Varfarino farmakogenetika : CYP4F2 (G1347A) genotipo svarba dozuojant varfariną po širdies vožtuvų operacijos

1 LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA MEDICINOS FAKULTETAS KARDIOLOGIJOS INSTITUTAS

MOLEKULINĖS KARDIOLOGIJOS LABARATORIJA

Gintarė Martinkutė

Varfarino farmakogenetika : CYP4F2 (G1347A)

genotipo svarba dozuojant varfariną po širdies vožtuvų

operacijos

Mokslinis darbas

Darbo vadovas: Dr. Vacis Tatarūnas

2

Turinys

5. Etikos komiteto leidimas ... 5

6. Santrumpos ... 6

7. Įvadas ... 7

8. Darbo tikslas ir uždaviniai ... 8

9. Literatūros apžvalga ... 9

9.1 Antikoaguliantai ... 9

9.2 Varfarino reikšmė po širdies vožtuvų operacijų ... 9

9.3 Varfarino veikimo mechanizmas ... 10

9.4 Varfarino farmakokinetika ... 11

9.5 Varfarino farmakokinetika, nulemta gretutinių veiksnių ... 12

9.6 Varfarino farmakodinamika ir VKORC1 genotipas ... 13

9.7 Farmakogenomika ... 13

9.8 Uždegiminių veiksnių įtaka varfarino efektyvumui ... 14

10. Laboratorinių genetinio ištyrimo metodų apžvalga ... 16

10.1 DNR - dezoksiribonukleorūgštis ... 16

10.2 DNR - išskyrimas ... 17

10.3 DNR kokybės ir koncentracijos nustatymas ... 17

10.4 Genotipo tyrimas polimerazės grandinės reakcijos metodu ... 18

3

1. Santrauka

Darbo tikslas – įvertinti genetinių (CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3, CYP4F2 (G1347A)

genotipų) ir klinikinių veiksnių įtaką parenkant varfarino dozę po širdies vožtuvų operacijos įsotinimo ir ilgalaikio gydymo metu. Iškelti uždaviniai padės nustatyti CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3, CYP4F2 (G1347A) genotipų ir klinikinių veiksnių įtaką.

Darbo metodika. 175 pacientai, po širdies vožtuvų operacijų, buvo ištirti varfarino

įsotinimo metu. Antro tyrimo metu, t.y praėjus 3 mėnesiams, ištirti 113 pacientų. Iš ligos istorijų buvo renkama ši informacija - antropometriniai, klinikiniai duomenys (biocheminiai rodikliai, naudojami vaistai, turimi žalingi įpročiai) ir kraujo krešumo rodiklis - tarptautinis normalizuotas santykis (TNS, angl. INR). Visiems pacientam atliktas šių genų: CYP2C9 *2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910), VKORC1 *2 (rs9934438), VKORC1 *3 (rs7294) bei CYP4F2 (G1347A) genotipo tyrimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu. Statistinės analizės atlikimas - kiekybiniai kintamieji, pasiskirstę pagal normalųjį skirstinį, pateikti vidurkiais ir standartiniais nuokrypiais (vidurkis ± SN). Dažnis pateiktas procentais (proc.). Skirtumas laikytas statistiškai reikšmingu, jei reikšmingumo lygmuo p<0.05.

Darbo rezultatai. Varfarino įsotinimo metu pacientams, po širdies vožtuvų operacijų, naudojantiems amiodaroną, buvo reikalingos mažesnės dozės negu jo nevartojatiems. Esant stabiliai varfarino dozei, pacientams buvo reikalingos mažesnės varfarino dozės, jeigu jie vartojo bent vieną iš šių medikamentų - torazemidą, kalcio kanalų blokatorius ar benzodiazepinus. Pacientai ilgalaikio gydymo metu su padidėjusiu kreatinino kiekiu ar padidėjusiu šarminės fosfatazės aktyvumu vartojo mažesnes varfarino dozes nei esant normos rodikliams. Pacientams, turintiems žalingų įpročių (rūkymą ar alkoholio vartojimą), nuolatos vartojant varfariną buvo reikalingos didesnės dozės. Be klinikinių faktorių varfarino dozėms įtakos turėjo šie genotipai tiek įsotinimo metu, tiek pastovaus vartojimo : CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo mažesnes varfarino dozes negu laukinio tipo homozigotai, VKORC1 C1173T C/C genotipą turintiems reikėjo didesnių varfarino dozių negu C/T ir T/T genotipo turėtojiems, VKORC1 G3730A G/G genotipo turėtojai vartojo mažesnes varfarino dozes nei A/A turintys ligoniai. Tik varfarino įsotinimo metu reikšmingos įtakos turėjo CYP4F2 G1347A - G/G genotipą turintys pacientai vartojo mažesnes dozes negu A/A genotipo turėtojai.

Išvados. Varfarino dozavimui įtakos turi klinikiniai faktoriai: kreatinino kiekis bei šarminės

4

2. Summary

Objective and tasks. Evaluate and determine whether CYP2C9 *2, *3, VKORC1 *2, *3 and CYP4F2 G1347A genotypes and clinical factors contribute to warfarin dosage in patients after heart valve surgeries.

Methods. During the initiation of warfarin therapy, 175 patients, who had heart valve surgeries, were included in the study. During the long term treatment, 113 patients were examined. Medical records were used to collect the following information: anthropometric data, clinical data (biochemical tests, used medications, addictions) and patient INR results. Genomic DNA was extracted from peripheral blood. The real – time polymerase chain reaction was used to detect CYP2C9 * 2 (rs1799853) and *3 (rs1057910), VKORC1 *2 (rs9934438), VKORC1 *3 (rs7294) and CYP4F2 G1347A genotypes. Statistical analysis – results are presented as mean and standard deviation (mean ± SD). A p≤0,05 was taken as statistically significant. Frequency of genotypes and alleles in patient’s sample is presented in % (percent).

Results. For patients, recovering after heart valve surgeries and using amiodarone during initiation, lower doses of warfarin were needed as compared to patients who didn’t use amiodarone. During the long – term treatment period, the users of torasemide, calcium channel blockers and benzodiazepines, required less warfarin as compared to non-users. During the long term warfarin treatment, patients with elevated creatinine or elevated alkaline phosphatase activity, received less warfarin as compared to patients with normal levels. Patients with addictions (smoking and alcohol consumption) required higher doses of warfarin. Besides clinical factors, warfarin dosage was influenced by these gene polymorphisms (during initiation of the warfarin therapy and also during the long term treatment): CYP2C9*1*3 heterozygous used less warfarin as compared to wild-type homozygous, VKORC1 C1173C carriers required higher doses of warfarin than C/T and T/T genotype carriers, VKORC1 G3730G carriers required lower doses of warfarin compared to A/A genotype carriers. Only during initiation the carriers of CYP4F2 A1347A required more warfarin, as compared to CYP4F2 G/G cariers.

5

3. Padėka

Už palaikymą, naudingus patarimus, taiklią kritiką dėkoju darbo vadovui Vaciui Tatarūnui.

4. Interesų konfliktas

Interesų konflikto nebuvo.

5. Etikos komiteto leidimas

6

6. Santrumpos

AKFI – angiotenziną konvertuojančio fermento inhibitorius (slopiklis) ALT - alaninaminotransferazė

ARA – arachidono rūgštis AST - aspartataminotransferazė CD – cukrinis diabetas

CYP3A4 - citochromo P450 superšeimos3 šeimos A pošeimio 4 polipeptidas CYP2C19 – citochromo P450 superšeimos 2 šeimos C pošeimio 19 polipeptidas CYP2C9 – citochromo P450 superšeimos 2 šeimos C pošeimos 9 polipeptidas CYP4F2 – citochromo P450 superšeimos 4 šeimos F pošeimio 2 polipeptidas DATL – dalinis aktyvintas tromboplastino laikas

DNR – dezoksiribonukleino rūgštis EDTA - etilendiamino tetraacetatas GFG – glomerulų filtracijos greitis HETE – hidroksieikozatetraeno rūgštis

HPETE - hidroksiperoksieikosatetraenoinė rūgštis IC50 – vaisto afinitetas

IFN – inkstų funkcijos nepakankamumas Imax – maksimalus vaisto slopinimo faktorius KMI – kūno masės indeksas

LTB4 – leuktrienas B4

PGR – polimerazės grandinės reakcija PT – protrombino laikas

RNR - riboksinukleorūgštis

SPA – Stago protrombino indeksas ŠF – šarminė fosfatazė

TNS – tarptautinis normalizuotas santykis TSH – tirotropinis hormonas

TxA2 – tromboksanas A2

VKOR – vitamino K epoksido reduktazė

7

7. Įvadas

Varfarinas (vitamino K antagonistas) – vienas populiariausių antikoaguliantų pasaulyje, naudojamas pirminei ir antrinei veninių ir arterinių tromboembolijų profilaktikai ir gydymui atlikus širdies vožtuvų operacijas. Šiuo metu daugėja pacientų po širdies vožtuvų protezavimo operacijų. Nepaisant to, kad varfarinas naudojamas daugiau kaip 50 metų, iki šiol lieka vienu efektyviausių antikoaguliantų. Varfarinas turi ir keletą trūkūmų – siaurą terapinį langą, uždelstą veikimo pradžią ir pabaigą, sąveikauja su vaistais bei maistu, todėl klinikinėje praktikoje tinkamas šio vaisto paskyrimas yra sudėtingas [52,57]. Vitamino K antagonistų poveikis turi būti periodiškai vertinamas tiriant tarptautinį normalizuotą santykį (TNS, angl. INR), tiek įsotinimo dozė, tiek nuolatinio vartojimo metu dozė parenkama kiekvienam pacientui individualiai [57]. Po širdies vožtuvų operacijų siekiamas TNS dažniausiai yra nuo 2 iki 3, bet tai gali priklausyti nuo protezuojamo vožtuvo. Po mitralinio mechaninio vožtuvo protezavimo rekomenduojama TNS 2,5 – 3,5, po biologinių vožtuvų protezavimo bei po aortos mechaninio vožtuvo protezavimo 2-3 [53,59,62].

