KAUNO MEDICINOS UNIVERSITETAS
Aida Žvirblienė
Ligonių, sergančių uždegiminėmis žarnų ligomis,
genotipo, fenotipo ir mitybos ypatybės
Daktaro disertacija
Biomedicinos mokslai, medicina (07 B)
Kaunas, 2007
Mokslinio darbo vadovas:
Prof. habil. dr. Limas Kupčinskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, medicina – 07 B).
Konsultantas:
Prof. habil. dr. Vilius Grabauskas (Kauno medicinos universitetas, biomedicinos mokslai, visuomenės sveikata – 10 B).
TURINYS
SUTRUMPINIMAI IR SIMBOLIAI... 4
1. ĮVADAS... 6
1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai ... 7
1.2. Darbo mokslinis naujumas ... 8
2. LITERATŪROS APŽVALGA... 9
2.1. Uždegiminės žarnų ligos... 9
2.1.1. Uždegiminių žarnų ligų etiologija ... 15
2.1.2. Epidemiologiniai uždegiminių žarnų ligų duomenys ... 16
2.2. Genetinė analizė medicininiuose tyrimuose ... 17
2.2.1. Genų sankibos analizė (angl. linkage analysis)... 17
2.2.2. Ryšio nustatymo (angl. association) tyrimai ... 18
2.3. Uždegimininių žarnų ligų genetinė charakteristika ... 18
2.3.1. Uždegiminių žarnų ligų genetinės epidemiologijos duomenys ... 18
2.3.2. Uždegimines žarnų ligas lemiantys genetiniai veiksniai ... 21
2.4. CARD15 genas (angl. caspase recruitment domain) ... 22
2.4.1. CARD15 geno polimorfizmas ... 23
2.5. Naviko nekrozės faktorius (angl. Tumor necrosis factor, TNF)... 24
2.5.1. TNF geno polimorfizmas... 26
2.6. Kiti genai, siejami su uždegiminėmis žarnų ligomis ... 30
2.7. Mityba ir uždegiminės žarnų ligos ... 31
3. TIRIAMOJI DALIS ... 33
3.1. Tirtasis kontingentas... 33
3.2. Tyrimo metodai ... 34
4. DARBO REZULTATAI... 41
4.1. Ligonių sirgusių opiniu kolitu ir Krono liga, ligos istorijų retrospektyvioji analizė 41 4.2. Sergančiųjų UŽL genų bei jų ryšio nustatymo su fenotipu tyrimas ... 47
4.3. Mitybos ypatybės, sergant uždegiminėmis žarnų ligomis ... 57
5. DARBO REZULTATŲ APTARIMAS ... 60
5.1. Retrospektyvioji sergančiųjų UŽL fenotipinių požymių ir klinikinės eigos analizė 60 5.2. Sergančiųjų UŽL genų bei jų ryšio nustatymo su fenotipu tyrimas ... 63
5.3. Sergančiųjų uždegiminėmis žarnų ligomis mitybos ypatybės... 66
6. IŠVADOS ... 69
7. LITERATŪROS SĄRAŠAS ... 70
8. MOKSLO STRAIPSNIŲ DISERTACIJOS TEMA SĄRAŠAS... 85
SUTRUMPINIMAI IR SIMBOLIAI
DNR bazės
A Adeninas G Guaninas C Citozinas T TiminasAbD assay(s) by design (Applied Biosystems, available at https://www.store.appliedbiosystems.com)
bp bazių pora
°C Celsijaus laipsnis
CARD Kaspazes aktyvuojantis ir sutelkiantis domenas (angl. caspase recruitment domain) NOD Nukleotido oligomerizacijos domenas (angl. nucleotide oligomerisation domain) CEPH Centre d’Etude du Polymorphisme Humain firmos ląstelių linijos
DDV Dvigubai distiliuotas vanduo DNR Dezoksiribonukleininė rūgštis FAMTM 6- karboksifluoresceinas Pav. Paveikslėlis HVP Hardžio-Vainbergo pusiausvyra kb kilobazė SP Sankibos pusiausvyra MB Megabazė µl mikrolitras mmol milimolis
NCBI Nacionalinis Biotechnologijos Informacijos Centras (angl. National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
nmol nanomolis
NBD Nukleotido jungimosi domenas (angl. nucleotide binding domain) TLR „varpelio“ tipo receptorius (angl. Toll like receptor)
LRR leucino kartotinė seka (angl. Leucine reach repeat) ANCA antineutrofiliniai citoplazmos antikūniai
HLA žmogaus leukocitų antigenas (angl.human leukocite antigen) pmol pikomolis
TAMRA 6-karboksitetrametilrodaminas
TaqMan® Sekos eilės nustatymo, naudojant 5’→3’ egzonukleazės aktyvumą, reagento komercinis pavadinimas (angl. commercial name for sequence variation detection assay, using 5’→3’ exonuclease activity)
TET Tetachloro-6- karboksifluoresceinas
TNFA Navikų nekrozės faktorius alfa (angl. tumor necrosis factor alpha) SD Standartinė deviacija
VNP Vieno nukleotido polimorfizmas (angl. single nucleotide polimorphysm, SNP) SPSS Socialinių mokslų statistinis paketas (angl. statistical package for the social sciences) VIC® Applied Biosystems firmos fluorescentiniai dažai
FG2 buferis Guanidino hidrochloridas QIAGEN Proteazė subtilizinas FG1 buferis Lyzės buferis
TrisEDTA buferis Tris-hydroksimetilaminometanas PGR Polimerazės grandininė reakcija
UŽL Uždegiminė žarnų liga (angl. IBD, inflammatory bowel disease)
OK Opininis kolitas
KRL Krono liga
PSCH Pirminis sklerozuojantis cholangitas
CDAI Krono ligos klinikinis aktyvumo indeksas (angl. Crohn’s disease activity index) CAI Opinio kolito klinikinis aktyvumo indeksas (angl. Ulcerative colitis activity index) KMI Kūno masės indeksas
1. ĮVADAS
Kasmet didėjantis industrinėse, išsivysčiusiose Vakarų Europos ir Šiaurės Amerikos šalyse sergančių uždegiminėmis žarnų ligomis – opiniu kolitu ir Krono liga –pacientų skaičius kelia didelį viso pasaulio medikų susirūpinimą (1). Todėl šiuo metu pasaulyje ypač didelis dėmesys skiriamas aplinkos ir genetinių faktorių išaiškinimui ir jų vaidmens nustatymui opinio kolito ir Krono ligos etiopatogenezėje.
