfarino dozė [34].
VKORC1 *4 alelis (VKORC1 861 arba 2653 arba 6009 polimorfizmas)
šio fermento aktyvumui įtakos beveik neturi [157].
Terapinė varfarino dozė priklauso nuo kepenų citochromo P 450 (2C9, 4F2) superšeimos fermentų bei VKORC1 fermento geno polimor-fizmo. Įvairiose populiacijose skirtingas šių genų polimorfizmas turi nevienodos įtakos varfarino dozavimui. Lietuvių populiacijoje tokių tyrimų nebuvo atlikta. Mokslinėje literatūroje pateikiami prieštaringi duomenys apie CYP4F2 vaidmenį dozuojant varfariną.
4.1.6. Klinikiniai veiksniai, turintys įtakos varfarino dozei
Kai yra kepenų, skydliaukės bei inkstų veiklos sutrikimų, gali būti keičiama ligoniui skiriama varfarino dozė. Kepenyse yra gaminami krešėjimo sistemos faktoriai, veikiant P450 superšeimos fermentams inaktyvuojamas varfarinas, gliukuroniduojami varfarino metabolitai, kurie pašalinami su šlapimu arba tulžimi [117, 167]. Vyresnių ligonių vaistų metabolizmas kepenyse bei jų pašalinimas su šlapimu bei su tulžimi yra blogesnis, nei jaunų [165]. Nuo skydliaukės funkcijos priklauso organizmo metabolizmo greitis. Be to, į kraują išskiriamas tiroksinas konkuruoja su varfarinu dėl prisijungimo su albuminu, todėl ligoniams, turintiems skydliaukės hiperfunkciją, gali reikėti mažesnių varfarino dozių [109]. Taip pat didesnės dozės reikia ir didesnio svorio ligoniams, nes jų organizme varfarinui yra kur daugiau pasiskirstyti, jo koncentracija kraujyje susidaro mažesnė nei mažesnio svorio ligonių organizme [96].
4.1.6.1. Vaistai, lėtinantys varfarino metabolizmą
Jau 1995m. nustatyta, kad amiodaronas gali slopinti CYP2C9 aktyvumą [102]. Vartojant 400 mg per parą amiodarono dozes, S– ir R– varfarino izomerų metabolizmas sumažėja 47 proc. ir 33 proc. [126]. Žinant tai, kad amiodarono metabolitai kraujo plazmoje aptinkami laikotarpiu iki 1 mėnesio, CYP2C9 slopinimas gali trukti net iki keleto savaičių. Be to, skirtingų žmonių amiodarono, kaip ir varfarino, metabolizmas nevienodas [33]. Atsižvelgiant į tai, kokiomis dozėmis skiriamas amiodaronas, varfarino dozes patartina mažinti (4.1.6.1 lentelė).
4.1.6.1 lentelė. Varfarino dozės parinkimo modelis ligoniams, kurie vartoja amiodaroną ir varfariną, [37]
Amiodarono dozė (mg per
parą) Varfarino dozė mažinama (proc.)
400 40 300 35 200 30 100 25 Angiotenzino II receptorių antagonistai (kandesartanas, losartanas,
irbesartanas, telmisartanas, olmesartanas ir valsartanas) skirtingu stiprumu blokuoja CYP2C9 [84]. Hipoglikeminiai vaistai, skirti diabetui gydyti (sulfonilšlapalo dariniai), protonų siurblio inhibitoriai (omeprazolis, rabeprazolis), fliukonazolis taip pat mažina CYP2C9 metabolizmo greitį [78]. Ekperimentiniais tyrimais nustatyta, kad vartojant bent 100 mg per parą fliukonazolio, S–varfarino metabolizmas pailgėja beveik 2 kartus. Iš visų statinų, tik fliuvastatinas pasižymi ženkliu CYP2C9 aktyvumą slopinančiu efektu, o tokie vaistai kaip β–receptorių blokatoriai, kalcio kanalų blokatoriai, CYP2C9 aktyvumą veikia nedaug [126].
4.1.6.2. Vaistai, skatinantys varfarino metabolizmą
Fenobarbitalis, rifampicinas, antinksčių žievės steroidiniai hormonai (gliukokortikoidai), hiperforinas (randamas jonažolėse, lot. Hypericum
perforatum) gali net nuo 2 iki 8 kartų padidinti CYP2C9 aktyvumą [126,
31]. Dėl to varfarinas yra greičiau metabolizuojamas ir pašalinamas. Tiek fenobarbitalis [139], tiek ir rifampicinas netiesiogiai, bet per X pregnano receptorius (PXR) didina CYP2C9, CYP2C19, CYP3A4 metabolizmą [30]. Tuo tarpu deksametazonas per PXR ir konstitucinį androstano receptorių (CAR) skatinančiai veikia tik CYP2C9, bet nekeičia nei 2C19, nei 3A4
aktyvumo [58]. Skiriant tokius vaistus kaip nifedipinas, fluvastatinas, lovastatinas taip pat pastebėtas CYP2C9 raiškos padidėjimas. Šie vaistai tikriausiai taip pat veikia CAR [31]. Torazemidas, kaip ir kiti diuretikai, skatina elektrolitų pašalinimą iš organizmo. Tokiu atveju greičiau pašalinamas tiek varfarinas, tiek ir susidarę jo metabolitai [201].
4.1.6.3. Vitaminas K
Varfarino terapinis efektyvumas tiesiogiai priklauso nuo redukuoto (aktyvaus) vitamino K kiekio organizme. Vitaminas K gaunamas su maistu, taip pat nedidelė jo dalis gaminama žarnyno mikrofloros (vitaminas K2 arba menachinonas). Pagrindinis vitamino K šaltinis yra augalai (vitaminas K1 aba filochinonas) [110]. Organizme vitaminas K kaupiamas kepenyse, kur jo atsargų užtenka kelioms dienoms. Valgant mažai vitamino K turinčio maisto, sutrikus žarnyno veiklai, o taip pat vartojant antibiotikus, kurie slo-pina žarnyno mikroflorą, žmogus negauna reikalingo vitamino K paros kiekio, todėl mažėja aktyvių krešėjimo faktorių gamyba ir stiprėja varfarino antikoaguliacinis efektas. Priešingu atveju, kuomet valgoma daugiau vita-mino K turinčio maisto, silpnėja varfarino antikoaguliacinis efektas. Tyri-mais nustatyta, kad vartojant daugiau vitamino K, stabiliau kontroliuojamas varfarino dozavimas, nei tuo atveju, kai vartojama mažiau vitamino K [89]. 4.1.6.4. Veiksniai, veikiantys varfarino terapinį efektyvumą po širdies vožtuvų operacijos
Po operacijos skiriami vaistai užtikrina organizmo funkcionavimą. Tie preparatai, kurie tiesiogiai ar per kitus veiksnius gali paveikti organizmo funkcijų pokyčius ir varfarino absorbciją, metabolizmą, ekskreciją bei farmakodinamiką, gali lemti krešėjimo sistemos aktyvumo svyravimą ir varfarino terapinį efektyvumą. Be to, dėl parenteriniu būdu gautų skysčių ir maisto, dėl natūralių žaizdos gijimo metu vykstančių procesų, ligonio organizmo būklė būna pakitusi. Visi šie veiksniai gali iškreipti varfarino metabolizmą, todėl jo dozavimas išlieka nestabilus ir labai sudėtingas.