Žalingi įpročiai (pvz.: rūkymas), maistas, kuriame gausu vitamino K, o taip pat tos medžiagos, kurios slopina arba, priešingai, skatina varfarino metabolizme dalyvaujančių fermentų aktyvumą [27,41,42], gali daryti įtaką vartojamo varfarino dozei. Antropometriniai duomenys (pvz.: kūno svoris ir kt.), klinikiniai faktoriai (pvz.: kreatinino kiekis ir kt.) ir naudojami medikamentai yea svarbūs varfarino metabolizmui bei efektyvumui [38]. Dirbtinė kraujo apytaka operacijos metu, žaizdų infekcijos pooperaciniu periodu, uždegimo stiprumas turi įtakos dozuojant varfariną [54].

8

8. Darbo tikslai ir uždaviniai

Darbo tikslas : Įvertinti genetinių (CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3, CYP4F2 (G1347A)

genotipų) ir klinikinių veiksnių įtaką parenkant varfarino dozę po širdies vožtuvų operacijos.

Darbo uždaviniai:

1. Nustatyti klinikinių veiksnių įtaką ligoniams, kuriems skiriama įsotinimo ir ilgalaikio gydymo varfarino dozė, po širdies vožtuvų operacijų.

2. Nustatyti CYP2C9 *2, *3 ir VKORC1 *2, *3 genotipų įtaką ligoniams, kuriems skiriama įsotinimo ir ilgalaikio gydymo varfarino dozė, po širdies vožtuvų operacijų.

9

9. Literatūros apžvalga

9.1 Antikoaguliantai

Trombozės profilaktikai ir gydymui daugelį dešimtmečių vartojami antikoaguliantai: ūminės trombozės atvejais – parenteriniai (heparinas ir jo dariniai), ilgalaikiam gydymui – geriamieji antikoaguliantai. Vienas iš populiariausių geriamųjų antikoauguliantų jau ilgą laiką yra varfarinas. Deja, vitamino K antagonistai turi keletą trūkumų, kurie klinikinėje praktikoje riboja saugų ir efektyvų gydymą šiais vaistais. Jie pasižymi uždelsta veikimo pradžia ir pabaiga. Vitamino K antagonistų poveikis turi būti periodiškai vertinamas tiriant TNS, o dozė parenkama pagal sudėtingą dozavimo schemą. Šios grupės vaistams būdingos siauros terapinio poveikio ribos, sąveika su vaistais, maisto produktais. Pacientų genotipas taip pat turi įtakos varfarino dozavimui. Nepaisant kruopštaus dozės titravimo, kartotinių TNS tyrimų rezultatai dažnai neatitinka terapinio poveikio ribų, o tai gali didinti tiek tromboembolinių komplikacijų, tiek kraujavimo riziką [57].

Šiuo metu yra atsiradę naujieji antikoaguliantai, kurie skirstomi į dvi grupes - geriamieji tiesioginiai Xa faktoriaus inhibitoriai (rivaroksabanas, apiksabanas ar kt.) ir geriamieji tiesioginiai trombino inhibitoriai (dabigatranas ar kt.). Svarbu, kad šie medikamentai kitaip nei varfarinas , blokuojantys daugelį nuo vitamino K priklausomų krešėjimo faktorių (VII, IX, X ir kt.), slopina tik vieno kurio nors krešėjimo kaskados komponento (pvz.: trombino arba Xa faktoriaus) aktyvumą. Naujųjų antikoaguliantų privalumai - tikslinis efektas, nereikalingas monitoravimas, mažesnė kitų vaistų bei maisto sąveika su šiais antikoaguliantais, labiau prognozuojamas pusinis eliminacijos laikas, geresnis veiksmingumo/saugos santykis. Bet šie medikamentai turi ir trūkumų. Vienas dažniausių literatūroje aprašomų naujųjų antikoaguliantų trūkumų yra pagrindinis jų eliminavimo kelias per inkstus. Esant vidutiniam inkstų funkcijos nepakankamumui (IFN), kraujavimo profilaktikai rekomenduojama sumažinti rivaroksibano ir dabigatrano dozę, o esant terminaliniam IFN (glomerulų filtracijos greitis (GFG) <15 ml/min.), šie medikamentai yra kontraindikuotini [55]. Aprašomos ir kitos klinikinės situacijos, kai naujųjų antikoaguliantų vartojimas neužtikrina geresnių išeičių nei varfarinas. Nė vienas naujasis antikoaguliantas nėra patvirtintas pacientams su mechaniniais širdies vožtuvais, esant ūmiai venų trombinei embolijai, sergant onkologinėmis ligomis, nėštumo metu, antifosfolipidinio sindromo atveju [56]. Tad šiuo metu po širdies vožtuvų operacijų Lietuvoje yra naudojamas varfarinas.

10 Šiuo metu vis daugėja pacientų po širdies vožtuvo protezavimo operacijų. Protezų trombogeniškumas buvo ir yra vienas iš veiksnių, kuris daugeliu atvejų lemia ligonių mirtingumą po operacijos. Kaip buvo mintėta, varfarinas yra naudojamas po širdies vožtuvų protezavimo operacijų, norint išvengti tromboembolinių komplikacijų. Varfarinas, naudojamas po operacijų, mažina tromboembolinių komplikacijų riziką iki 1-2 proc. per metus [59], tačiau jis turi būti skiriamas individualiai [60]. Pacientams, kuriems protezuotas mechaninis vožtuvas, tromboembolinės komplikacijos yra dažnesnės negu protezuojant biologinį vožtuvą [61]. Pacientai su biologiniu širdies vožtuvu po operacijos varfariną naudoja 3 mėnesius, o su mechaniniu širdies vožtuvo protezu visą gyvenimą ir TNS dažniausiai palaikomas tarp 2-3 (po mechaninio mitralinio vožtuvo protezavimo – 2,5 - 3,5, po biologinių vožtuvų protezavimo bei aortos mechaninio vožtuvo protezavimo 2-3) [59,62].

Perdozavus varfarino pirmiausia reikia nutraukti jo vartojimą. Toliau gydymo taktika priklauso nuo klinikos ir TNS kiekio. Jei TNS 4,5 - 10 ir pacientas nekraujuoja, tuomet nereikia skirti vitamino K. Jeigu TNS>10, nors pacientas ir nekraujuoja, arba pacientas kraujuoja ir neatsižvelgiant į TNS yra skiriamas vitaminas K. Esant urgentinėms būklėms vartojama šviežiai šaldyta plazma ar dar retesniais atvejais - krešėjimo faktorių koncentratas [61].

Pacientams, po mechaninio širdies vožtuvo protezavimo, kurie privalo vartoti varfariną, planuojant bet kokią intervencinę procedūrą reikia specialaus pasiruošimo. Prieš didelės apimties operacijas, pacientai nevartoja varfarino apie 48-72val, kai TNS<2,0, rekomenduojama skirti hepariną, kad dalinis aktyvintas tromboplastino laikas (DATL) būtų palaikomas tarp 55 - 70s. Sustabdyti hepariną 4-6val. prieš operaciją. Pacientams su širdies vožtuvu, esant skubiai intervencijai, varfarino neutralizavimui geriau skirti ne šviežią šaldytą plazmą, bet protrombino komplekso koncentratą – taip išvengiama tūrio perkrovos [57].

Pacientai po širdies vožtuvų operacijų privalo vartoti varfariną ir tai sumažina tromboembolines komplikacijas, kas ilgina pacientų išgyvenamumą. Bet svarbu žinoti, kad vartojant varfariną, reikia sekti TNS ir dažniausiai palaikyti ribas tarp 2-3, kadangi kitaip gydymas gali būti nepilnavertis ir tuomet galimos komplikacijos – kraujavimas ar tromboembolija, priklausomai nuo TNS.

9.3 Varfarino veikimo mechanizmas

11 Pacientų vartojamos varfarino tabletės sudarytos iš dviejų izomerų - S ir R mišinio. S izomerą pagrinde metabolizuoja fermentas CYP2C9, R izomerą metabolizuojantys fermentai - CYP2C19, CYP3A4. Varfarinas slopina VKORC. Veikiant varfarinui, oksiduota vitamino K forma negali būti verčiama aktyvia redukuota forma, taip sukeliamas dirbtinis vitamino K stygius ir toliau nebevyksta vitamino K karboksilinimas, o kepenyse slopinama nuo šio vitamino priklausančių krešėjimo faktorių sintezė (II, VII, IX, X ir proteinų C ir S) [24-25]. Be minėtų fermentų, svarbus ir CYP4F2, kuris redukuotą vitamino K forma hidroksilina ir taip mažina vitamino K aktyvumą.