Uždegiminės žarnų ligos (UŽL) priskiriamos nežinomos etiologijos lėtinių autoimuninių virškinamojo trakto ligų grupei. Manoma, kad šių ligų atsiradimas susijęs su tam tikrais organizmo imuninės sistemos sutrikimais (2). Nustatyta, kad sergančiųjų UŽL organizme žymiai padidėja tam tikrų citokinų bei chemokinų kiekiai, kurie lemia aktyvaus uždegimo išsivystymą žarnyne (3–8). Pagrindiniai šioms ligoms būdingi aktyvaus uždegimo simptomai: lėtinis viduriavimas, rektalinis kraujavimas, pilvo skausmai, karščiavimas, sąnarių skausmai, svorio kritimas. Simptomų intensyvumas įvairuoja nuo lengvo iki sunkaus laipsnio. Įvertinus klinikinius, radiologinius, endoskopinius bei histologinius kriterijus, išskiriamos dvi UŽL: opinis kolitas (OK) ir Krono liga (KRL). OK dažniausiai pasireiškia tipiniais kolito požymiais, o KRL klinika yra nepaprastai įvairi ir priklauso nuo to, kurios virškinamojo trakto sritys yra pažeistos. Šios lėtinės ligos įtakoja pacientų gyvenimo kokybę, hospitalizacijų skaičių bei mirštamumą (9–19).
Pastaraisiais metais vykdomi moksliniai tyrimai sukaupė daug naujų duomenų apie aplinkos ir genetinių veiksnių įtaką šių ligų atsiradimui bei vystymuisi.
Aplinkos veiksnių įtaką šių susirgimų etiopatogenezei rodo kintantis sergamumas, kasmet augantis pacientų skaičius, nevienodas ligų pasireiškimas bei pačių ligų ypatybės įvairiose šalyse (1, 20–29). Praeito amžiaus pirmaisiais dešimtmečiais Pietų Europoje ir Amerikoje užregistruota daugiau opinio kolito atvejų, tačiau jau nuo 1965 m. iki 1980 m. vakarų šalyse registruojamas ypač greitas sergančiųjų Krono liga skaičiaus augimas. Remiantis pirmojo Europoje atlikto (1991 10 01-1993 09 30) UŽL registro, kuriame dalyvavo 20 Europos centrų, duomenimis, randami tam tikri UŽL skirtumai tarp šiaurės, vidurio bei pietų Europos (30). Sergamumas OK yra 40 proc. didesnis, Krono liga 80 proc. didesnis šiauriniuose centruose nei pietiniuose. Opiniu kolitu daugiausiai serga Islandijoje (24,5/105), o Krono liga daugiausiai serga Maastrichte, Olandijoje (9,2/105) ir Amiene, šiaurės-vakarų Prancūzijoje (9,2/105). Mažiausias naujų OK atvejų skaičius per metus yra Almadoje, pietinėje Portugalijoje (1,6/105), o Krono ligos – Joaninoje (Ionnina), šiaurės-vakarų Graikijoje (0,9/105). Remiantis pastaraisiais epidemiologiniais tyrimais, buvo nustatyta, jog Europoje egzistuoja opinio kolito ir Krono ligos sergamumo šiaurės-pietų gradientas. Toks pat dėsningumas nustatytas ir Jungtinėse Amerikos
Valstijose. Remiantis neseniai atliktais epidemiologiniais tyrimais Rytų Europos šalyse, nustatytas vakarų-rytų gradientas, o šiaurės-pietų gradientas pamažu nyksta (73, 84).
Neabejojama, kad OK ir KRL turi genetinės ligos požymių. Tai įrodo:
1. Skirtingas ligos paplitimas įvairiose etninėse grupėse (dažniau serga žydų tautybės asmenys) (31–37) ir tarp rasių (naujų atvejų dažnumas didesnis tarp baltaodžių) (1, 38). 2. Šeiminė asociacija (~20 proc. ligonių tėvai yra sirgę) (39-53):
– 10 kartų padidėja rizika susirgti UŽL.
– Nulemia ankstyvesnę ligos pradžią, pažeidžiama didesnė žarnų dalis. Jaunesnis ligos amžius atspindi atskirą ir sunkesnį Krono ligos fenotipą su skirtingu genetiniu komponentu.
– Šeiminė asociacija labiau būdinga sergantiems Krono liga nei OK.
3. Didesnis sergamumas tarp monozigotinių dvynių, lyginant su dizigotiniais. Krono ligos atveju ši įtaka labiau reikšminga nei sergant OK (39, 54–57).