Kepenyse sintetinami ne tik krešėjimo faktoriai, bet ir dauguma CYP 450 superšeimos fermentų. Kai yra uždegimas, skatinama krešėjimo sistemos veikla, o kai kurių P450 fermentų (2B, 2C, 3A) aktyvumas ženkliai sumažėja [107, 147, 129].
Ligoniams, kuriems yra atliekama širdies vožtuvų operacija, preme-dikacijai skiriami vaistai: fentanilis (narkotinis analgetikas), midazolamas ar propofolis bendrajai anestezijai, sevofliuranas ar izofliuranas, raumenų relaksantai pipekuronijus ar rokuronijus, taip pat pirmos kartos
rinas cefazolinas bei traneksaminė rūgštis kraujavimui slopinti. Šie vaistai metabolizuojami CYP 450 superšeimos fermentų, dažniausiai CYP2 ir CYP3 šeimos atstovų [153, 160]. Be to, šie vaistai dar gali slopinti CYP 450 fermentų aktyvumą. Žinoma, kad propofolio metabolitas gliukuroniduo-jamas todėl gali konkuruoti su varfarino metabolitais dėl pašalinimo inkstais [153]. Klinikiniais tyrimais nustatyta, kad tiems ligoniams, kurie turi lėtinį inkstų nepakankamumą, beveik 2 kartus dažniau pasitaiko kraujavimas, o varfarino dozavimas išlieka nestabilus, net ir skiriant mažesnėmis nei kitiems ligoniams dozėmis [104].
Terapinis varfarino efektyvumas priklauso nuo daugelio klinikinių veiksnių, lemiančių jo farmakokinetiką ir farmakodinamiką. Maistas, kuriame gausu vitamino K, kartu su varfarinu vartojami vaistai bei organizmo funkcijos sutrikimas turi reikšmingos įtakos krešėjimo sistemos aktyvumui ir varfarino dozei.
Skiriant varfariną po širdies vožtuvų operacijos, dažnai terapinė riba tarp trombozių ir nukraujavimo rizikos neišlaikoma, nors ir atliekami krešėjimo sistemos aktyvumo tyrimai, pagal kurių rezultatus koreguojama varfarino dozė. Tęsiant ligonio gydymą namuose, varfarino dozavimas tampa dar sudėtingesnis dėl įvairių veiksnių, darančių įtaką vaisto poveikiui. Dažnai ligoniams skiriamos mažesnės nei reikalingos terapinės vaisto dozės ir palaikoma žemesnė nei terapinė krešėjimo sistemos būklė bijant kraujavimo. Ši problema aktuali ne tik Lietuvoje, bet ir pasaulyje [137].
4.1.7. Varfarino dozavimo algoritmai
Vieni pirmųjų darbų, kuriuose buvo bandoma dozuoti varfariną remiantis ligonio amžiumi, ūgiu ir CYP2C9*1,*2,*3 bei VKORC1 (G–1639A) polimorfizmu, publikuoti dar 2005 metais. Tyrėjų pasiūlytas modelis paaiškino varfarino dozės svyravimą iki 55 proc. [168]. Šiuo metu naujau-siuose mokslininkų pateikiamuose darbuose pristatomi varfarino dozės parinkimo algoritmai, kurių pagrindiniai sudėtiniai komponentai išlieka tie patys. Priklausomai nuo tirtos populiacijos, į algoritmus įtraukiami skirtingi papildomi veiksniai.
2010 metais ištyrus 100 Turkijos ligonių, gydomų varfarinu, ligonio amžius, kūno paviršiaus plotas, VKORC1 (G–1639A) ir CYP2C9*1,*2,*3 polimorfizmas paaiškino net 60,4 proc. varfarino dozės svyravimo [143]. Šiek tiek daugiau paaiškino kinų algoritmas, į kurio sudėtį įtraukti ligonio amžius, svoris, CYP2C9*1 ir *3 bei VKORC1 (G–1639A) polimorfizmas [121]. Turėdami tuos pačius duomenis (ligonio amžius, svoris, CYP2C9*1 ir
*3 bei VKORC1 (G–1639A) polimorfizmas), tačiau atsižvelgus dar ir į
vitamino K vartojimą maiste, kinai padidino modelio tikslumą dar 3 procentais [213]. Prie turimų veiksnių (ligonio amžius, svoris, CYP2C9*1 ir
*3 bei VKORC1 (G–1639A) polimorfizmas) pridėjus dar dviejų genų
polimorfizmą, EPHX (A1691G) ir CYP2C9 IVS3–(G–65C), kinų populiacijoje varfariną galima dozuoti net 76,8 proc. tikslumu [68]. Kol kas dar nesukurtas modelis, kuris galėtų paaiškinti varfarino dozavimą 100 proc. tikslumu.
Kuriami varfarino dozavimo algoritmai, kurių efektyvumas skirtingas įvairiose populiacijose, tačiau nėra optimalaus modelio, kuris paaiškintų varfarino dozavimą visiems varfarinu gydomiems ligoniams.
4.2. Klopidogrelis
Klopidogrelis negrįžtamai blokuoja trombocitų membranoje esančius P2Y12 receptorius, jautrius vienam iš svarbiausių fiziologinių agregacijos induktorių, t. y. adenozindifosfatui (ADF). Taip blokuojamas trombocitų gebėjimas agreguoti [50].
4.2.1. Klopidogrelio farmakokinetika ir farmakodinamika
Klopidogrelis yra provaistas, todėl tik esant tinkamoms sąlygoms iš jo organizme susidaro aktyvus metabolitas, kuris gali blokuoti trombocitų P2Y12 receptorių ir slopinti agregaciją. Tik iki 10–15 proc. suvartoto klopidogrelio tampa aktyviu ir gali blokuoti trombocitų P2Y12 receptorių. Likę 85 proc. suvartoto vaisto dozės hidrolizuojami veikiant karboksileste-razėms bei pašalinami iš organizmo [191, 72]. Klopidogrelis iš žarnyno patenka į kraujotaką, taip pat atgal iš kraujotakos į žarnyną gali būti perneštas P–glikoproteino ABCB1 baltymo. Kepenyse klopidogrelio bisulfatą (neaktyvų) aktyvina keletas labai polimorfiškų CYP450 fermentų: CYP2C19, CYP3A4, CYP3A5, CYP2C9, CYP1A2 [66, 215, 179, 118], CYP2B6 (4.2.1.1 pav.) [86]. Būtent susidaręs aktyvus klopidogrelio metabolitas ir blokuoja trombocitų membranos P2Y12 receptorius, neleisdamas vykti trombocitų agregacijai ir susidaryti fibrinogeno tilteliams [212] tarp glikoproteino receptorių (GP 2β3α) [181]. Be to, kai kurių autorių teigimu [18], klopidogrelio metabolizmas vyksta dviem etapais: pirmąjį etapą kontroliuoja CYP 450 superšeimos fermentai, o antrąjį etapą vykdo paraoksonazė 1 (PON1), galimai esanti pačiuose trombocituose. Tačiau naujausi tyrimai nepatvirtino, kad paraoksonazė 1 (PON1) atlieka svarbiausią vaidmenį klopidogrelio metabolizme [3, 61]. Būtina paminėti ir
tai, kad klopidogrelio metabolizmas priklauso ir nuo jo koncentracijos. Eksperimentiniais tyrimais in vitro nustatyta, kad esant mažesnėms nei ≤10 µM klopidogrelio koncentracijoms, jį metabolizuoja CYP2C19, tuo metu, esant didesnėms nei >10 µM vaisto koncentracijoms, vaisto meta-bolizmas vyksta ir veikiant CYP3A4. Vis dėlto labai didelės šio vaisto dozės blokuoja patį CYP2C19 [215].