9.4 Varfarino farmakokinetika

Varfarinas greitai ir gerai rezorbuojasi iš virškinamojo trakto ypač iš skrandžio ir dvylikapirštės žarnos. Maksimali vaisto koncentracija kraujo plazmoje pasiekiama per 2 – 6 val.. 90-99 proc. varfarino jungiasi su plazmos baltymais, todėl vaisto pasiskirstymo tūris yra santykinai mažas. Varfarinas beveik visas eliminuojamas vykstant lėtam metabolizmui kepenyse – susidaro metabolitai, kurie turi skirtingą aktyvumą [25]. Dažniausiai literatūroje pateikiamas bendras pusinės eliminacijos laikas – 36 val., tačiau S ir R izomerai savo poveikiu ir veikimo trukme nėra vienodi - S izomeras 3-5 kartus aktyvesnis negu R izomeras, bet atitinkamai greičiau yra pašalinamas [29]. Varfarino metabolitai yra pašalinami per šlapimo sistemą ir mažoji dalis per tulžį [25]. Dėl to, kad S ir R izomerus metabolizuoja skirtingi fermentai, o šių fermentus koduojančių genų polimorfizmai skirtingiems ligoniams gali būti kitokie, šių izomerų pusinis eliminanacijos laikas skirtingiems ligoniams nėra vienodas [26].

Varfarino efektui įvertinti atliekamas protrombino laiko tyrimas (angl. PT), kuris gali būti atliekamas Quick`o (TNS, angl INR) ir Owren`o metodais (Stago protrombino indeksas (angl. SPA));

12 TNS - tai paciento plazmos krešėjimo laiko ir vidutinio normalaus krešėjimo laiko santykis. Tiek SPA, tiek ir TNS atspindi išorinį kraujo krešėjimo kelią [37]. Ankstyviausi TNS pokyčiai po pirmos suvartotos varfarino dozės stebimi praėjus tik 24-36 val. Praėjus tiek laiko dar nesusiformuoja reikšminga antikoaguliacinė vaisto funkcija, kadangi varfarinas stipriausiai slopina VII, o silpniau - kitus krešėjimo faktorius: II, IX, X ir proteinus C ir S. Faktorių sintezės slopinimas pasireiškia ne vienu metu, maksimalus antikoaguliacinos poveikis stebimas tik po 4-7 dienų [38].

9.5 Farmakokinetika, nulemta gretutinių veiksnių

Antikoaguliaciniam poveikiui ir varfarino dozėms įtakos turi daugelis veiksnių. Pacientams su viršsvoriu turi būti skiriamos didesnės varfarino dozės negu pacientams su normaliu kūno masės indeksu (KMI), norint pasiekti tą patį efektą dėl didesnės kūno masės [27]. Rūkymas gali potencialiai sukelti reakciją su varfarinu, didindamas inkstų klirensą, o tai sąlygoja sumažėjusį varfarino kiekį organizme [28]. Taipogi lytis turi reikšmę – moterims reikalingos mažesnės varfarino dozės negu vyrams, norint pasiekti tokį pat efektą. Pacientų klinikinė būklė taip pat turi įtakos varfarino dozavimui bei efektyvumui. Pacientai, turintys padidėjusią kreatinino koncentraciją, vartoja mažesnes varfarino dozes, kadangi varfarino metabolitai pasišalina su šlapimu. O tie, kurių sumažėjęs tirotropinio hormono (TSH) kiekis, turi naudoti didesnes varfarino dozes negu tie, kurių TSH kiekis yra normalus arba didesnis, norint pasiekti tą patį antikoaguliacinį poveikį. Skydliaukės aktyvumas ir ekskrecija priklauso nuo TSH koncentracijos kraujo plazmoje. Tiroksinas randamas kraujyje susijungęs su baltymu ir jis konkuruoja dėl prisijungimo prie baltymo su varfarinu. Pastebėta - pacientai su aukštesne laisvo tiroksino koncentracija kraujyje, naudoja mažesnes varfarino dozes, kadangi laisvas tiroksinas prisijungia prie baltymo, tuomet varfarinas tampa laisvu ir jos slopinamas krešėjimo efektas sustiprėja [2, 41].

13 : daržovės, turinčios daug vitamino K, – kopūstai, špinatai, avokadas ir kt; augalai, tokie kaip jonažolė, kuri slopina varfarino efektą, ar ginkmedis, šalavijas, ženčenis, kurie stiprina varfarino veikimą [36]. Nutraukus varfariną, veikimas išlieka 4 – 7 dienas (priklausomai nuo pasiektos hipokoaguliacijos) [25].

9.6 Farmakodinamika ir VKORC1 genotipas

Varfarino farmakodinamikoje vienas iš svarbiausių fermentų yra VKORC, kuris yra slopinamas ir šio proceso rezultatas – sumažėjusi aktyvių faktorių sintezė (II, VII, IX, X ir proteinų C ir S) [24-25]. Šis fermentas randamas endoplazminio tinklo membranose, sudarytas iš 163 amino rūgščių. Jo transmembraninė struktūra yra iki galo neišaiškinta. Vienų tyrėjų manoma, kad fermentas sudarytas iš trijų transmembraninių sričių [46-47], tačiau kitas modelis aiškina, kad iš keturių transmembraninių sričių [48-49]. Pirmuoju atveju, jei fermentas yra sudarytas iš trijų domenų, tai baltymo N – galas yra endoplazminiame tinkle, o C galas citozolyje [ 46-47]. Antruoju atveju - N ir C galas yra citozolyje ir taip paaiškinimas 4 transmembraninių sričių modelis [48-49].

Vieni iš svarbiausių varfarino farmakodinamikos parametrų yra maksimalus vaisto slopinimo faktorius (Imax), kuris yra susijęs su kepenų VKORC fermento kiekiu, ir vaisto afinitetas (IC50) [39]. IC50 yra pastovus dydis, o didinant Imax didinamas vaisto jautrumas. Buvo identifikuota, kad VKORC1 genotipas turi statistiškai reikšmingos įtakos prognozuojant Imax, kuris proporcingas TNS. Pacientai, turintys šį VKORC1 polimorfizmą – G-1639A ( rs9923231), pasižymi mažiau aktyvia kepenų veikla, todėl jiems reikia mažesnių S-varfarino koncentracijų kraujo plazmoje, ir, tuo pačiu, mažesnių varfarino dozių, norint pasiekti optimalų antikoaguliacinį poveikį [40]. VKORC1 genotipas gali turėti įtakos pasirenkant varfarino dozę ir tai reguliuojama transkripcijos lygyje [44].

VKORC1 sąveikauja su tam tikrais baltymais, kurie turi skirtingą efektą krešėjimo sistemai, pvz.: CYP4F2 mutacijos gali reikalauti didesnių varfarino dozių, krešėjimo sistemos baltymų C ir S mutacija gali gerinti koaguliaciją ir kt. [43].

9.7 Farmakogenomika

14 ir eliminaciją, o laukinio tipo alelis CYP2C9*1 yra susijęs su normaliu fermento aktyvumu [2]. Pacientams su CYP2C9*2 ar *3 aleliais reikalinga mažesnė varfarino dozė norint pasiekti tokį patį antikoaguliacinį poveikį lyginant su pacientais, turinčiais CYP2C9*1 alelį [3]. Žinoma, kad šis genas tik dalinai lemia jautrumą varfarinui.

VKORC1 yra vienas iš svarbiausių genų, lemiančių jautrumą varfarinui [1]. Du pseudogenai gali būti identifikuojami 1 chromosomoje ir X chromosomoje [45]. Varfarinas blokuoja VKORC1 fermentą ir stabdo vitamino K redukciją, todėl nebevyksta aktyvių kraujo krešėjimo faktorių gamyba [2]. Baltaodžių kliniškai reikšmingi yra šie VKORC1 tipai – G1639A (rs9923231), C1173T (rs9934438) ir G3730A (rs7294). G1639A yra susijęs su padidėjusiu jautrumu varfarinui ir todėl tokį genotipą turintiems ligoniams yra reikalingos mažesnės varfarino dozės [4]. A alelio nešiotojai reikalauja mažesnių pradinių varfarino dozių, nei G alelio nešiotojai. Šis poveikis adityvus, t.y. - homozigotai, turintys A/A genotipą - gydomi mažiausiomis dozėmis, heterozigotai - vidutinėmis, o homozigotai G/G - didžiausiomis varfarino dozėmis [5,6]. C1173T yra dažniausiai randamas haplotipe su G3673A. C1173T yra vieno nukleotido polimorfizmas pirmame VKORC1 introne. Jis yra susijęs su mažesnėmis varfarino dozėmis. T alelio nešiotojai reikalauja mažesnių varfarino dozių negu C alelio, heterozigotai – vidutinių [6]. Trečiasis, G3730A - yra vieno nukleotido polimorfizmas VKORC1 3 UTR zonoje. Polimorfizmas yra susijęs su didesnėmis varfarino dozėmis. A alelio nešiotojai reikalauja didesnių varfarino dozių negu G alelio. Polimorfizmas nesudaro haplotipų kaip prieš tai minėti VKORC1 genotipai. [6]. Apibendrinant, ligoniams, turintiems mutavusį VKORC1 - G1639A (rs9923231) ir C1173T (rs9934438) skiriamos mažesnės varfarino dozės, o G3730A (rs7294) – didesnės varfarino dozės.