4. Nuo 3 iki 20 kartų didesnė rizika susirgti ligonio pirmos eilės giminaičiams, lyginant su bendra populiacija (33, 40, 41, 43).
5. Ryšys su kitomis genetinio polinkio ligomis: ankilozuojančiu spondilitu, psoriaze, celiakine liga, išsėtine skleroze (58–61).
Šiuo metu žmonių populiacijų genetiniai tyrimai visame pasaulyje yra labai intensyvūs, nes genetiniai dabartinių populiacijų skirtumai sparčiai nyksta dėl intensyvėjančios įvairių šalių gyventojų migracijos ir rasių maišymosi. Ieškant UŽL lemiančių genetinių veiksnių sistemiškai yra tiriamas visas genomas arba tiriami genai kandidatai. 2001 metais, atliekant genomo analizę, nustatytas pirmasis Krono ligos vystymąsį bei UŽL lokalizaciją lemiantis genas NOD2/CARD15. Tai vienas iš intensyviausiai šiuo metu tiriamų genų visame pasaulyje (62–64), nes ligos geno mutacijų įtaka UŽL rizikai bei fenotipinei išraiškai skiriasi tarp įvairių populiacijų.
1.1. Darbo tikslas ir uždaviniai
Darbo tikslas – ištirti ir įvertinti sergančiųjų UŽL fenotipines ir genotipines charakte-ristikas bei mitybos ypatybes.
Darbo uždaviniai:
1. Ištirti sergančiųjų UŽL klinikinės eigos ypatybes.
2. Ištirti genų (CARD15 geno VNP8, VNP12, VNP13 ir TNF-α geno promotoriaus –308A ir –857C) mutacijų dažnį tarp sergančiųjų uždegiminėmis žarnų ligomis ir sveikų kontrolinės grupės tiriamųjų.
1.2. Darbo mokslinis naujumas
Pastaruoju metu Europoje auga susidomėjimas uždegiminių žarnų genetine epidemiologija Baltijos šalyse, kurios ribojasi su Šiaurės Europos šalimis – Suomija, Švedija – kur sergamumas UŽL yra žemas, lyginant su kitomis Skandinavijos šalimis, kur sergamumas UŽL yra didelis. Skirtingose populiacijose nustatoma nevienoda genų kandidatų įtaka UŽL rizikai bei ryšys su ligos fenotipu
Lietuvoje UŽL nebuvo tyrinėtos. Todėl nėra žinomas tikslus opiniu kolitu ir Krono liga sergančiųjų pacientų skaičius, kokiomis ligos sunkumo formomis jie serga, kokios yra šios ligos ypatybės Lietuvoje, Vidurio-Rytų Europos regione. KMU Gastroenterologijos klinika ir jos mokslininkų grupė, bendradarbiaudama su Kylio klinikinės molekulinės biologijos Instituto, Christian – Albrechts universiteto, mokslininkų grupe (Vokietija), 2002 m. pradėjo genetinius uždegiminių žarnyno ligų – opinio kolito ir Krono ligos – tyrinėjimus. Mūsų partneriai buvo vieni iš pirmųjų pasaulyje, atradę CARD15/NOD2 geną ir nustatę jo ryšį su Krono liga 2001 metais.
Pirmą kartą Lietuvoje nustatytas TNF-α geno, susijusio su uždegiminėmis žarnų ligomis, ir CARD15/NOD2 geno, susijusio su Krono ligos išsivystymu, mutacijų dažnis tarp pacientų, sergančių UŽL bei sveikų kontrolinės grupės asmenų.
2. LITERATŪROS APŽVALGA
2.1. Uždegiminės žarnų ligos
Uždegiminės žarnų ligos (UŽL) – tai lėtinės virškinamojo trakto ligos. Šios ligos dar vadinamos idiopatinėmis uždegiminėmis žarnų ligomis, nes iki šiol nėra visiškai aiški šių ligų etiologija ir patogenezė. UŽL grupei priskiriamos dvi ligos: opinis kolitas (OK) ir Krono liga (KRL), kurios diagnozuojamos remiantis klinikinių, radiologinių, endoskopijos bei histologijos tyrimų duomenimis. Šios lėtinės ligos įtakoja pacientų gyvenimo kokybę, mirštamumą bei hospitalizacijų skaičių. UŽL susirgimo pikas pasireiškia jauname bei brandžiame amžiuje.
OK tai lėtinis storosios žarnos uždegimas, kuriam būdingas paviršinių gleivinės opų
atsiradimas. Priklausomai nuo uždegiminio proceso išplitimo storąjame žarnyne, OK skirstomas į: 1. proktitą – uždegiminiai tiesiosios žarnos pokyčiai;
2. proktosigmoiditą – uždegimas išplitęs į riestinę žarnos dalį; 3. kairiosios pusės kolitą – uždegimas iki skersinės žarnos vidurio;
4. pankolitą – apima visą storąją žarną, tačiau gali būti pažeidžiama ir nedidelė distalinės klubinės žarnos dalis
Sergant OK makroskopiškai matomi uždegiminiai pokyčiai yra ištisiniai ir monotipiški, su išopėjimais (1 pav.). Uždegimas prasideda nuo tiesiosios žarnos ir nepertraukiamai plinta proksimaliai. Ligai užsitęsus, dėl pogleivio fibrozės ir išilginės retrakcijos storoji žarna sutrumpėja.