Pirmas metabolizmo etapas
Aktyvaus metabolito prekursorius 2– okso–klopidogrelis (Iki 15 proc.)
Aktyvus metabolitas (Iki 10–15 proc.)
2B6, 2C19, 1A2
2B6, 2C19, 3A4, 3A5, 2C9, PON1 Antras metabolizmo etapas
Neaktyvus metabolitas Neaktyvus metabolitas
(Iki 85 proc.)
4.2.1.1 pav. Klopidogrelio metabolizmas vaistui patekus į organizmą
Klopidogrelio bisulfatas (provaistas)
4.2.2. Geno polimorfizmo įtaka klopidogrelio terapiniam efektui
Nustatyta, kad gydant klopidogreliu, maždaug trečdalis visų ligonių negauna reikiamo terapinio efekto. Kai kuriais atvejais teigiamas efektas pasiekiamas tik tuomet, kai padidinama klopidogrelio terapinė dozė [67], tačiau pastebėta, kad net ir po to tik pusė šių ligonių, kurie atsparūs klopidogreliui, pasiekia reikiamą antiagregacinį efektą [36]. Buvo manoma, kad klopidogrelio metabolizmas labiausiai priklauso nuo CYP3A4*1B ir
CYP3A5*3/*3 genotipo. Tačiau vėlesnių tyrimų metu nustatyta, kad minėtas genų polimorfizmas minimaliai veikia klopidogrelio aktyvaus metabolito pokyčius [88].
Šiuo metu yra žinoma, kad klopidogrelio terapinis efektyvumas labiausiai priklauso nuo CYP2C19 polimorfizmo [42]. Kitų fermentų, kurie dalyvauja klopidogrelio pernašoje (ABCB1), metabolizme (3A4, 2C9, 1A2, 2B6), bei trombocitų receptorių (P2Y12) genų polimorfizmas (T744C) neturi esminės
įtakos klopidogrelio poveikiui [118, 181]. Kitų autorių teigimu, ABCB1 geno C3435T polimorfizmas gali lemti šio fermento geno raišką, todėl klopidogrelis gali veikti silpniau, nes bus greičiau pašalinamas iš kraujo [205].
Kaip jau minėta anksčiau, pagrindinis už klopidogrelio metabolizmą atsakingo fermento genas – CYP2C19 yra kartu su CYP2C18, 2C8, 2C9 viename 10–os chromosomos fragmente [48]. Fiziologinėmis sąlygomis organizme CYP2C19 kartu su kai kuriais kitais P 450 sistemos citochromais (2C) metabolizuoja endobiotinius steroidinę struktūrą turinčius junginius (progesteronas, estrogenas, testosteronas), o taip pat ir atlieka ksenobiotikų metabolizmą [43, 60, 94, 209].
Genų polimorfizmo tyrimais nustatyti pagrindiniai CYP2C19 aleliai (*2,
*3, *4, *5 [76], *6 [77], *7 [75]), kurie atsakingi už mažesnį fermento aktyvumą, taip pat mažesnį klopidogrelio metabolizmą, lyginant su laukinio tipo (*1) aleliu. Ligoniams, kuriems nustatomas minėtas genų polimor-fizmas, dažniau pasireiškia trombozė dėl nepakankamo klopidogrelio antiagregacinio efekto [205]. Europiečių populiacijoje bent vieną *2 alelį (G681A polimorfizmą, rs4244285) turi maždaug 20 proc. žmonių. Azijiečių populiacijose tokių žmonių yra iki 71 proc. [199], o afrikiečių populiacijose tokių žmonių nustatoma nuo 6 proc. iki 30 proc. [93, 163]. CYP2C19
G636A polimorfizmas (*3 alelis rs4986893) tarp europiečių yra labai retas. Vis dėlto tarp azijiečių jis gali būti nustatomas dažnumu iki 9 proc. Būtina paminėti, kad abu šie aleliai (*2, *3) nustatomi dažnumu iki 87 proc. tiems ligoniams, kurių CYP2C19 aktyvumas būna ženkliai sumažėjęs [47]. Priešingai, kai ligonis turi *17 alelį (C4195A, rs12248560), vaisto metabolizmas yra greitesnis lyginant su *1 (laukinio tipo) aleliu, todėl šiems ligoniams gali grėsti nukraujavimas [176]. Šio (*17) alelio dažnis tarp europiečių siekia net 18 proc., 4 proc. tarp azijiečių, o tarp afrikiečių jis nustatomas net dažnumu iki 26 proc. [180]. CYP2C19 sandara bei polimorfizmas pateiktas 4.2.2.1 paveiksle.
Tyrimais nustatyta, kad geno CYP2C19 polimorfizmas turi didžiausios įtakos klopidogrelio terapiniam efektyvumui. Skirtingose populiacijose šio geno polimorfizmo dažnis skiriasi. Geno CYP2C19 polimorfizmas Lietuvoje iki šiol netirtas.