CYP4F2 yra dar vienas svarbus citochromo P450 fermentų šeimos narys. CYP4F2 reguliuoja vitamino K ir E biologinį prieinamumą, ilgųjų riebių rūgščių metabolizmą. Jis hidroksilina ir inaktyvuoja redukuotą vitamino K formą, todėl sumažėja šio vitamino gebėjimas aktyvuoti krešėjimo faktorius [7, 30, 32]. Šio polimorfizmo - CYP4F2 G1374A (V433M, rs2108622) nešiotojai pasižymi sumažėjusiu fermento aktyvumu metabolizuoti vitaminą K, todėl stebimas padidėjęs vitamino K kiekis [31, 33]. CYP4F2 A1347A genotipo nešiotojai turi naudoti didesnes varfarino dozes nei pacientai, kurių genotipas G/G ar G/A [2]. Šis polimorfizmas gali paaiškinti 2-5 proc. varfarino dozės pokyčių. Liang ir kitų studijos parodė, kad kinų populiacijoe šio geno polimorfizmas paaiškina 3,9 proc. varfarino dozės pokyčių [34]. Pastebėta, kad 30 proc. baltaodžių gyventojų ir 17 proc. Azijos populiacijos yra A (rs2108622) alelio nešiotojai [33].

15 CYP4F2 dalyvauja ne tik aprašytuose procesuose, bet ir uždegime. Uždegimas – sudėtinga organzimo reakcija į žalingo agento veikimą, dėl kurio pasireiškia audinių ir kraujagyslių funkciniai bei struktūriniai pakitimai. Kiekvienos operacijos metu sukeliamas uždegimas. Uždegimą sudaro ilgos kaskados. Šiuo atveju svarbiausi elementai: arachidono rūgštis (ARA), kuri verčiama į 20-hidroksieikozatetraenoinę rūgštį (20–HETE), leukotrienai (pvz.: LTB4). Iš ARA gaunami mediatoriai dalyvaujant įvairiems fermentams. Minėti fermentai - ciklooksigenazė ir lipooksigenazė. Ciklooksigenazė dalyvauja verčiant ARA į prostaciklinus, tromboksaną. Lipooksigenazės fermentai yra svarbūs leukotrienų sintezėje, kuriuos dažniausiai išskiria leukocitai ir pastariesiems padeda judėti į uždegimo vietą. 5–lipooksigenazė verčia ARA į 5-hidroksiperoksieikosatetraenoinę rūgštį (5– HPETE), kuri vėliau virsta į 5 - hidroksieikozatetraenoinę rūgštį (5- HETE). 5–HPETE turi chemotaksinį poveikį leukocitams ir yra leukotrienų pirmtakas. Pateikiama detali iliustracija (2 pav.).

2 pav. Arachidono rūgšties metabolizmas [63]

Citochromo P450 fermentai dalyvauja arachidono rūgšties metabolizme, verčiant ją į epoksieikosano rūgštį: CYP2C ir CYP2J pošeimio fermentai, o CYP4A, 4F ir 1A fermentai arachidono rūgštį verčia į 20–HETE. CYP4F2 yra pagrindinė arachidono rūgšties ω- hidroksilazė žmogaus kepenyse, inkstuose ir šią rūgštį padeda paversti į 20–HETE, kuri labai svarbi fiziologiškai. [7]

16 Keletas 20–HETE funkcijų: trombocitų agregacijos slopinimas (blokuoja trombocituose esančius tromboksano A2 (TxA2) receptorius), kraujagyslių tonuso reguliavimas smegenyse, inkstuose, širdyje, taip pat buvo išsiaiškinta, kad dalyvuoja vitamino K metabolizme [8]. G1347A polimorfizmas CYP4F2 gene buvo rastas kaip reikšmingas, vykstant arachidono rūgšties virtimui į 20-HETE [2]. Padidėjus 20–HETE kiekiui, yra sukeliamas oksidacinis stresas, stimuliuojami uždegiminiai citokinai ir kt. medžiagos, stebimas trombocitų agregacijos slopinimas, o mažėjant 20– HETE, reakcijos vyksta priešingai. CYP4F2 A alelis yra susijęs su sumažėjusiu fermento metaboliniu aktyvumu. CYP4F2 A1347A genotipo nešiotojai, dėl labiau išreikšto uždegimo, turi naudoti didesnes varfarino dozes įsotinimo metu negu pacientai, kurių genotipas G/G ar G/A [2].

10. Laboratorinių genetinio ištyrimo metodų apžvalga

Dezoksiribonukleorūgštis (DNR) – medžiaga, pernešanti informaciją apie paveldimąsias savybes. DNR sudaro nukleotidai, susijungę į ilgas grandines. Kiekvienas nukleotidas sudarytas iš azoto turinčios bazės, monosacharido dezoksiribozės (pentozės) ir fosfato. Azoto turinčios bazės yra keturių rūšių: dvi iš jų pirimidinai – citozinas (C) ir timinas (T), kitos dvi – purinai – adeninas (A) ir guaninas (G). DNR turi tiek pat purino bazių, kiek ir pirimidino bazių. Kadangi DNR koduoja paveldimąją informaciją, tai nukleotidai joje turi būti išsidėstę tam tikra tvarka. DNR sudaryta iš dviejų vijų, kurios sujungtos vandeniliniais ryšiais, vijų šonuose – fosfatas ir dezoksiribozė, o centre – bazių poros - citozinas jungiasi fosfodiesterine jungtimi su guaninu, adeninas su timinu. Šios bazių poros yra komplementarios. Polinukleotidinės grandinės turi kryptį – gretimi nukleotidai jungiasi tarp nukleotido deoksiribozės C atomo 5’ padėtyje ir kito nukleotido deoksiribozės C atomo 3’ padėtyje. [9].

17 Genas yra DNR molekulės dalis, kuri koduoja informaciją apie aminorūgščių seką. Genas sudarytas iš egzonų (DNR sekos, koduojančios baltymų seką) ir intronų (nekoduojanti DNR seka). Taip pat geno veiklai svarbus promotorius – DNR seka, be kurios negalėtų vykti informacijos nurašymas į riboksinukleorūgštį (RNR), dar reikšmingi – gretimieji reguliuojantys elementai, išsidėstę greta promotoriaus, ir tolimieji reguliuojantys elementai, esantys toliau ir galintys paspartinti informacijos nurašymą (stiprintuvai) arba trukdyti šiam procesui – slopintojai [10].

Polimorfizmas apibūdina įvairių organizmų tam tikrų formų variacijas ir padeda atskirti vienas organizmų rūšis nuo kitų. Genetikai naudoja sąvoką genetinis polimorfizmas, kuris apibūdina savitą DNR seką. Ši seka kiekvieno žmogaus genomą padaro unikaliu [12].

10.2 DNR išskyrimas

DNR ekstrakcijos metu DNR išskiriama iš įvairių matricų, pvz.: kraujo, ląstelių, seilių, šlapimo, blužnies, naudojant fizikinius ir cheminius metodus. Tik atskyrus DNR nuo tam tikrų medžiagų, galima nustatyti jos seką. DNR ekstrakcija vykdoma tokiu būdu:

1. Ląstelių suardymas, išskiriant DNR esančią viduje.

2. Šalinamas ląstelės lipidų dvisluoksnis, naudojant detergentus ar surfaktantus. 3. Baltymų ardymas.

4. Atliekamas RNR šalinamas. 5. Tirpios DNR išgavimas.

Tirpios DNR išgavimo metodai :

– Išsodinimas etanoliu. Atliekant naudojamas ledinis etanolis arba izopropanolis. DNR netirpsta šiuose alkoholiuose, todėl agreguoja ir iškrenta siūlų forma [14,15].

– Naudojant fenolį ir chloroformą.

– Minikolonėlių/magnetinių dalelių gryninimo metodas. Šis būdas remiasi, kad nukleino rūgštis gali adsorbuoti prie kietosios medžiagos (silicio dioksido ar kitos). Jei sąlygos optimalios, nukleorūgštis jungiasi prie silicio dioksido, o kitos medžiagos lieka tirpale ir tai vyksta kolonėlėje [16-18].

10.3 DNR kokybės ir koncentracijos nustatymas

18 Spektrofotometrinis metodas. DNR kiekis nustatomas matuojant optinį tankį 260 nm ilgio bangos šviesoje. Kokybinė DNR analizė atliekama išmatavus optinį tankį 280 nm ilgio bangos šviesoje. Santykis A260/A280 parodo DNR švarumą. DNR yra švari, kai šis dydis yra didesnis nei 1,5. Geriausia, jei šis santykis yra 1,7-1,9. Mažesnis santykis rodo, kad DNR mėginyje yra baltymų arba organinių medžiagų, didesnis – esama RNR.

Elektroforezė agarozės gelyje. Paruošiami išgrynintos DNR mėginiai (DNR, dažas ir elektroforezės buferinis tirpalas). Į paruoštą gelį suleidžiama visų standartų tirpalų (nuo 250 ng iki 6 ng), išgrynintos DNR ruošinių ir DNR ilgio standarto. Elektroforezė vykdoma 1 valandą esant 100 V įtampai. DNR molekulės turi neigiamą krūvį, todėl jos juda link teigiamai įkrauto elektrodo. Praėjus elektroforezei skirtam laikui, gelis dažomas 1% etidžio bromido tirpalu 15 min. ir DNR fragmentai analizuojami ultravioletinėje šviesoje (365 nm bangos ilgis). Išgrynintos DNR mėginiai lyginami su žinomos genominės DNR standartais [22, 23].