1. Hemoraginė stadija 2. Pūlinė stadija
3 . Opinė stadija 4. Opinė – pseudopolipų stadija
5. Remisijos stadija
1 pav. Endoskopinis vaizdas. OK metu matomi makroskopiniai pokyčiai
Histologiniai pokyčiai yra nespecifiniai uždegiminiai, apimantys tik gleivinę ir pogleivį (2 pav.). Patognominių histologinių požymių nėra, tačiau OK būdinga:
1. sumažėjęs kriptų skaičius ir pakitusi jų išvaizda: šakotos, netolygaus pločio, nelygiagrečios;
2. sumažėjęs taurinių ląstelių kiekis kriptų epitelyje ir gleivių kiekis jose; 3. neutrofilinė epitelio, lamina propria infiltracija, kriptų mikroabscesai; 4. lamina propria infiltracija limfocitais, plazminėmis ląstelėmis.
Šakotos kriptos Kriptų mikroabscesai
Pseudopolipas Kraujuojanti opa
2 pav. Histologinis vaizdas (KMUK Pat. anatomijos klinika). OK metu matomi
mikroskopiniai pokyčiai
Svarbiausias klinikinis šios ligos požymis yra viduriavimas su krauju ir gleivėmis, dieną ir naktį, su tenezmais. Galimi trys OK eigos variantai:
1. Recidyvuojanti eiga: ligos pradžia dažniausiai laipsniška, paūmėjimai kaitaliojasi su remisijomis, pastarosios gali būti įvairios trukmės.
2. Lėtinė nenutrūkstama eiga: uždegimas visą laiką aktyvus, reikia nuolat gydyti, dažniausiai tenka gydyti chirurgiškai.
3. Ūmi žaibinė eiga: staigi pradžia su febriliu karščiavimu, spazminiais pilvo skausmais, vėmimu, sunkiu kraujingu viduriavimu, skysčių ir elektrolitų netekimu, galima toksinė žarnos dilatacija, lydima žarnų perforacijos.
Kai liga trunka ilgiau kaip 10 metų, gali atsirasti epitelio displazijos požymių, galinčių virsti adenokarcinoma.
Krono liga – tai lėtinė, uždegiminė žarnų liga, galinti pažeisti bet kurią virškinamojo
trakto dalį, tačiau būdingiausia pažeidimo vieta yra klubinė ir akloji žarnos. KRL klinika yra nepaprastai įvairi ir priklauso nuo to, kokios virškinamojo trakto dalys yra pažeistos. Pagrindiniai aktyvaus uždegimo simptomai yra pilvo skausmai, karščiavimas, svorio kritimas. Ši liga pagal fenotipinę išraišką, remiantis Vienos ir Monrealio klasifikacijos kriterijais, klasifikuojama į tris formas (3 pav.):
1. Uždegiminė: vyrauja nespecifiniai uždegiminiai pokyčiai, nėra nei stenozės, nei fistulės.
2. Striktūrizuojančioji (stenozuojančioji): būdinga striktūros ir įvairaus laipsnio žarnų nepraeinamumo požymiai.
3. Penetruojančioji: būdingos intraabdominalinės ar perianalinės fistulės, abscesai bet kuriuo ligos etapu.
3 pav. Schematinis Krono ligos formų pavaizdavimas, remiantis Vienos ir Monrealio
klasifikacijos kriterijais
Šios trys formos pasižymi ir skirtinga eiga. Gerybiškesnė yra striktūrizuojanti forma, o uždegiminė ir penetruojanti progresuoja agresyviau, šie ligoniai dažnai operuojami.
Sergant Krono liga, makroskopiškai nustatomi segmentiniai pokyčiai, tai yra sveikos gleivinės ploteliai kaitaliojasi su pažeistos žarnyno gleivinės ploteliais, sudarydami vad. „grindinio“ fenomeną, ir transmuralus, apimantis visus žarnyno sluoksnius, uždegimas, kurio metu susiformuoja gilios aftų pavidalo, linijinės, vingiuotos, plyšio formos opos, fizūros, fistulės tarp žarnų kilpų ar su gretimais organais, oda, išangės srities fistulės (4 pav.). Uždegimas, edema, fibrotiniai randai, besiformuojantys KRL gyjimo metu, gali salygoti striktūrų vystymąsį žarnyne ir sukelti žarnų obstrukciją.
1. Išilginės opos 2. “Grindinio” fenomenas
3. Žarnos segmentas, apimtas uždegimo 4. Pseudopolipai
5. Perianalinė fistulė 6. Enterokutaninė fistulė
4 pav. Endoskopinis vaizdas. KRL metu matomi makroskopiniai pokyčiai
Būdingiausi histologiniai pokyčiai, sergant KRL yra šie (5 pav.):
1. uždegiminė infiltracija, apėmusi visą sienelę, ypač pogleivį ir serozinį dangalą; 2. epiteliodinės nekazeozinės granuliomos;
3. labai ryškūs įvairių to paties bioptato vietų uždegiminių pokyčių skirtumai.
Krono ileitas Granulioma
5 pav. Histologinis vaizdas (KMUK Pat. anatomijos klinika). KRL metu matomi
mikroskopiniai pokyčiai
Opinis kolitas ir Krono liga gali būti lydimi ir ekstraintestininių požymių pasireiškimu: • kaulų ir sąnarių: artritas (aksialinis, neaksialinis);
• odos ir gleivinės: mazginė eritema, gangreninė pioderma, burnos aftos; • akių: uveitas, konjunktyvitas, skleritas, episkleritas;
• kepenų ir tulžies išskyrimo: pirminis sklerozuojantis cholangitas, riebalinė hepatozė, kepenų cirozė, lėtinis autoimuninis hepatitas, tulžies latakų adenokarcinoma.