rs12248560 rs4986893
rs4244285: 24141 ttgattattt cccgggaacc 24159 rs4986893: 22940 accccctggatccaggta 22957 rs12248560: 4184 gttctcaaagcatctctgat 4204
rs4244285
Pastaba: ‡ – koduojančios sekos fragmentai (egzonai); polimorfizmas: rs4244285, genominės DNR sekoje – G24154A, RNR sekoje – G681A, baltymo sekoje – Pro227=; polimorfizmas: rs4986893, genominės DNR sekoje – G22948A, RNR sekoje – G636A, baltymo sekoje – Trp212Ter; polimorfizmas: rs12248560, genominės DNR sekoje –
C4195A; genominės DNR sekos nuoroda: NCBI Reference Sequence: NG 008385.1
4.2.3. Klinikiniai veiksniai, turintys įtakos varfarino dozavimui
Skiriasi nuomonės, ar gydymas klopidogreliu yra vienodai efektyvus tiek moterims, tiek ir vyrams [12], tačiau žinoma, kad gydant klopidogreliu, priklausomai nuo to, ar ligonis rūko ir vartoja alkoholį, koks to ligonio amžius, svoris, kokios gretutinės ligos (diabetas, inkstų, kepenų ligos), gali kisti šio vaisto terapinis poveikis. Klopidogrelio metabolizmas vyksta kepenyse. Senstant silpnėja kepenų metabolinis aktyvumas, todėl mažiau klopidogrelio verčiama aktyviu [165]. Rūkančių žmonių CYP1A2 (kuris taip pat metabolizuoja ir klopidogrelį) dažniausiai būna keletą kartų aktyvesnis nei nerūkančių [24]. Nepriklausomai nuo to, ar ligonis rūko, ar nerūko, jo CYP2C19 aktyvumas išlieka toks pats [108], o kepenų CYP3A4 aktyvumas padidėja vartojant alkoholį, rūkant, vartojant kai kuriuos žolinius preparatus [151]. Inkstų funkcijos sutrikimo metu organizme kaupiasi toksinai, skatinama metabolinė acidozė, vystosi uždegimas bei oksidacinis stresas kartu su lipidų, aminorūgščių, mineralų metabolizmo sutrikimu [182]. Be to, ūmaus uždegimo metu, infarkto, kuris komplikuotas
kardio-1‡ 2‡, 3‡ 4‡, 5‡ 6‡ 7‡ 8‡ 9‡
4.2.2.1 pav. Geno CYP2C19 sandara ir jo polimorfizmas
geniniu šoku, esant žarnų nepraeinamumui arba absorbcijos iš žarnyno sutrikimams, klopidogrelio efekto gali visai nebūti [175].
4.2.4. Vaistai, turintys įtakos klopidogrelio terapiniam efektyvumui
Ūminių koronarinių sindromų metu, plyšus aterosklerozinei plokštelei, arba kitaip pažeidus arterijos sienelės vientisumą (įdėjus širdies vainikinės kraujagyslės plėtiklį – stentą, nustatomas didesnis nei normalus trombocitų funkcijos aktyvumas [189], todėl gali padidėti arterijų ar stento trombozės bei miokardo infarkto rizika [68]. Norint išvengti gyvybei pavojingų situacijų, skiriamas gydymas aspirinu ir klopidogreliu kartu, nes minėti vaistai papildo vienas kito veikimą. Aspirinas neveikia trombocitų ADF receptorių, tačiau veikia tromboksano A2 susidarymą iš arachidoninės rūgšties bei skatina aktyvaus klopidogrelio metabolito gamybą [29].
Fermentas CYP2C19 aktyviai metabolizuoja protonų pompos (siurblio) inhibitorius (PPI) – omeprazolį, lansoprazolį, rabeprazolį [180, 150, 10], versdamas juos neaktyviais metabolitais. Šie vaistai dažnai skiriami kartu su klopidogreliu, nes mažina kraujavimo iš skrandžio riziką. Būtent vartojant kartu klopidogrelį ir PPI, pastarojo vaisto efektyvumas padidėja, o klopidogrelio – sumažėja [28]. Gydant ezomeprazoliu toks efektas nepastebėtas [166].
Gydant kalcio kanalų blokatoriais ir kartu skiriant klopidogrelį, net iki 30 proc. sumažėja klopidogrelio terapinis antiagregacinis efektas. Vienas iš mechanizmų, kuris gali paaiškinti tokią sąveiką, gali būti toks, kad kalcio kanalų blokatoriai slopina CYP3A4, vieno iš klopidogrelį metabolizuojančių fermentų aktyvumą [179]. Panašus efektas stebimas ir skiriant kai kuriuos statinus (atorvastatiną) bei eritromiciną, kurie slopina būtent CYP3 fermentų šeimos aktyvumą. Skiriant 20 mg ir didesnes atorvastatino dozes, klopidogrelio aktyvumas ženkliai sumažėja ir gali įvykti trombozė dėl nepakankamo antiagregacinio poveikio [97]. Fluvastatinas gana stipriai blokuoja CYP2C9, taip pat pasižymi pakankamai stipriu CYP3A4 blokuojančiu efektu [49]. Skiriant kartu su klopidogreliu, jis gali slopinti klopidogrelio biotransformaciją ir mažinti terapinį efektyvumą. Nustatyta, kad statinai, nepaisant turimo fermentų (2B6, 2C9, 2C19, 3A4, 1A2) aktyvumą slopinančio efekto, skatina jų genų raišką. Atorvastatinas pasižymi stipriausiu efektu. Silpniau veikia simvastatinas, lovastatinas, rozuvastatinas, o pravastatinas iš viso neturi jokio genų raišką veikiančio efekto [46].
Priešgrybeliniai vaistai taip pat pasižymi klopidogrelio metabolizmą ir CYP3A4 aktyvumą slopinančiu efektu. Atliekant tyrimus su itrakonazoliu,
kuris stipriai blokuoja CYP3A4, nustatytas klopidogrelio metabolizmas kitu keliu – per CYP3A5 [88].
Klopidogrelio efektyvumas kinta įvairių patologinių būklių metu, taip pat vartojant vaistus, kurie slopina arba skatina CYP 450 fermentų metabolinį aktyvumą.
Tik nustačius ligonio CYP2C19 geno polimorfizmą bei įvertinus jo vartojamus vaistus bei ligas, kuriomis jis serga, galima numatyti klopidogrelio terapinį efektyvumą. Panašūs tyrimai Lietuvoje iki šiol nebuvo atliekami.
5. TIRTASIS KONTINGENTAS IR TYRIMŲ METODIKA
Tyrimai atlikti vadovaujantis Helsinkio Deklaracijos principais. Visi į tyrimą įtraukti ligoniai pasirašė sutikimo formas, patvirtintas Kauno regioninio bioetikos komiteto (2007m. gruodžio 4 d., protokolo Nr. 146/2007) ir (2008m. spalio 28d., protokolo Nr. 160/2008).
Tirtąjį kontingentą sudarė:
1. Ligoniai, kuriems 2009–2011 m. LSMU MA Širdies, krūtinės ir kraujagyslių chirurgijos klinikoje buvo atlikta širdies vožtuvų operacija ir paskirtas gydymas varfarinu (n=311). Jų vidutinis amžius buvo 66,12±12,06 metų. Jauniausiam ligoniui buvo 19 metų, o vyriausiam – 87 metai. Praėjus daugiau nei 3 mėnesiams po jiems atliktos širdies vožtuvų operacijos ligoniai pakartotinai pakviesti išsitirti kraujo krešėjimą. Toliau buvo tiriami tik tie ligoniai (n=195), kurie nuo pat gydymo varfarinu pradžios, nepertraukiamai ne mažiau nei 90 dienų vartojo varfariną. Išrašius iš ligoninės ligoniai varfariną vartojo mažiausiai 91 dieną, o ilgiausiai – 683 dienas. Jų vidutinis amžius 65,16±10,99 metai. Jauniausiam ligoniui buvo 26 metai, o vyriausiam – 86 metai.