10.4 Genotipo tyrimas polimerazės grandininės reakcijos metodu

Po DNR ekstrakcijos gali būti atliekamas genotipavimas. Tai atliekama naudojant polimerazės grandininės reakcijos (PGR) tyrimą [19]. PGR – tai DNR sekos nukopijavimas ar padidinimas nuo tūkstančio iki kelių milijonų kopijų. DNR sekos didinimui naudojama termiškai stabili DNR polimerazė. Šiame procese svarbu cikliškumas. DNR amplifikacija vyksta eksponentiškai gausinant molekulės taikinį kiekvieno ciklo metu. Amplifikacijos ciklo procesą sudaro 3 stadijos:

1. Denatūracija. Terminė DNR mėginio denatūracija pakeliant temperatūrą iki 95οC.

2. Renatūracija. Temperatūra pažeminama iki 50 - 60 οC. Pradmuo pagal komplementariškumo principą prisijungia prie DNR.

3. Sintezė. Temperatūra pakeliama iki optimalios termostabiliai DNR polimerazei veikimo temperatūros (72 ο_{C) [20].}

DNR sintezė yra inicijuojama kiekvieno pradmens 3´-OH gale [20].

19

11. Eksperimentinė dalis

11.1 Tyrimo metodika

Tyrimo objektas

Į tyrimą buvo kviečiami pacientai po širdies vožtuvų operacijos, kuriems buvo skiriamas varfarinas. Pacientai buvo aiškiai, išsamiai ir suprantamai supažindinti su atliekamu tyrimu naudojant asmens informavimo formas ir į tyrimą įtraukiami tik pasirašę informuotojo asmens sutikimo formą. Tiriamieji privalėjo turėti socialinį sveikatos draudimą, reikalaujamą pagal sveikatos priežiūros įstaigų įstatymą.

Tiriamųjų atranka

Pacientų demografiniai (lytis, amžius, svoris, ūgis) ir klinikiniai duomenys gauti iš ligos istorijų. Ligoniai buvo tiriami 2 kartus: 1-ą kartą - varfarino dozės įsotinimo metu, po operacijos ir praėjus ne mažiau, nei 3 mėnesiams nuo gydymo varfarinu pradžios.

Pradiniame etape buvo 175 pacientai, iš kurių 107 buvo vyrai (61,14 proc.) ir 68 moterys (38,86 proc.) po širdies vožtuvų operacijų. Antro tyrimo metu atvyko 113 pacientų, iš kurių 47 buvo moterys (41,6 proc.) ir 66 vyrai (58,4 proc.). Ligonių demografiniai ir antropometriniai duomenys pateikti 1 lentelėje.

1 lentelė. Demografiniai ir antropometriniai duomenys pacientų, kurie tiriami varfarino įsotinimo metu ir praėjus 3 mėn. nuo pirmos vartotos varfarino dozės

Įsotinimo metu Ilgalaikio gydymo metu

Rodiklis N (proc.) Vidurkis±SN N (proc.) Vidurkis±SN

Amžius 175 65,82±11,73 113 64,45±11,71

Ūgis 175 175±9,84 113 170,12±9,82

Svoris 175 81,74±14,81 113 81,67±14,93

20 11.2 Tyrimo metodai

Ligos istorijų, duomenų rinkimas

Iš ligos istorijų buvo renkama ši informacija - antropometriniai, klinikiniai duomenys (biocheminiai rodikliai, naudojami vaistai, turimi žalingi įpročiai) ir pacientų TNS rezultatai

Po 3 mėnesių, papildomai vertinti šie rodikliai: tirotropinis hormonas (TSH), laisvas tiroksinas, kreatininas, aspartataminotransferazė (AST), alaninaminotransferazė (ALT), AST/ALT santykis, šarminė fosfatazė (ŠF). Taip pat, tirta šių ligų įtaka varfarino dozėms įsotinimo metu: cukrinio diabeto, krūtinės anginos, širdies nepakankamumo, prieširdžių virpėjimo, arterinės hipertenzijos. Vaistų įtaka (diuretikų, amiodarono, statinų, Ca kanalų blokatorių, beta- adreno receptorių blokatorių, angiotenzino II receptorių blokatorių, aspirino, AKF inhibitorių, L- tiroksino, benzadiazepinų) varfarino dozeis buvo tirta tiek įsotinimo, tiek stabilios dozės metu. 2-oje lentelėje pateikta, kokie parametrai, kada tikrtinti.

2 lentelė. Varfarino įsotinimo ir ilgalaikio vartojimo metu rinkti duomenys.

Įsotinimo metu Ilgalaikio gydymo metu TTH ir laisvas tiroksinas -* +** Kreatininas - +

AST, ALT, AST/ALT, ŠF - +

Gretutinės ligos (cukrinis diaberas, krūtinės angina, prieširdžių virpėjimas,arterinė hipertenzija,širdies nepakankamumas)

- +

Naudoti vaistai (diuretikai, amiodaronas, statinai, Ca kanalų blokatoriai, beta- adreno receptorių blokatoriai, angiotenzino II receptorių blokatoriai, aspirinas, AKF inhibitoriai, L- tiroksinas, benzadiazepinai)

+ +

Žalingi įpročiai (rūkymas, alkoholio vartojimas) - +

*- netirta/netikrinta, **- tirta/ tikrinta

Kraujo mėginių paėmimas tyrimams ir genetinis ištyrimas

21 operacijos (prieš operaciją pasirašytas ligonio sutikimas tyrimams), o antro tyrimo metu - papildomai išsikvietus po 3 mėnesių nuo pirmos varfarino dozės.

Genominės DNR išskyrimas ir genų polimorfizmo tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje. Visiems į tyrimą įtrauktiems pacientams buvo atliktas CYP2C9 *2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910), VKORC1 *2 (rs9934438), VKORC1 *3 (rs7294) bei CYP4F2 (G1347A) genotipavimas.

Genominės DNR išskyrimas

Genominė DNR iš periferinio kraujo leukocitų buvo išskirta naudojant UAB „Fermentas“ rinkinį „Genomic DNA Purification Kit“ (Thermo Fisher Scientific, Lietuva) su kolonėlėmis pagal gamintojo nurodytą darbo protokolą.

Genotipavimas tikro laiko polimerazės grandininės reakcijos metodu

Genotipavimas tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos (PGR) metodu atliktas remiantis standartinėmis gamintojo nurodytomis sąlygomis ir rekomendacijomis Taqman molekuliniams žymenims. Tyrimas atliktas Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Kardiologijos instituto Molekulinės kardiologijos laboratorijoje naudojant tikro laiko PGR termociklerį ABI 7900HT Fast Real–Time PCR (ABI, JAV) bei komercinius Taqman molekulinius žymenis (LifeTechnologies, JAV), skirtus (CYP2C9 *2 (rs1799853) ir *3 (rs1057910), VKORC1 *2 ( rs9934438), VKORC1 *3 (rs7294) bei CYP4F2 (G1347A) ) polimorfizmui tirti.

Tikro laiko PGR atlikta standartinėmis gamintojo rekomenduojamonis sąlygomis (laikantis temperatūros režimo bei sudėtinių reakcijos komponentų koncentracijų, pagal gamintojo pateiktą protokolą). Naudotas universalus Taqman 2x (LifeTechnologies, JAV arba Thermo Fisher Scientific, Lietuva) mišinys. Tiriamosios DNR buvo imama 10 ng pagal gamintojo rekomendacijas. Kiekvieną kartą atliekant reakcijas, siekiant išvengti klaidų, buvo dedami sekoskaitos būdu nustatytų genotipų standartai.

Standartinės reakcijos sąlygos tikro laiko PGR genotipavimo reakcijai paruošti: – TAQMAN žymenų – 1,25 µl (20x) ( Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė),

– Taqman 2x universalau reakcijos mišinio – 12,5 µl ( Applied Biosystems, Jungtinė Karalystė arba Thermo Fiaher Scientific, Lietuva)

22 Temperatūros/laiko režimas:

95 °C – 10 minučių, 95 °C – 15 sekundžių, 60 °C – 90 sekundžių.

Ciklas nuo antrojo etapo kartotas 40 kartų (du paskutinius kartus : 95 °C ir 60 °C).

Metodo validavimas sekoskaitos metodu

Standartams nustatyti naudota Sanger`io sekoskaita. Genotipavimas atliktas ABI 3500 sekoskaitos įrenginiu. Genominei DNR ištirti naudoti du nežymėti pradmenys: pirmaujanti seka ir atsiliekanti seka. PGR atlikimo sąlygos :

95 °C - 10 minučių 95 °C – 15 sekundžių, 60 °C – 45 sekundės, 72 °C – 10 minučių.

2 ir 3 etapas kartotas 35 ciklus.

Pirminio produkto PGR valymas buvo atliekamas naudojant „Invitrogen Pure Link PCR Purification Kit“, laikantis gamintojo nurodytų sąlygų. Į mišinį, sudarytą iš 50 µl PGR produkto, pridedama 200 µl buferinio tirpalo B2 (ang. binding), kurio sudėtyje yra izopropanolio. Gerai išmaišius supilama į kolonėlę ir centrifuguojama 10000 x g 1 minutę. Kolonėlė plaunama 650 µl buferiniu tirpalu (W1). Kolonėlė nusausinama centrifuguojant 10 000 x g 1 minutę. Išgrynintas PGR produktas buvo tirpinamas minutę 50 µl eliuavimo (angl. elution) buferiniame tirpale. Kolonėlė centrifuguojama 10 000 x g 2 minutes.

PGR reakcijai iki sekoskaitos buvo ruošiamas mišinys : PGR grynumo vanduo (4 µl), 5 x buferinis (2 µl) tirpalas, pradmuo (1 µl) ir BigDye Terminator polimerazė (1 µl) ( LifeTechnologies, JAV). Į mišinį įdėta 1 µl pirminio PGR produkto.

PGR sąlygos : 96 °C – 2 minutės, 96 °C – 30 sekundžių, 50 °C – 15 sekundžių 60 °C – 4 minutės.