Uždegiminių žarnų ligų diagnostikoje didžiausių diferencinių sunkumų tarp KRL ir OK iškyla tada, kai Krono liga pasireiškia vien kolitu. OK diferencijuoti nuo KRL ypač svarbu tada, kai svarstomas chirurginio gydymo klausimas, nes iš esmės skiriasi šių ligų chirurginio gydymo taktika. Diferenciniai OK ir KRL požymiai pateikiami 1 lentelėje.
1 lentelė. Opinio kolito ir Krono ligos diferencinė diagnostika
Požymis Opinis kolitas Krono liga
Morfologiniai pokyčiai Makroskopiniai:
• Pokyčių lokalizacija Storoji žarna Bet kuri virškinamojo trakto dalis • Pokyčių išsidėstymas Ištisinis, pradedant tiesiąja žarna Segmentinis
• Tiesiosios žarnos pažeidimas 95 – 100 proc. 25 – 50 proc. • Plonosios žarnos pažeidimas Retai, tik keli centimetrai Būdingas
• Išangės srities pažeidimas Nėra Dažnai, fistulės ar įplėšos
• Žarnų sienelės sustorėjimas Vidutinis Ryškus
Histologiniai:
• Uždegimo lokalizacija Gleivinėje Transmurali
• Nekazeozinės granuliomos Nėra Dažnai (40 proc.)
• Fibrozė Pogleivyje Transmuralinė, nelygi
• Sumažėjęs gleivių kiekis taurinėse ląstelėse
Būdingas Išimtiniais atvejais
• Kriptų abscesai Dažnai Gali būti
Klinikiniai požymiai:
• Pilvo skausmas Išimtiniais atvejais Dažnai
• Viduriavimas: Dažnai Dažnai
su krauju Būdingas Nebūdingas
su tenezmais Būdingas Nebūdingas
• Kūno masės mažėjimas Minimalus Dažnai
• Čiuopiami pilvo tumorai Retai Dažnai
• Recidyvai po kolektomijos Retai Būdingi
Kolonoskopiniai požymiai:
• Fistulės Retai Dažnai
• Žarnų obstrukcija Retai Dažnai
• Vėžys Gana būdingas, ypač ilgai trunkant
pankolitui Gali būti, bet rečiau
• Toksinė dilatacija Būdinga Nebūdinga
• Abscesai ir flegmonos Nebūna Dažnai
• Aftinės opos Retai Dažnai
• Gilios plyšinės opos Retai Dažnai
• Grindinio fenomenas Retai Dažnai
• Gleivinė apie opas Pakitusi Dažnai normali
• Žarnų sienelės pažeidimas Simetriškas Ekscentriškas
Imuniniai tyrimai Padidėjęs pANCA titras Padidėjęs ASCA titras
2.1.1. Uždegiminių žarnų ligų etiologija
Uždegiminės žarnų ligos (UŽL) priskiriamos nežinomos etiologijos lėtinių autoimuninių virškinamojo trakto ligų grupei. Manoma, kad šių ligų atsiradimas gali būti susijęs ne tik su genetiniais, imuniniais veiksniais, bet ir žarnyno flora bei maisto antigenais, kurie, kaip manoma, indukuoja ir palaiko destrukcinį ir persistuojantį „patologinį“ uždegimą. Po pirminio
uždegiminio proceso mikrobai ir jų produktai gali infiltruoti žarnyno gleivinę ir pogleivį ir sąlygoti tolesnį, antrinio uždegimo, vytymąsį bei žarnų gleivinės pažeidimus.
2.1.2. Epidemiologiniai uždegiminių žarnų ligų duomenys
Pasikeitusios gyvenimo sąlygos industrinėse šalyse lėmė ligų, kurios iki dvidešimtojo amžiaus buvo sutinkamos labai retai, o kai kuriose populiacijose iš viso neegzistavo (atopinė egzema, bronchinė astma, UŽL), atsiradimą. Pastaruosius keletą dešimtmečių išsivysčiusiose šalyse didėja sergančiųjų UŽL skaičius. Sergamumas UŽL įvairiose šalyse skiriasi. Daugumoje Europos šalių OK paplitimas yra didesnis nei KRL (išskyrus Didžiąją Britaniją (65), Prancūziją (66, 67) ir Vokietiją). 1995 m. duomenimis Pietryčių Norvegijoje sergamumas OK siekė 10,6/105, KRL 5,1/105 (68, 69). Danijoje 1981–1992 m. sergamumas OK siekė 13,2/105, KRL 4,6/105 (70, 71). Sergančiųjų OK skaičius išlieka daugmaž stabilus, tačiau nuo 1965 m. iki 1980 m. vakarų šalyse užregistruotas ypač greitas sergančiųjų Krono liga skaičiaus augimas. Šiaurės Prancūzijoje nuo 1988 m. iki 1999 m. sergamumas KRL padidėjo nuo 5,2 iki 6,4/105, tuo tarpu sergamumas OK sumažėjo nuo 4,5 iki 3,5/105 (67). Vengrijoje sergamumas OK 1977–2001 m.m. pakilo nuo 1,66 iki 11,01/105, KRL – nuo 0,41 iki 4,68/105 (72).
Skiriasi sergamumas UŽL miestuose ir kaimuose (73, 74). Kaimiškose vietovėse sergamumas UŽL išlieka nedidelis (Šiaures Vakarų Graikija (1982–1991 m.m.): OK 4/105, KRL 0,3/105 (73). Didesnis sergamumas miestuose nustatytas JAV (75), Švedijoje (Upsala) (76), Škotijoje (77) bei Minesotoje (Ročesteris) (78, 79).