2. Ligoniai, kurie nuo 2008m. iki 2010m. buvo gydyti klopidogreliu ir aspirinu VŠĮ Kauno klinikinės ligoninės Kardiologijos skyriuje dėl jiems įvykusių ūminių išeminių sindromų (n=180). Tiriami tik tie ligoniai, kurie anksčiau nevartojo klopidogrelio. Po ne trumpesnio kaip 14 dienų laikotarpio šie ligoniai buvo apklausiami, ar tęsia gydymą klopidogreliu ir aspirinu. Tęsiantiems nustatytą gydymą (n=93) buvo atliktas trombocitų agregacijos bei CYP2C19 (G681A) polimorfizmo tyrimas LSMU MA Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje. Jų vidutinis amžius 68,77±11,61 metai. Jauniausiam ligoniui buvo 32 metai, o vyriausiam – 90 metų.
3. Atsitiktinė gyventojų imtis. CYP2C9*1,*2,*3 ir VKORC1 (G–1639A) polimorfizmo dažnis buvo tiriamas atsitiktinėje 25–99 metų Lietuvos gyventojų imtyje (n=1230). Ši tyrimo grupė buvo sudaryta iš atsitiktinių imčių, surinktų, vykdant šias studijas: 1. CINDI (Countrywide
Integrated Noncommunicable Disease Intervention) studiją, kurią vykdė LSMU Biomedicininių tyrimų instituto Profilaktinės medicinos laboratorija. Šios studijos atsitiktinę imtį sudarė 25–65 metų kaimiškųjų Lietuvos rajonų gyventojai (Grabauskas, ir kt., 2008). 2. HAPIEE
(Health, Alcohol and Psychosocial factors In Eastern Europe) studija, kurią vykdė LSMU Kardiologijos instituto Populiacinių tyrimų laboratorija; 45–74 metų kauniečiai buvo atrinkti pagal Kauno miesto gyventojų registro duomenis, sistemiškai pasirinktu intervalu atrenkant asmenis pagal lytį (Peasey, ir kt., 2006). 3. Studiją „Sveikas senėjimas Kaune“ vykdė LSMU Geriatrijos klinika ir Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorija; vyresni negu 65 metų kauniečiai buvo atrinkti sistemiškai pasirinktu intervalu iš Kauno miesto gyventojų registro.
4. CYP2C19*1,*2 (rs4244285) polimorfizmo dažnis tirtas 45–99 metų asmenims (n=276). Ši grupė buvo sudaryta tik iš atsitiktinių HAPPIE bei „Sveikas senėjimas Kaune“ gyventojų imčių. Į šią grupę buvo įtraukti asmenys, atsižvelgiant į ligonių, kuriems buvo ūmūs išeminiai sindro-mai, amžių, todėl atsitiktinės imties (67,64±9,09 m.) ir tirtų ligonių (68,77±11,61 m.) vidutinis amžius nesiskyrė (p=0,33). Atsitiktinės gyventojų imties demografinė charakteristika ir tirtas geno polimor-fizmas pateiktas 5.1 lentelėje.
5.1 lentelė. Atsitiktinės gyventojų imties charakteristika
Lytis Amžius
Geno polimorfizmas Vyrai Moterys Iš viso: Vidurkis±SD metais
CYP2C9*1,*2,*3 566 664 1230 59,58±13,97
VKORC1 (G–1639A) 566 664 1230 59,58±13,97
CYP2C19*1,*2 122 154 276 67,64± 9,09
5.1. Ligonių, gydytų varfarinu po širdies vožtuvų operacijos, ištyrimas
5.1.1. Ligonių, gydytų stacionare po širdies vožtuvų operacijos, ištyrimas Ligonių, kuriems po atliktos širdies vožtuvų operacijos buvo numatoma paskirti gydymą varfarinu, kraujas geno polimorfizmo tyrimams buvo imamas iš venos į vieną 3ml tūrio mėgintuvėlį (su K2EDTA). Visi kiti tyrimo metu reikalingi ligonių duomenys buvo imami iš ligos istorijos (forma Nr. 003/a).
Buvo renkami šie ligonių klinikiniai duomenys: 1. Ligonio vartojama varfarino paros dozė. 2. Krešėjimo sistemos aktyvumas pagal TNS.
3. Kiti tuo pačiu metu vartojami vaistai: acetilcisteinas, AKF inhibitoriai (ramiprilis, perindoprilis, kvinaprilis, fosinoprilis, monoprilis),
alopurinolis, ambroksolis, amiodaronas, amoksicilinas, angiotenzino II receptorių blokatoriai (olmesartanas, irbesartanas, losartanas, valsar-tanas, telmisartanas), aspirinas, benzodiazepinai (bromazepamas arba lorazepamas), I ir II kartos cefalosporinai, ciprofloksacinas, diaprelis, diklofenakas, furozemidas ar torazemidas, ibuprofenas, insulinas, kalcio kanalų blokatoriai (amlodipinas, lacidipinas, verapamilis, lerkanidipinas, diltiazemas), ketorolakas, ketoprofenas, L–tiroksinas, metforminas, nimesulidas, nistatinas, paracetamolis, protonų pompos inhibitoriai, statinai (atorvastatinas, fliuvastatinas, rozuvastatinas), α– receptorių blokatoriai (doksazosinas, tamsulosinas), β–receptorių blokatoriai(bisoprololis, karvedilolis, metoprololis, nebivololis, betaksololis), β2 mimetikai (agonistai) (salbutamolis, salmeterolis, for-materolis), kiti kraujotaką gerinantys vaistai (moxonidinas, trimetazi-dinas, pentoksifilinas), ranititrimetazi-dinas, rilmenitrimetazi-dinas, spironolaktonas, tiapridalis, vankomicinas.
4. Gretutinės patologinės būklės: arterinė hipertenzija, prieširdžių virpė-jimas, diabetas, smegenų išemija, skrandžio opaligė, gastritas, ezofagi-tas, pneumonija, skydliaukės hipofunkcija ar hiperfunkcija bei dislipidemija.
5. Serumo kreatinino koncentracija kraujyje.
1–3 punkte paminėti rodikliai į statistinius skaičiavimus įtraukti imant tik tos dienos, kai tarptautinio normalizuoto santykio (TNS) reikšmė nekito 2 tyrimus iš eilės.
5.1.2. Ligonių, kurie praėjus daugiau nei 3 mėnesiams po atliktos širdies vožtuvų operacijos vartojo varfariną, ištyrimas
Praėjus trims mėnesiams po operacijos, pakartotinai atvykusių išsitirti ligonių kraujas LSMU MA Kardiologijos poliklinikoje buvo paimamas į vieną 3ml tūrio mėgintuvėlį biocheminiams tyrimams (mėgintuvėlis serumui atskirti) bei į du 4,5ml tūrio mėgintuvėlius (mėgintuvėliai su 3,8% natrio citratu) kraujo krešėjimo sistemos tyrimams. Kraujo krešėjimo ir biocheminiai kraujo tyrimai buvo atliekami akredituotoje Kauno „UAB Antėja, medicinos diagnostikos laboratorijoje“. Pakartotinai atvykusius ligonius konsultuodavo gydytojas kardiologas (dr. A.Veikutienė). Gydytojas kardiologas apžiūrėdamas ligonį surinkdavo šiuos ligonių duomenis:
1. Įvertindavo gretutines patologines būkles: arterinė hipertenzija, prie-širdžių virpėjimas, diabetas, smegenų išemija, pneumonija, skydliau-kės hipofunkcija ar hiperfunkcija.