2 ir 3 etapas kartotas 35 ciklus.

23 Bigdye Xterminator tirpalo (10 µl). Gautas mišinys specialia maišykle maišytas 30 minučių. Šio etapo pabaigoje reakcijos mišinys buvo centriguojamas 2 minutes, esant 1000 g.

Sekoskaita atlikta naudojant ABI 3500 Genetic Analyser instrumentą, atsižvelgiant į gamintojo rekomendacijas. Rezultatų apdorojimas atlitkas naudojant „Sequence scanner version 1.0“ programinę įrangą.

11.3 Statistinė duomenų analizė

24

12. Rezultatai

Tirtiems pacientams buvo implantuojami tiek mechaniniai, tiek biologiniai vožtuvai, priklausomai nuo ligonio amžiaus. Implantuojant mechaninį vožtuvą, buvo skiriamos didesnės varfarino dozės tiek įsotinimo - 6,29 mg, tiek ir ilgalaikio gydymo metu – 5,94 mg, palyginus su tais ligoniais, kuriems buvo implantuojamas biologinis vožtuvas - 4,79 mg ir 4,35 mg (atitinkamai). Klinikinių veiksnių įtaka varfarino dozei

Ligoniams, kurie ilgalaikio gydymo metu turėjo padidėjusį kreatininą, ŠF, reikėjo mažesnių varfarino dozių (p<0,05). Nors daugelyje tyrimų [2,41] randamas statistiškai reikšmingas ryšys tarp TTH, laisvo tiroksino bei varfarino dozių. Mūsų tyrime nebuvo pastebėta, kad esant sumažėjusiam TTH kiekiui būtų naudojamos didesnės varfarino dozės ar pacientai su aukštesne laisvo tiroksino koncentracija kraujyje, naudotų mažesnes varfarino dozes. Taip pat buvo tirtas ryšys tarp varfarino dozių ir šių ligų – krūtinės anginos, prieširdžių virpėjimo, arterinės hipertenzijos bei cukrinio diabeto, bet statistiškai reikšmingo ryšio nerasta (p>0,05). 3 lentelėje pateikti klinikinių faktorių įtaka varfarino dozėms vartojant pastoviai

3 lentelė. Klinikinių faktorių įtaka varfarino dozei ilgalaikio gydymo metu.

Kintamieji Stabili dozė

25 Laisvo tiroksino kiekis

27 *p=0,006, ** p=0,04

Vaistų įtaka varfarino dozei

Varfarino įsotinimo metu tik amiodaronas statistiškai reikšmingai mažino varfarino dozes (p=0,0006). O pastovaus vartojimo metu statistiškai reikšmingai mažesnių varfarino dozių reikėjo diuretikus (torazemidą) (p=0,04) , Ca kanalų blokatorius (p=0,04) ir benzodiazepinus (p=0,05) vartojusiems ligoniams (4 lentelė). Tarp kitų medikamentų ir varfarino dozių nerastas statistiškai reikšmingas ryšys.

4 lentelė. Vartojamų medikamentų įtaka varfarino dozavimui.

29 Nevartojo 165 5,65 ± 2,72 110 4,98 ± 2,30 Iš viso: 175 5,29 ± 2,78 113 6,16 ± 2,76 AKF inhibitoriai Vartojo 105 5,41 ± 2,64 70 5,20 ± 2,21 Nevartojo 70 5,90 ± 2,86 43 4,79 ± 2,53 Iš viso: 175 5,66 ± 2,75 113 5,00 ± 2,37 Angiotenzino II receptorių blokatoriai Vartojo 11 5,34 ± 3,68 16 5,26 ± 1,91 Nevartojo 164 5,62 ± 2,67 97 5,01 ± 2,40 Iš viso: 175 5,48 ± 3,18 113 5,14 ± 2,17 L- Tiroksinas Vartojo 13 5,77 ± 2,80 5 4,37 ± 2,02 Nevartojo 162 5,60 ± 2,74 108 5,07 ± 2,35 Iš viso: 175 5,69 ± 2,77 113 4,72 ± 2,19 Benzodiazepinai Vartojo 104 5,58 ± 3,03 10 3,71 ± 1,37** Nevartojo 71 5,65 ± 2,24 103 5,17 ± 2,37** Iš viso: 175 5,62 ± 2,64 113 4,44 ± 1,87 *p=0,0006, ** p=0,04 – 0,05,

Gretutinių veiksnių įtaka varfarino dozei

30

5 lentelė. Žalingų įpročių įtaka varfarino dozavimui ilgalaikio gydymo metu

N (proc.) Varfarino dozė ± SD

Rūkymas Rūko 10 6,49 ± 1,96* Nerūko 103 4,90 ± 2,33* Iš viso: 113 5,70 ± 2,15 Alkoholis Vartoja 78 5,55 ± 2,45** Nevartoja 35 3,91 ± 1,56** Iš viso: 113 4,73 ± 2,01 *p=0,04, **p=0,0004.

Genotipo įtaka varfarino dozėms

Tik varfarino įsotinimo metu pastebėtas statistiškai reikšmingas ryšys - ligoniai, turintys CYP4F2 G1374A laukinį genotipą (G/G), naudojo mažesnes vaisto dozes (5,41 ± 2,50 mg per dieną) negu AA genotipą turintys ligoniai (7,82 ± 4,06 mg per dieną) (p = 0,02).

Įsotinimo metu didesnes dozes naudojo CYP2C9 laukinio tipo *1*1 turėtojai - 5,68 ± 2,78 mg per dieną, o ilgalaikio gydymo metu didžiausias dozes vartojo CYP2C9 heterozigotai *1*2 (5,44 ± 3,58 mg per dieną). Mažiausių dozių reikėjo *2*2 turėtojams. Bet šie duomenys nebuvo statiškai reikšmingi (p > 0,05)

CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo mažesnes varfarino dozes tiek įsotinimo metu (4,53 ± 2,08 mg per dieną), tiek vartojant varfariną nuolatos (3,77 ± 1,88 mg per dieną) negu laukinio tipo homozigotai (atitinkamai 5,83 ± 2,80 mg ir 5,33 ± 2,34 mg per dieną) (p<0,05).

Tiek įsotinimo metu, tiek pastovaus gydymo metu VKORC1 *2 C1173T laukiniam tipui (C/C) būdinga didesnė varfarino dozė (atitinkamai - 6,47 ± 2,67 mg ir 6,02 ± 2,66 mg per dieną) lyginant su heterozigotais (C/T) (5,63 ± 2,61 mg ir 4,96 ± 1,84 mg per dieną) bei (T/T) homozigotais (3,13 ± 1,55 mg ir 3,20 ± 1,49 mg per dieną) (p<0,05).

31

6 lentelė. Genotipų įtaka varfarino dozavimui įsotinimo metu.

33

13. Rezultatų aptarimas

Stabilus varfarino dozavimas turi būti parenkamas individualiai kiekvienam pacientui. Varfarino dozė turi būti koreguojama atsižvelgiant į mitybą, žalingus įpročius, antropometrinius ir klinikinius parametrus, naudojamus medikamentus bei turimą genotipą [54]. Šiuo tyrimu parodėme, kad reikšmingą įtaką varfarino dozavimui turi – žalingi įpročiai (rūkymas ir alkoholio vartojimas), biocheminiai rodikliai (kreatininas, ŠF), medikamentai (kilpinis diuretikas (torazemidas), kalcio kanalų blokatoriai, benzodiazepinai ir amiodaronas), genotipas (CYP4F2, CYP2C9*3-2, VKORC1 *2, VKORC1 *3). Vieni faktoriai varfarino įsotinimo metu, kiti pastovaus vartojimo metu arba abiem atvejais darė įtaką varfarino dozavimui.

Ne viename straipsnyje [2,41] teigta - pacientai su padidėjusiu kreatinino kiekiu naudoja mažesnes varfarino dozes, kadangi yra sutrikęs varfarino pasišalinimas iš organizmo. Tai rodo ir mūsų rezultatai, varfarino dozė esant padidintam kreatinino kiekiui buvo 1,5 mg mažesnė, nei esant normaliam kreatinino kiekiui, varfariną vartojant ilgiau nei 3 mėnesius. Ilgalaikio gydymo metu vaisto dozei taipogi įtakos turėjo kepenų fermentas ŠF. Esant padidėjusiam ŠF aktyvumui, varfarino dozė buvo 2,2 mg žemesnė, nei esant normaliam ŠF aktyvumui. ŠF padidėjimo viena iš priežasčių yra sutrikęs tulžies nutekėjimas, o dalis varfarino pasišalina su tulžimi [25]. Galima daryti prielaidą, kad ši priežastis sutrikdo dalies varfarino pasišalinimą, todėl reikalingos mažesnės varfarino dozės nei esant nepadidėjusiai ŠF ir nesutrikusiai tulžies apykaitai.

34 CYP2C9 dalyvauja varfarino metabolizme ir yra svarbus parenkant varfarino dozę pacientams [1]. CYP2C9*2 (rs1799853, 430C>T) ir *3 (rs1057910, 1075A>C) aleliai lėtina varfarino metabolizmą ir eliminaciją, o laukinio tipo alelis CYP2C9*1 yra susijęs su normaliu fermento aktyvumu [2]. Pacientams su CYP2C9*2 ar *3 aleliais reikalinga mažesnė varfarino dozė norint pasiekti tokį patį antikoaguliacinį poveikį lyginant su pacientais turinčiais CYP2C9*1 alelį [3]. Varfarino įsotinimo metu CYP2C9*1*2 turėjo 24, CYP2C9*2*2 - 4 pacientai. CYP2C9*1*3 heterozigotinį variantą turėjo – 30 ligonių. Mūsų tyrime statistiškai reikšmingas ryšys pastebėtas tik tarp CYP2C9*1*3 ir varfarino dozių. Įsotinimo metu CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo 1,3 mg mažesnes varfarino dozes nei laukinio tipo homozigotai, ilgalaikio gydumo metu heterozigotai naudojo 1,6 mg mažesnes varfarino dozes.