Sergamumas UŽL skiriasi įvairiose žemyno dalyse. 1991–1993 m.m. atliktos Europos studijos, bendradarbiaujant dvidešimčiai šalių, duomenimis (30), sergamumas UŽL 3 kartus didesnis šiaurinėje Europos dalyje nei pietinėje: Europoje didžiausias sergamumas OK nustatytas Islandijoje (24,5/105), žemiausias – Pietų Portugalijoje (1,6/105); KRL didžiausias sergamumas Olandijoje ir Vakarų Prancūzijoje (9,2/105), mažiausias – Pietvakarių Graikijoje (0,9/105) (80). Belgijoje 1993–1996 m.m. sergamumas OK sieke 3,6/105, KRL – 4,5/105 (81). Italijoje 1989–1992 m.m. nacionalinio populiacinio tyrimo duomenimis sergamumas OK siekia 5,2/105, KRL – 2,3/105 (82). Kol kas turima nedaug duomenų apie Vidurio Europos šalių UŽL epidemiologiją. Iš buvusių sovietinio režimo šalių populiaciniai epidemiologiniai tyrimai atlikti Vengrijoje (72) ir Lenkijoje (83). Japonijoje (1991m.) sergamumas UŽL yra vienas iš mažiausių, artimas nuliui, lyginant su kitomis šalimis (OK 1,95/105, KRL 0,5/105 (34, 36). Afrikoje sergamumas OK siekia 2,3/105, KRL – 1,6/105 (84), Lotynų Amerikoje OK – 2,2/105, KRL 0,03/105 (85).
2.2. Genetinė analizė medicininiuose tyrimuose
Tiriant genetinių veiksnių įtaką ligų atsiradimui bei vystymuisi dažniausiai yra naudojami genų sankibos ir ryšių nustatymo tyrimai. Jų pagalba yra nustatomi genetiniai lokusai, susiję su ligomis, kurių vystymąsį, kaip manoma, lemia daugelis genų. Sąsajos tarp ligos ir konkretaus geno ieškomos, tiriant šeimas arba giminystės ryšiais nesusijusius individus. Šis atvejo – kontrolės tyrimas yra populiacinis, analitinis stebėjimo tyrimas, kurio tikslas nustatyti ligų priežastis (ryšius tarp ligos požymio ir genetinių markerių) lyginant genotipų dažnius tarp tam tikra liga sergančiųjų (atvejų, nesusijusių tarpusavyje giminystės ryšiais) ir sveikų žmonių (kontrolės, nesusijusių tarpusavyje giminystės ryšiais). Genų sankibos tyrimais nustatome ryšį tarp markerio (dažniausi markeriai yra trumpos kartotinės sekos, vad. mikrosatelitais) ir spėjamo genetinio lokuso. Genotipų sąsajos tyrimai yra naudojami tam, kad tiksliai nustatyti su liga susijusių markerių vietą. Galimi markerių kanditatai toliau tiriami, norint nustatyti, kokios yra jų funkcinės galimybės ligos kontekste.
2.2.1. Genų sankibos analizė (angl. linkage analysis)
Genų sankibos tyrimais nustatome ryšį tarp markerio ir spėjamo genetinio lokuso. Tiriamas šansų logaritmas LOD (angl. logarithm of odds), kuris pažymi, ar du lokusai (du geno saitai, esantys greta vienas kito vienoje chromosomoje) paveldimi kartu, sukibę. Labai polimorfinės kartotinės sekos, kurių vieta chromosomoje yra žinoma, genotipuojamos, taikant polimerazės grandininės reakcijos (PGR) metodą. Susidarę reakcijos metu fragmentai atskiriami elektroforezės metu visame ilgyje. Tokie mikrosatelitai pasiskirstę visame genome maždaug 100 kb intervalais. Pasikartojančiose sekose varijuoja skirtingi aleliai.
Parametrinei lod reikšmės analizei reikalinga ištirti didelį šeimų skaičių ir turi būti pagrįstas Mendelio paveldimumo dėsnis genų sankibai įrodyti. Tačiau daugelio ligų atveju tiriamos šeimos mažos, tad paveldimumo būdas išlieka neaiškus. Tuomet geriau taikyti neparametrinius genų sankibos analizės metodus, kur nereikalaujama tiksliai nustatyti paveldimumo būdo. Pastaroji analizė parodo, kad alelių perdavimas sergantiems vienų tėvų vaikams nukrypsta nuo Mendelio dėsnių. Reikšmingai padidėjęs paveldimas alelių dažnis patvirtina, kad markeris yra susijęs su ligos lokusu. Įvairiapusė genų sankibos analizė atliekama, norint nustatyti keletą markerių, esančių toje pačioje chromosomoje. Kuo arčiau ligos geno randasi mikrosatelitas, tuo didesnė LOD vertė apskaičiuojama, nes retos rekombinacijos. Jei LOD reikšmė yra daugiau už tris, tai rodo, kad du geno lokusai yra greta vienas kito vienoje chromosomoje (LOD daugiau už 3 = kad yra 1000 šansų iš vieno, kad genai yar sankiboje ir bus paveldimi kartu). Sėkminga genų sankibos analizė priklauso nuo markerių informatyvumo, surinktos populiacijos dydžio bei fenotipų komplekso.