2. Varfarino vartojimo komplikacijas (yra/nėra), tokias kaip kraujavimas: 28
a. iš dantenų b. iš nosies
c. iš virškinamojo trakto d. kraujas šlapime e. kraujosrūvos
3. Tą dieną vartojamą varfarino paros dozę (mg per parą)
4. Kitus vartojamus vaistus: AKF inhibitoriai (ramiprilis, perindoprilis, kvinaprilis, fosinoprilis, monoprilis), alopurinolis, amiodaronas, amoksicilinas, angiotenzino II receptorių blokatoriai (olmesartanas, irbesartanas, losartanas, valsartanas, telmisartanas), aspirinas, benzodiazepinai (bromazepamas arba lorazepamas), diaprelis, furozemidas ar torazemidas, insulinas, kalcio kanalų blokatoriai (amlodipinas, lacidipinas, verapamilis, lerkanidipinas, diltiazemas), L–tiroksinas, metforminas, protonų pompos inhibitoriai, statinai (atorvastatinas, fliuvastatinas, rozuvastatinas), α–receptorių blokatoriai (doksazosinas, tamsulosinas), β–receptorių blokatoriai (bisoprololis, karvedilolis, metoprololis, nebivololis, betaksololis), kiti kraujotaką gerinantys vaistai (moxonidinas, trimetazidinas, pentoksifilinas), rilmenidinas, spironolaktonas.
5. Iš laboratorijos gavus atsakymą, įvertindavo biocheminių tyrimų rezultatus:
a. krešėjimo sistemos aktyvumą pagal TNS,
b. serumo šarminės fosfatazės (ŠF), gliutamat–oksalacetat–transami-nazės (GOT) ir gliutamat–piruvat–transamigliutamat–oksalacetat–transami-nazės (GPT) aktyvumą, c. skydliaukės veiklą stimuliuojančio hormono (TTH) aktyvumą ir
laisvo tiroksino (FT4) koncentraciją, d. serumo kreatinino koncentraciją.
5.2. Ligonių gydytų klopidogreliu po įvykusių ūmių išeminių sindromų, ištyrimas
Ligoniai, kurie buvo gydyti klopidogreliu ir aspirinu VŠĮ Kauno 2–osios Klinikinės ligoninės Kardiologijos skyriuje dėl jiems įvykusių ūminių išeminių sindromų, buvo kviečiami atvykti praėjus 14 dienų nuo pirmos suvartotos antiagregantų dozės. Kraujas DNR tyrimams buvo imamas į vieną 3ml tūrio mėgintuvėlį su K2EDTA bei į vieną 4,5ml tūrio mėgintuvėlį (su 3,8% natrio citratu) trombocitų agregacijai su ADF (adenozindifosfatu). Visi kiti tyrimo metu reikalingi ligonių duomenys buvo renkami analizuojant ligos istorijas (forma Nr. 003/a).
Iš ligos istorijų buvo renkami šie ligonių klinikiniai duomenys: 1. Ligonio amžius, ūgis, svoris bei kūno masės indeksas (KMI).
2. Diabetas, inkstų ir kepenų funkcijos sutrikimas.
3. Greta vartojami vaistai: AKF inhibitoriai (ramiprilis, perindoprilis, kvinaprilis, fosinoprilis, monoprilis), angiotenzino II receptorių blokatoriai (olmesartanas, irbesartanas, losartanas, valsartanas, telmisartanas), β–receptorių blokatoriai (bisoprololis, karvedilolis, metoprololis, nebivololis, betaksololis), statinai (atorvastatinas, fluvastatinas ir rozuvastatinas), omeprazolis, amiodaronas.
5.3. Genų CYP2C9*1,*2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910), VKORC1 (G– 1639A) (rs9923231), VKORC1 (G3730A) (rs7294), CYP4F2 (G1347A) (rs2108622) ir CYP2C19*1, *2 (rs4244285) polimorfizmo tyrimas tikro
laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu
5.3.1. Genominės DNR išskyrimas iš kraujo
Iš 3 ml kraujo, kuris buvo paimtas į mėgintuvėlius su antikoaguliantu K2EDTA, buvo išskiriama genominė DNR. Genominės DNR išskyrimas buvo atliekamas šia seka:
1. Eritrocitai buvo suardomi mėgintuvėlyje esantį kraują užpylus iki 15 ml tūrio eritrocitų lizės buferiniu tirpalu1 ir maišant 10 min. Centrifūguojant 2500 G jėga, leukocitai buvo nusodinami ant mėgintuvėlio dugno, o skystis nupilamas.
2. Gauti leukocitai užpilami branduolių lizės tirpalu2, kuris suardydavo baltymus, sudarančius leukocitų ir jų branduolių membranas. Tirpalas, kuriame būdavo ištirpusi DNR, užpilamas 1 ml trichlormetano ir 1 ml 6 M NaCl tirpalu, stipriai suplakamas ir centrifūguojamas 10 min 2500 G.
3. Gautas viršutinis tirpalo sluoksnis perkeliamas į kitą mėgintuvėlį, užpilami 2 tūriai gryno etanolio bei lėtai maišoma. Išsiskyrusi DNR išplaunama 70 proc. etanoliu ir išdžiovinus ištirpinama PGR grynumo vandenyje (skirtame atlikti PGR reakciją) esant kambario tempe-ratūrai.
1 – eritrocitų lizės buferinio tirpalo sudėtis: 3,85 g NH
4Cl ir 0,42 g
NaHCO3, kurie ištirpinti 500–uose mililitruose išgryninto vandens.
2 – branduolių lizės tirpalo sudėtis: 5ml TrisxHCl, 40ml 5M NaCl, 2ml 0,5M
EDTA, 50g natrio duodecilsulfato. Visa tai ištirpinta 500 ml išgryninto vandens.
Gauto DNR tirpalo grynumas vertintas matuojant spektrofotometru NanoDrop® 1000
5.3.2. Geno polimorfizmo nustatymas tikro laiko PGR metodu
Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijos (LSMU MA) Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje, naudojant tikro laiko PGR termociklerį „ABI 7900HT Fast Real–Time PCR“ (ABI, JAV) bei komercinius fluorescenciniais dažais FAM (fluoresceino amiditas) ir VIC® žymėtus „Taqman®“ (ABI, JAV) molekulinius žymenis, skirtus būtent minėtam polimofizmui tirti. Tikro laiko polimerazės grandininė reakcija atlikta standartinėmis gamintojo rekomenduojamomis sąlygomis pagal gamintojo pateiktą protokolą (laikantis temperatūros režimo bei sudėtinių reakcijos komponentų koncentracijų). Reakcijai atlikti naudotas universalus Taqman® 2x mišinys. Tirtosios DNR buvo imama 10ng, kaip rekomenduojama gamintojo. Be to, sunkiai nustatomo vieno nukleotido polimorfizmo CYP2C9*3, VKORC1
(G3730A) ir CYP4F2 (G1347A) ištyrimui buvo naudoti gamintojo validuoti „Taqman®“ molekuliniai žymenys.