VKORC1 yra vienas iš svarbiausių genų, lemiančių varfarino jautrumą, nes jis daro įtaką VKORC1 fermento aktyvumui ir vitamino K redukcijai [1,2]. Yra nustatyti keli kliniškai reikšmingi VKORC1 geno variantai, kurie gali daryti įtaką varfarino dozei baltaodžiams: VKORC1 *2 C1173T bei VKORC1 *3 G3730A. Mūsų tyrime varfarino įsotinimo metu VKORC1 *2 C1173T genotipo nešiotojai pasiskirstė taip: laukinį tipą (C/C) turėjo 73 (41,7 proc.), heterozigotinį (C/T) – 76 (43,4 proc.), mutavusį (T/T) - 26 pacientai (14,9 proc.). Pastebėtas statistiškai reikšmingas ryšys tarp varfarino dozių ir šio genotipo - tiek įsotinimo metu, tiek pastovaus gydymo metu. VKORC1 *2 laukinį genotipą turintiems buvo nustatytos didesnės paros varfarino dozės maždaug 0,5 mg, palyginus su C/T heterozigotais. Turintiems homozigotinį T/T variantą reikėjo net perpus mažesnių varfarino dozių, nei C/C laukinį genotipą turintiems. Šie duomenys sutampa su analizuota literatūra - VKORC1 *2 C1173T genotipo C alelio nešiotojai reikalauja didesnių varfarino dozių negu T alelio, heterozigotai – vidutinių [6]. VKORC1 *3 G3730A genotipo nešiotojai varfarino įsotinimo grupėje pasiskirstė taip: laukinį tipą turėjo – 76 (42,4proc.), heterozigotinį – 58 (33,2proc.), mutavusį – 41 pacientas (23,4proc.). Ir čia pastebėta, kad tiek įsotinimo metu, tiek naudojant pastoviai VKORC1 *3 G3730A laukinio tipo nešiotojai (G/G) vartojo iki 1,5 mg mažesnes varfarino dozes, nei A/A turintys ligoniai. Be to, vartojant varfariną nuolatos, heterozigotai vartojo 1,1mg mažesnes dozes negu turintys mutavusį genotipą. Kaip ir teigiama Ryan P. ir bendraautorių straipsnyje [6] - VKORC1 *3 G3730A alelis nesudaro haplotipo su VKORC1 C1173T aleliu. A alelio nešiotojai reikalauja didesnių varfarino dozių negu G alelio - laukinį tipą turintys pacientai.

35 pacientai (4,0 proc.). Iš rezultatų matome, kad G alelio nešiotojai naudoja mažesnes varfarino dozes nei A alelį turintys: tiek įsotinimo (G/G - 5,41 ± 2,50 mg, G/A - 5,68 ± 2,86 mg, A/A - 7,82 ± 4,06 mg per dieną) , tiek pastovaus varfarino vartojimo metu (G/G - 4,82 ± 2,22 mg, G/A - 5,25 ± 2,41mg, A/A - 6,18 ± 3,15 mg per dieną). Bet statistiškai reikšmingas ryšys pastebėtas tik varfarino įsotinimo metu - laukinio tipo nešiotojai naudojo 2,5 mg mažesnes varfarino dozes negu mutavusį genotipą turintys. Kaip ir šiame straipsnyje - Tatarunas V. ir bendraautoriai, [2] buvo pabrėžta, kad CYP4F2 A1347A genotipo nešiotojai turi naudoti didesnes varfarino dozes būtent įsotinimo metu negu pacientai, kurių genotipas G/G ar G/A.

36

14. Išvados

1. Varfarino įsotinimo metu pacientai, vartojantys amiodaroną, naudojo mažesnes varfarino dozes nei nevartojantys šio vaisto. Ilgalaikio gydymo metu - pacientams buvo reikalingos mažesnės varfarino dozės, jeigu jie vartojo bent vieną iš šių medikamentų - kilpinį diuretiką (torazemidą), kalcio kanalų blokatorius ar benzodiazepinus. Turintiems padidėjusį kreatinino kiekį ar padidintą šarminės fosfatazės aktyvumą reikėjo mažesnių varfarino paros dozių, nei esant normos rodikliams, vartojant varfariną nuolatos. Tiek rūkantys, tiek ir vartojantys alkoholį pacientai naudojo didesnes varfarino dozes ilgalaikio gydymo metu.

2. Tiek varfarino įsotinimo, tiek ir ilgalaikio gydymo metu, po širdies vožtuvų operacijų, CYP2C9*1*3 heterozigotai naudojo mažesnes varfarino dozes nei laukinio tipo homozigotai. VKORC1 C1173T C/C genotipą turintiems reikėjo didesnių varfarino dozių, nei T/T turintiems. C/T heterozigotams reikėjo – vidutinių paros varfarino dozių. VKORC1 G3730A G/G turintys ligoniai vartojo mažesnes varfarino dozes nei A/A turintys ligoniai. Be to, vartojant varfariną nuolatos, VKORC1 G3730A heterozigotai vartojo mažesnes dozes negu turintys A/A genotipą.

3. CYP4F2 (G1347A) G/G genotipą turintys ligoniai vartojo mažesnes varfarino dozes įsotinimo metu, nei A/A genotipą turintys pacientai. Šis genotipas nedarė įtakos varfarino dozei ilgalaikio gydymo metu.

15. Praktinės rekomendacijos

37

16. Literatūros sąrašas:

1. Derek Van Boven, Sharon Marsh, Howard McLeod, Michelle Whirl Carrillo, KatrinSangkuhl, Teri E Klein, Russ B Altman . Cytochrome P450 2C9-CYP2C9. Pharmacogenet Genomics. 2010; 20(4): 277–281.

2. Tatarunas V, Lesauskaite V, Veikutiene A, Grybauskas P, Jakuska P, Jankauskiene L, Bartuseviciute R, Benetis R. The effect of CYP2C9, VKORC1 and CYP4F2 polymorphism and of clinical factors on warfarin dosage during initiation and long-term treatment after heart valve surgery. J Thromb Thrombolysis. 2014;37(2):177-85.

3. Yang J, Chen Y, Li X, Wei X, Chen X, Zhang L, Zhang Y, Xu Q, Wang H, Li Y, Lu C, Chen W, Zeng C, Yin T. (2013) Influence of CYP2C9 and VKORC1 genotypes on the risk of hemorrhagic complications in warfarin-treated patients: a systematic review and meta-analysis. Int J Cardiol. 2013;168(4):4234-43.

4. PharmGKB [Internet]. Palo Alto (CA): Stanford University. VIP Variant in VKORC1. [cited 2012 Feb 24]. Available from: http://www.pharmgkb.org/rsid/rs9923231 - tabview=tab2.

5. Rieder MJ, Reiner AP, Gage BF, Nickerson DA, Eby CS, McLeod HL, et al. Effect of VKORC1 haplotypes on transcriptional regulation and warfarin dose. N Engl J Med. 2005;352:2285–2293. 6. Ryan P. Owen, Li Gong, HershSagreiya, Teri E. Klein, and Russ B. Altman, VKORC1

Pharmacogenomics Summary. Pharmacogenet Genomics. 2010; 20(10): 642–644.

7. Fu Z, Nakayama T, Sato N, Izumi Y, Kasamaki Y, Shindo A, Ohta M, Soma M, Aoi N, Sato M, Matsumoto K, Ozawa Y, Ma Y. A haplotype of the CYP4F2 gene is associated with cerebral infarction in Japanese men. Am J Hypertens. 2008;21(11):1216-23

8. Tatarunas V, Jankauskiene L, Kupstyte N, Skipskis V, Gustiene O, Grybauskas P, Lesauskaite V. The role of clinical parameters and of CYP2C19 G681 and CYP4F2 G1347A polymorphisms on platelet reactivity during dual antiplatelet therapy. Blood Coagul Fibrinolysis. 2014;25(4):369-74 9. Bhagavan N.V., Ha C.E. Essentials of medical biochemistry: with clinical cases. Amsterdam, Boston

et al.: Elsevier; 2011. p. 275 – 279, 282.

10. Bruce Alberts, Alexander Johnson, Julian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, Peter Walter. Molecular biology of the cell. New York: Garland Science, 2008, p. 206

11. Vaidutis Kučinskas. Genetikos ir genomikos pagrindai. 2012. p. 12-30.

38 13. Dahm R. Discovering DNA: Friedrich Miescher and the early years of nucleic acid research. Human

Genetics. 2008; 122: 565–581.