2.2.2. Ryšio nustatymo (angl. association) tyrimai
Atliekant šį mokslinį darbą buvo taikytas genetinio ryšio nustatymo tyrimas lyginant sergančiuosius UŽL su kontrolinės grupės tiramaisiais. Ryšio nustatymo tyrimai naudojami identifikuoti genus, kurie, galbūt, susiję su liga. Šiems tyrimams atlikti gali buti taikomas atvejo – kontrolės arba šeimų tyrimų dizainas. Vieno nukleotido polimorfizmas (VNP) naudojamas, norint išaiškinti su liga susijusio geno lokalizaciją.
Atvejo – kontrolės tyrimo metu tiriami pacientai (atvejai, nesusije tarpusavyje giminystes ryšiais) bei sveiki (kontrolė, nesusiję tarpusavyje giminystės ryšiais) individai. Statistiškai reikšmingas ryšys tarp markerio (VNP) ir ligos nustatoma, lyginant genotipų (taigi, ir alelių) dažnį abiejose grupėse.
Atvejo – kontrolės ryšio nustatymo tyrimą riboja tai, kad gali būti nustatomi ryšiai ir tada, jei atvejų ir kontrolės grupės buvo sudarytos iš genetiškai skirtingų populiacijų, netgi ir tuo atveju, jei abiejose populiacijose ligos genas neegzistuoja. Skirtingų populiacijų maišymas duoda klaidingai teigiamus arba klaidingai neigiamus ryšius. Klaidingų ryšių galimybė priklauso nuo populiacijos surinkimo, nuo požymio, kurį ruošiamasi tirti bei pasirinkto tirti markerio (VNP).
Šeimų ryšio nustatymo tyrimų metu analizuojami šeimų duomenys. Šie tyrimai leidžia išvengti suvienodinimo (angl. matching) klaidų, kurios galimos atvejo - kontrolės tyrimo metu. Tačiau šeimų surinkimas yra žymiai sudėtingesnis nei atvejų ir kontrolės, ypač jei ligos pradžia pasireiškia vyresniame amžiuje.
2.3. Uždegimininių žarnų ligų genetinė charakteristika
2.3.1. Uždegiminių žarnų ligų genetinės epidemiologijos duomenys Neabejojama, kad OK ir KRL turi genetinės ligos požymių.Tai įrodo: A. Sergamumas tarp monozigotinių dvynių, lyginant su dizigotiniais.Švedijoje (86), Didžiojoje Britanijoje (87) ir Danijoje (56) buvo atliktos dvynių studijos, siekiant nustatyti UŽL konkordantiškumą. Nustatyta, kad tarp KRL sergančių monozigotinių dvynių ligos konkordantiškumo santykis yra 58,5 proc., o tarp sergančių OK – 6,3–18,2 proc. Anglų mokslininkai nurodė, kad tarp KRL sergančių monozigotinių dvynių konkordantiškumo santykis yra 42,4 proc., o tarp monozigotinių dvynių, sergančių OK – 16,5 proc. Tuo tarpu konkordantiškumo santykis tarp dizigotinių dvynių, sergančių KRL, sudarė 0–12 proc., o tarp sergančių OK – 0–5,3 proc.. Atliktų tyrimų duomenimis, genetinių veiksnių įtaka sergamumui Krono liga labiau reikšminga nei sergamumui OK. Tai parodo paveldėjimo koeficientas, kuris apskaičiuojamas įvertinus konkordantiškumo santykio rezultatus. Nustatyta, kad KRL
paveldėjimo koeficientas yra tokio paties reikšmingumo, kaip ir bronchinės astmos ar I tipo cukrinio diabeto.
B. Ligos paplitimo skirtumai tarp įvairių etninių grupių ir rasių.
Atlikus UŽL paplitimo tarp skirtingų etninių grupių analizę nustatyta, kad didžiausias UŽL paplitimas yra žydų populiacijoje. Jis 2–9 kartus didesnis nei kitose etninėse grupėse, nepriklausomai nuo geografinės vietovės ir išgyvento laiko tarpo (88, 89).
Remiantis epidemiologinių studijų, ištyrusių UŽL paplitimą tarp rasių, duomenimis, didžiausias UŽL ligų paplitimas yra tarp kaukazietiškos rasės baltaodžių, o mažiausias – tarp azijiečių (90, 91). Tačiau pastaruosius duomenis reikia interpretuoti atsargiai. Kurata JH ir kt. (1992, P. 1947 ) nustatė, kad sergančiųjų KRL hospitalizacijų skaičius tarp afro-amerikiečių ir kaukaziečių yra panašus (92). Perspektyvaus tyrimo, atlikto Didžiojoje Britanijoje, duomenimis, sergamumas OK ir KRL tarp juodaodžių vaikų yra panašus kaip ir baltaodžių populiacijoje (93). Jaunų azijiečių, gimusių Didžiojoje Britanijoje, sergamumas OK žymiai didesnis nei tenykščių Europos gyventojų (94). Laičesteryje (Didžioji Britanija) atliktos trijų metų perspektyvinio tyrimo duomenys parodė, kad sergamumas OK tarp antros kartos azijiečių yra didesnis, lyginant su pirmąja karta. Įdomu tai, kad sergamumas OK antroje azijiečių kartoje yra didesnis nei tarp kaukaziečių (95).