Standartinės reakcijos sąlygos genotipavimo reakcijai paruošti : 1. Taqman® molekulinių žymenų – 1,25 µl (20x) (ABI, JAV)
2. Taqman® 2X universalaus reakcijos mišinio – 12,5 µl (ABI, JAV) 3. PGR grynumo vandens – 10,25 µl (Fermentas, Lietuva)
4. 1 µl genominės DNR (10–30 ng/tyrimui). Gausinimo ciklai:
1. 95°C – 10 min. 2. 95°C – 15 sek. 3. 60°C – 90 sek.
2 ir 3 etapai kartojami 40 kartų.
5.4. Trombocitų agregacijos tyrimas optinės agregometrijos metodu
Tyrimas trombocitų funkcijai nustatyti buvo atliktas LSMU MA Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje. Trombocitų agregacija buvo matuojama remiantis klasikiniu Born`o metodu, atsižvelgiant į šviesos pralaidumo kitimą trombocitinėje plazmoje, paveikus 3,6 μmol/l adenozindifosfatu (ADF), palyginus su betrombocitinės plazmos šviesos pralaidumu. Betrombocitinės plazmos šviesos pralaidumas prily-ginamas 100%. Gautas santykinis dydis išreiškiamas agregacijos rodikliu (%agr), pagal formulę: šviesos pralaidumas trombocitinėje plazmoje/šviesos pralaidumo betrombocitinėje plazmoje. Agregacijos pokyčiai matuoti Chronolog 492 (JAV) optiniu agregometru. Trombocitinė plazma buvo
paruošiama centrifūguojant kraują 15min 100G. Iš trombocitinės plazmos paruošiama betrombocitinė plazma, centrifūguojant 30 min 1000G.
5.5. Biocheminių kraujo tyrimo rezultatų vertinimas
Biocheminius kraujo tyrimus atliko „UAB Antėja, medicinos diagnos-tikos laboratorija“.
1. Krešėjimo sistemos aktyvumo (TNS) terapinės ribos, gydant varfarinu 2<TNS<3,5.
2. Vyrams serumo gliutamat–oksalacetat–transaminazės (GOT) ir serumo gliutamat–piruvat–transaminazės (GPT) aktyvumas <40U/l. 3. Moterims serumo gliutamat–oksalacetat–transaminazės (GOT) ir
serumo gliutamat–piruvat–transaminazės (GPT) aktyvumas <35U/l. 4. Vyrams ir moterims šarminės fosfatazės (ŠF) aktyvumas 40–129U/l. 5. Serumo kreatinino koncentracija vyrams – nuo 80 iki 115 μmol/l,
moterims nuo 53 iki 97 μmol/l.
6. Laisvo tiroksino (FT4) koncentracija kraujo serume turėjo būti nuo 11,5 iki 22,7 pmol/l, o tireotropino (TTH) aktyvumas turėjo būti nuo 0,55 iki 4,78 mIU/l.
5.6. Statistinė duomenų analizė
Tyrimo rezultatai pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Skirtumas laikomas statistiškai reikšmingas, kai p≤0,05. Ligonių ir atsitiktinės imties asmenų genotipų dažnis pateiktas procentais. Pearson tiesinės koreliacijos koeficientas naudotas vertinant ligonių, gydytų klopidogreliu, antropometrinių ir klinikinių rodiklių sąsajas su trombocitų agregacijos rodikliu. Varfarino dozavimo algoritmas parengtas naudojant tiesinės regresijos metodą, į modelį įtraukiant tik tuos kintamuosius, kurie statistiškai reikšmingai (p<0,05) didino modelio patikimumą. Sudarant varfarino dozavimo algoritmus, CYP4F2 (G1347A) ir VKORC1 (G3730A) įtaka įvertinta suskirsčius ligonius į homozigotus A/A bei turinčius G alelį.
6. PAGRINDINIAI DARBO REZULTATAI
6.1. Klinikinių ir genetininių veiksnių įtaka vidutinei paros varfarino dozei ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu, atlikus širdies vožtuvų
operaciją
Vidutinis ligonių, gydytų varfarinu ankstyvuoju pooperaciniu periodu TNS buvo 2,74±0,95. Šiems ligoniams buvo skiriama 5,70±2,84 mg per parą varfarino dozė. Reikiamas terapinės hipokoaguliacijos efektas (terapinės ribos: 2≤TNS≤3,5) pasiektas 64,3 proc. ligonių (n=200) (6.1.1 lentelė), tačiau 15,8 proc. ligonių (n=49) turėjo aukštą TNS (>3,5), o 19,9 proc. (n=62) ligonių buvo nepasiektas reikiamas (<2) TNS.
6.1.1 lentelė. Ligonių, vartojusių varfariną ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu, kraujo krešėjimo rodiklių (TNS) pasiskirstymas ir skiriama varfarino paros dozė
TNS n, (proc.) Varfarino dozės vidurkis±SD mg
>3,5 49 (15,8) 4,63±2,05
≤2 ir ≤3,5 200 (64,3) 5,62±2,71
<2 62 (19,9) 6,81±3,39
Iš viso: 311 (100) 5,70±2,84
Pastaba: TNS – tarptautinis normalizuotas santykis
6.1.1. Gretutinės patologinės būklės ir jų įtaka vidutinei varfarino paros dozei
Palyginome ligoniams skiriamą vidutinę varfarino paros dozę, kai yra ir nėra įvairių gretutinių patologinių būklių ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu (6.1.1.1 lentelė). Nustatėme, kad tik ligoniams, turintiems padidėjusią serumo kreatinino koncentraciją, reikėjo mažesnių varfarino dozių palyginus su turėjusiais normalią serumo kreatinino koncentraciją (atitinkamai 5,20±2,74 mg per parą ir 5,90±2,86 mg per parą, p=0,04). 6.1.2. Ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu vartojamų vaistų įtaka vidutinei varfarino paros dozei
Statistiškai reikšmingai (p<0,05) mažesnių varfarino paros dozių reikėjo ligoniams, kuriems skirti šie vaistai: ambroksolis, amiodaronas, ir β2 mimetikai. Ligoniams, kuriems buvo skirtas ketoprofenas, reikėjo didesnių varfarino paros dozių nei nevartojantiems jo (6.1.2.1 lentelė). Ligoniams, kuriems skirtas omeprazolis, reikėjo mažesnių varfarino dozių (5,11±2,53
mg per parą), nei jo nevartojantiems (5,87±2,90 mg per parą), p=0,05. Kitų vaistų naudojimas neturėjo įtakos vidutinei varfarino paros dozei. Šie duomenys pateikti priedo 1,2,3 lentelėse.