14. Physical biochemistry, David Sheehan, Wiley Blackwell, 2009 p 285

15. Miller, S. A.; Dykes, D. D.; Polesky, H. F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. 1988

16. Matson, Robert S. Microarray Methods and Protocols. Boca Raton, Florida: CRC. 2008 p. 27–29 17. Kumar, Anil. Genetic Engineering. New York: Nova Science Publishers. 2006 p. 101–102

18. Boom R, Sol CJ, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 1990;28(3):495-503.

19. Parpugga T.K., Tatarunas V. et al. The Effect of PAI-1 4G/5G Polymorphism and Clinical Factors on Coronary Artery Occlusion in Myocardial Infarction. Disease Markers.2015; 8

20. Applied biosystems, life technologies. Real-time PCR handbook. 2014. p. 2 – 3.

21. http://www.thermofisher.com/lt/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/qpcr-education/qpcr-vs-digital-pcr-vs-traditional-pcr.html#2 Ar thermofisher.com. Life sciences. PCR. Real-Time PCR (qPCR). qPCR vs. Digital PCR vs. Traditional PCR

22. Elahi E., Ronaghi M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Molecular Biology 2004; 255: 211-219.

23. Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Research 2001; 11: 3-11. 24. Ansell J, Hirsh J, Hylek E, Jacobson A, Crowther M, Palareti G. Pharmacology and management of

the vitamin K antagonists: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines (8th Edition).Chest. 2008;133:160S-198S

25. Bertram G. Katzung, Susan B. Masters, Anthomy J. Trevor. Basic and clinical pharmacology 2012. 594-595;

26. Andrew Liu, BSc Hon, BScPhm, RPh; Carmine Stumpo, BScPhm, PharmD, RPh Warfarin-Drug Interactions Among Older Adults. Medscape. 2007;10(10):643-646.

27. Jennifer H Martin, Clinical Pharmacologist and General Physician, Departments of Medicine and Chemical Pathology, Royal Brisbane and Women's Hospital, and Diamantina Institute, The University of Queensland, Brisbane. Pharmacogenetics of warfarin - is testing clinically indicated? Aust Prescr 2009;32:76-80

28. Nathisuwan S, Dilokthamsakul P, Chaiyakunapruk N, Morarai T, Yodting T, Piriyachananusorn N. Assessing evidence of interaction between smoking and warfarin: a systematic review and meta-analysis. Chest. 2011 May;139(5):1130-9

39 30. Julie A. Johnson and Larisa H. Cavallari. Pharmacogenetics and Cardiovascular Disease—

Implications for Personalized Medicine. Pharmacol Rev. 2013; 65(3): 987–1009.

31. Matthew G. McDonald, Mark J. Rieder, Mariko Nakano, Clara K. Hsia, and Allan E. Rettie. CYP4F2 Is a Vitamin K1 Oxidase: An Explanation for Altered Warfarin Dose in Carriers of the V433M

Variant. Mol Pharmacol. 2009; 75(6): 1337–1346.

32. McDonald MG, Rieder MJ, Nakano M, Hsia CK, Rettie AE. CYP4F2 Is a vitamin K1 oxidase: an explanation for altered warfarin dose in carriers of the V433M variant. Mol Pharmacol. 2009;75:1337–46.

33. Singh O, Sandanaraj E, Subramanian K, Lee LH, Chowbay B. Influence of CYP4F2 rs2108622 (V433M) on warfarin dose requirement in Asian patients. Drug Metab Pharmacokinet. 2011;26:130– 6.

34. Huang SW, Xiang DK, Huang L, Chen BL, An BQ, et al. Influence of GGCX genotype on warfarin dose requirements in Chinese patients. Thromb Res 2011. 127: 131–134.

35. Maria L. Alvarellos,Katrin Sangkuhl, Roxana Daneshjou,Michelle Whirl-Carrillo,Russ B. Altman, and Teri E. Klein . PharmGKB summary: very important pharmacogene information for CYP4F2. Pharmacogenet Genomics. 2015;25(1):41-7

36. M. Whirl-Carrillo, E.M. McDonagh, J. M. Hebert, L. Gong, K. Sangkuhl, C.F. Thorn, R.B. Altman and T.E. Klein. Pharmacogenomics Knowledge for Personalized Medicine. Clinical Pharmacology & Therapeutics 2012. 92(4): 414-417.

37. Holford NH. Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of warfarin. Understanding the dose-effect relationship. Clin Pharmacokinet. 1986 Nov-Dec;11(6):483-504.

38. Hirsh J, Dalen JE, Deykin D, Poller L, Bussey H. Oral anticoagulants: mechanism of action, clinical effectiveness, and optimal therapeutic range. Chest. 1995;108(4 Suppl):231S–46S.

39. Gong IY, Tirona RG, Schwarz UI, Crown N, Dresser GK, et al. (2011) Prospective evaluation of a pharmacogenetics-guided warfarin loading and maintenance dose regimen for initiation of therapy. Blood. 2011 Sep 15;118(11):3163-71

40. Inna Y. Gong, Ute I. Schwarz, Natalie Crown, George K. Dresser, Alejandro Lazo-Langner, GuangYong Zou, Dan M. Roden, C. Michael Stein, Marc Rodger, Philip S. Wells, Richard B. Kim, Rommel G. Tirona. Clinical and Genetic Determinants of Warfarin Pharmacokinetics and Pharmacodynamics during Treatment Initiation. Blood. 2011. November 16,

41. Ascenzi P, Fasano M .Allostery in a monomeric protein : the case of human serum albumin. Biophys 2010. 148: 16- 22

40 43. Roxana Daneshjou, Nicholas P Tatonetti, Konrad J Karczewski, Hersh Sagreiya, Stephane Bourgeois,Katarzyna Drozda, James K Burmester, Tatsuhiko Tsunoda, Yusuke Nakamura, Michiaki Kubo, Matthew Tector, Nita A Limdi, Larisa H Cavallari, Minoli Perera, Julie A Johnson, Teri E Klein, and Russ B Altman. Pathway analysis of genome-wide data improves warfarin dose prediction. BMC Genomics. 2013; 14: S11.

44. Mark J. Rieder, Ph.D., Alexander P. Reiner, M.D., M.P.H., Brian F. Gage, M.D., M.Sc., Deborah A. Nickerson, Ph.D., Charles S. Eby, M.D., Howard L. McLeod, Pharm.D., David K. Blough, Ph.D., Kenneth E. Thummel, Ph.D., David L. Veenstra, Pharm.D., Ph.D., and Allan E. Rettie, Ph.D. Effect of VKORC1 Haplotypes on Transcriptional. Regulation and Warfarin Dose. N Engl J Med. 2005; 352:2285-93

45. Oldenburg J, Bevans CG, Müller CR, Watzka M . Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1): the key protein of the vitamin K cycle. Antioxid. Redox Signal. 2006. 8 (3-4): 347–53. 46. Tie JK, Nicchitta C, von Heijne G, Stafford DW. Membrane topology mapping of vitamin K epoxide

reductase by in vitro translation/cotranslocation. J Biol Chem. 2005;280 (16)

47. Tie JK, Jin DY, Stafford DW. Human vitamin K epoxide reductase and its bacterial homologue have different membrane topologies and reaction mechanisms. J Biol Chem. 2012;287(41):33945-55 48. Schulman S, Wang B, Li W, Rapoport TA. Vitamin K epoxide reductase prefers ER

membrane-anchored thioredoxin-like redox partners. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010;107(34):15027-32. 49. Rishavy MA, Usubalieva A, Hallgren KW, Berkner KL. Novel insight into the mechanism of the

vitamin K oxidoreductase (VKOR): electron relay through Cys43 and Cys51 reduces VKOR to allow vitamin K reduction and facilitation of vitamin K-dependent protein carboxylation. J Biol Chem. 2011;286(9):7267-78.

50. Levine M, Pizon AF, Padilla-Jones A, Ruha AM. Warfarin overdose: a 25-year experience. J Med Toxicol 2014; 10:156.

51. Kalsotra A, Strobel HW. Cytochrome P450 4F subfamily: at the crossroads of eicosanoid and drug metabolism. Pharmacol Ther. 2006;112:589–611.

52. Moreau C., Loriot MA, Siguret V. Vitamin K antagonist : from discovery to pharmacogenetics. Ann Biol Clin. 2012. 70:53-551

53. Rieder MJ, Reiner AP, Gage BF, Nickerson DA, Eby CS, McLeod HL, Blough DK, Thummel KE, Veenstra DL, Rettie AE. Effect of VKORC1 haplotypes on transcriptional regulation and warfarin dose. N Engl J Med 2005. 352:2285-2293

41 55. Greinacher A., Theodore E. Warkentin. The direct thrombin inhibitor hirudin. Journal of Thrombosis

and Haemostasis, 2008, 99, 819–829.

56. Mismetti P., Laporte S. New oral antithrombotics: a need for laboratory monitoring. For. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2008, 621–626.

57. Weitz JI, Eikelboom JW, Samama MM. American College of Chest Physicians. New antithrombotic drugs: Antithrombotic Therapy and Prevention of Thrombosis, 9th ed: American College of Chest Physicians Evidence-Based Clinical Practice Guidelines. Chest. 2012;141

58. Domenici E, Bertucci C, Salvadori P, Wainer IW. Use of a human serum albumin-based high-performance liquid chromatography chiral stationary phase for the investigation of protein binding: detection of the allosteric interaction between warfarin and benzodiazepine binding sites. J Pharm Sci 1991,80:164–166.

59. ACC/AHA Guidelines for the magement of patients with valvular heart disease. JACC 2008;32(5): 1558-65

60. Groves P.Surgery of valve disease: late results and late complication. Heart 2001;86:715-21.

61. Regina Jonkaitienė, Rimantas Benetis, Renata Eidukaitytė. Pacientų, kuriems protezuoti vožtuvai, ambulatorinė priežiūra. Medicina (Kaunas) 2005; 41(7).

62. Tsuyoshi Kaneko and Sary F. Aranki. Anticoagulation for prosthetic valves. Thrombosis.2013;4.

63. Kumar et al. Robbins Basic Pathology, 8 edn. 2007,48