6.1.1.1 lentelė. Ligonių, vartojusių varfariną po širdies vožtuvo
operacijos, gretutinės patologinės būklės ir vidutinė varfarino paros dozė
Rodiklis n Proc. Varfarino paros dozė vidurkis±SD mg p Arterinė hipertenzija Yra Nėra 230 81 74,0 26,0 5,54±2,69 6,16±3,20 0,09 Prieširdžių virpėjimas Yra Nėra 93 218 9,9 70,1 5,63±2,65 5,73±2,92 0,77 Diabetas Yra Nėra 267 44 14,1 85,9 5,33±2,12 5,76±2,94 0,35 Galvos smegenų mikro–
cirkuliacijos sutrikimas Yra Nėra 291 20 93,6 6,4 4,57±1,72 5,78±2,89 0,06 Skrandžio opaligė, gastritas, ezofagitas Yra Nėra 71 240 22,8 77,2 5,18±2,72 5,85±2,86 0,08 Lėtinė obstrukcinė plaučių liga Yra Nėra 293 18 94,2 5,8 6,08±3,50 5,68±2,80 0,56 Skydliaukės funkcija* Hipotireozė Norma Hipertireozė 12 297 2 3,9 95,5 0,6 6,54±2,43 5,64±2,84 10,00±0,00 0,28 Inkstų funkcija
Padidėjęs serumo kreatininas Normalus serumo kreatininas
89 222 28,6 71,4 5,20±2,74 5,90±2,86 0,04 Dislipidemija Yra Nėra 134 177 43,1 56,9 5,45±2,55 5,89±3,04 0,17 Pastaba: * – skirtumas tarp hipotireozės ir normalios skydliaukės funkcijos
6.1.2.1 lentelė. Ligonių po širdies operacijos kartu su varfarinu vartoti vaistai, nuo kurių priklausė vidutinė varfarino paros dozė
Vaistas n Proc. Varfarino paros dozė
vidurkis±SD mg p Ambroksolis Vartoja 22 7,1 4,30±1,89 Nevartoja 289 92,9 5,81±2,87 0,01 Amiodaronas Vartoja 95 30,5 4,66±2,63 Nevartoja 216 69,5 6,16±2,81 <0,01 Ketoprofenas Vartoja 225 72,3 5,94±2,90 Nevartoja 86 27,7 5,07±2,58 0,01 β2 mimetikai* Vartoja 11 3,5 3,90±2,13 Nevartoja 300 96,5 5,77±2,84 0,03 Omeprazolis Vartoja 65 20,9 5,11±2,53 Nevartoja 246 79,1 5,87±2,90 0,05 Pastaba: *– β2 mimetikai (agonistai) : salbutamolis, salmeterolis, formaterolis
6.1.3. Ligonių genų CYP2C9*1,*2,*3, VKORC1 (G–1639A) ir VKORC1 G3730A, CYP4F2 G1347A polimorfizmo dažnis ir vartojama varfarino paros dozė ankstyvuoju pooperaciniu periodu
Geno polimorfizmo dažnis ir ligonių vartojama vidutinė varfarino paros dozė, atsižvelgiant į genotipą, pateikiama 6.1.3.1 lentelėje.
CYP2C9*1/*1 (wt) genotipas nustatytas 71,4 proc. ligonių, gydytų varfarinu ankstyvuoju pooperaciniu periodu. Šiems ligoniams skirtos didžiausios varfarino paros dozės (6,05±2,94 mg). Mažiau, varfarino (5,54±2,55 mg per parą) reikėjo skirti *1/*2 genotipą turintiems ligoniams (14,8 proc. visų ligonių). CYP2C9 *1/*3, *2/*2 ir *2/*3 genotipą turintiems ligoniams (atitinkamai 9,6 proc., 2,6 proc. ir 1,6 proc. tirtųjų ligonių imties) skirtos mažiausios įsotinamosios varfarino paros dozės.
VKORC1 (G–1639A) heterozigotų nustatėme 47 proc. Šiems ligoniams po operacijos buvo skiriamos mažesnės (5,37±2,63 mg per parą) varfarino dozės, palyginus su G/G homozigotais (6,75±2,88 mg per parą), o A/A homozigotams reikėjo net perpus mažesnių dozių (3,48±1,69 mg per parą), nei G/G homozigotams. Homozigotų G/G ir A/A ligonių imtyje buvo atitinkamai 40,8 proc. ir 12,2 proc.
VKORC1 (G3730A) homozigotų A/A nustatėme tik 22,8 proc. Šiems ligoniams reikėjo didžiausių varfarino paros dozių – 7,13±2,88 mg per parą. Tuo metu heterozigotams G/A reikėjo mažesnių varfarino dozių (5,67±2,67
mg per parą), o G/G homozigotams dar mažesnių – 4,87±2,67 mg per parą.
VKORC1 G/G homozigotų ir G/A heterozigotų nustatėme atitinkamai: 38,0 proc ir 39,2 proc. ligonių. Tiriamųjų imtyje 56,3 proc. ligonių turėjo
CYP4F2 (G1347A) homozigotinį G/G genotipą, o 38,6 proc. turėjo G/A genotipą. Varfarino paros dozė šiems ligoniams statistiškai reikšmingai nesiskyrė (p=0,8). Remdamiesi gautais duomenimis, nustatėme jog tiems ligoniams, kuriems nustatytas CYP4F2 G alelis (jų buvo 94,9 proc.), ankstyvuoju pooperaciniu periodu skirtos statistiškai reikšmingai mažesnės varfarino paros dozės (5,61±2,77 mg) nei tiems, kurie turėjo A/A genotipą (7,31±3,68 mg).
6.1.3.1 lentelė. Ligonių CYP2C9, VKORC1 ir CYP4F2 genotipo dažnis bei genotipo įtaka varfarino paros dozei ankstyvuoju pooperaciniu laikotarpiu
Genotipas n Proc. Varfarino paros dozė vidurkis±SD mg CYP2C9 *1/*1 222 71,4 6,05±2,94 CYP2C9 *1/*2 46 14,8 5,54±2,55 CYP2C9 *1/*3 30 9,6 4,14±1,87 CYP2C9 *2/*2 8 2,6 3,81±2,08 CYP2C9 *2/*3 5 1,6 4,10±2,16 CYP2C9 *3/*3 0 0,0 – Iš viso: 311 100,0 5,70±2,84 VKORC1 (G–1639G) 127 40,8 6,75±2,88 VKORC1 (G–1639A) 146 47,0 5,37±2,63 VKORC1 (A–1639A) 38 12,2 3,48±1,69 Iš viso: 311 100,0 5,70±2,84 VKORC1 (G3730G) 118 38,0 4,87±2,67 VKORC1 (G3730A) 122 39,2 5,67±2,67 VKORC1 (A3730A) 71 22,8 7,13±2,88 Iš viso: 311 100,0 5,70±2,84 CYP4F2 (G1347G) 175 56,3 5,58±2,78 CYP4F2 (G1347A) 120 38,6 5,66±2,77 CYP4F2 (A1347A) 16 5,1 7,31±3,68 Iš viso: 311 100,0 5,70±2,84
6.1.4. Genų variantų derinių įtaka varfarino paros dozei
CYP2C9 metabolizuoja S–varfariną, todėl atsižvelgiant į šio geno polimorfizmą, sudaryti genų variantai su VKORC1 (G–1639A) (6.1.4.1 lentelė) ir VKORC1 (G3730A) (6.1.4.2 lentelė) bei CYP4F2 (G1347A) (6.1.4.3 lentelė).