C. Šeiminė sąsaja.
Teigiama šeiminė anamnezė tarp pirmos ar antros eilės giminaičių nustatyta 6 –32 proc. UŽL sergančių pacientų (45, 46, 51, 96–101). Pirmos eilės giminaičiams rizika susirgti Krono liga padidėja nuo 3 iki 36 kartų, opiniu kolitu – nuo 7–17 kartų (53, 97). Teigiama šeiminė anamnezė labiau paplitusi tarp žydų kilmės pacientų ir pacientų su ankstyva ligos pradžia (98). Krono liga vidutiniškai prasideda 22-aisiais, OK – 23-iaisiais gyvenimo metais, esant teigiamai šeiminei anamnezei. Nesant šeiminės anamnezės KRL pasireiškia apie 27-uosius, OK – apie 28,6-uosius metus (48, 98, 102). Krono liga sergantiems pacientams su teigiama šeimine anamneze, skirtingai nuo pacientų su neigiama šeimine anamneze, liga pasireiškia jaunesniame amžiuje ir dažniausiai pažeidžiama plonoji žarna. Tarp pacientų, turinčių teigiamą ir neigiamą šeimines anamnezes OK sunkumo laipsnis bei chirurginės intervencijos rizikos dažnis nesiskiria (99). Taip pat nustatyta, kad esant genetiniam paveldėjimo pagrindui bei veikiant atitinkamiems aplinkos veiksniams, galimas kryžminis (angl. cross-occurrence) UŽL pasireiškimas. Pavyzdžiui, tėvų poros vienam iš vaikų, kuris rūko, vystosi Krono liga, o nerūkančiajam vystosi OK.
D. Ryšys su kitais genetiniais sindromais.
UŽL, Blau sindromas ir sarkoidozė priskiriamos granuliomatozinių sisteminių ligų
NOD2/CARD15 mutacijų, lemiančių NF – kappaB padidėjusią aktyvaciją bei monocitų dalijimąsi į gigantines epitelioidines ląsteles, formuojačias granuliomas.
Blau sindromas – tai retas autosominis dominantinis susirgimas, charakterizuojamas ankstyva ligos pradžia, granuliomatoziniu artritu, uveitu, odos bėrimu bei kamptodaktilija. Atlikus genų sankibos šeiminę analizę nustatytas šio sindromo ryšys su NOD2/CARD15 mutacija 16q12 chromosomoje. Blau sindromo ir Krono ligos simptomų panašumai paskatino Miceli Richard ir kt. (2001) ieškoti CARD15 geno mutacijų šeimose su Blau sindromu (103). Jis ištyrė 4 šeimas su klasikiniais Blau sindromo požymiais. Dviejose iš jų nustatė klaidingos prasmės (angl. missens, geno koduojamame baltyme vietoj vienos aminorūgšties būna kita. Tai sąlygoja mutantinių (pakitusių) baltymų sintezę) mutaciją Arg334Gln; kitose dviejose šeimose nustatė klaidingos prasmės mutacijas: Leu469Phe, Arg334Trp. Šios mutacijos randasi CARD15 geno nukleotido jungimosi domene (NOD); tuo tarpu Krono ligos atveju mutacijos randasi leucino kartotinių sekų domene (LRR) (103).
Sarkoidozė – tai lėtinė nežinomos etiologijos liga, kuriai būdinga T limfocitų ir mononuklearinių fagocitinių ląstelių susikaupimas įvairiuose organuose (daugiausiai plaučiuose, limfmazgiuose, odoje, akyse, blužnyje, kepenyse, kaulų čiulpuose, seilių bei ašarų liaukose), audinių pažeidimas ir epitelioidinių ląstelių granulomų be kazeozinės nekrozės susidarymas. Dažniausiai šia liga serga 15–40 metų žmonės. Kadangi Blau sindromo klinikiniai požymiai panašūs į ankstyvos pradžios sarkoidozę (angl. early – onset sarcoidosis, EOS), Miceli-Richard ir kt (2001, P.19) atliko dviejų pacientų, sergančių EOS, CARD15 geno analizę. Tačiau jokie genetiniai pakitimai nebuvo nustatyti (103). Vokiečių mokslininkų atlikto tyrimo (2003), kurio metu buvo genotipuotos 138 šeimos, kuriose 302 pacientai sirgo sarkoidoze, ir 127 pacientai, nesergantys sarkoidoze (kartu tirti ir jų tėvai), duomenimis tarp sergančiųjų sarkoidoze taip pat nenustatyta nei vienos CARD15 geno mutacijos, būdingos Blau sindromui (104). Italų (2004) bei danų (2006) tyrimų duomenimis taip pat nerasta sąsajos tarp sarkoidozės ir CARD15 geno pakitimų. Tuo tarpu japonų mokslininkas Kanazawa N. Ir kt (2005, P.1196) atlikęs genetinę analizę paciento, kuriam diagnozuotas granuliomatozinis sindromas su tipiškais klinikiniais EOS požymiais, nustatytė vieną iš CARD15 geno mutacijų, būdingų Blau sindromui (105). 2005 m. japonų mokslininkai atlikę tyrimą, kurio metu ištirta 10 pacientų sergančių EOS, nustatė, kad devyni iš 10 tiriamųjų turėjo mutacijas CARD15 gene. Keturiems iš pacientų nustatyta Arg334Trp mutacija (būdinga ir Blau sindromui), keturiems – nustatytos naujos klaidingos prasmės mutacijos, vienas iš jų buvo heterozigotas pagal dvi skirtingas klaidingos prasmės mutacijas (105). Graikų mokslininkai (2006), ištyrę 100 sarkoidoze sergančių pacientų ir 150 kontrolinės grupės asmenų, nustatė sąsają tik tarp G908R (VNP12) polimorfizmo ir sarkoidozės. Įvertinus literatūros duomenis galima teigti, jog ryšys tarp CARD15 geno mutacijų ir sarkoidozės nenustatytas.
UŽL taip pat siejamos ir su kitais genetiniais sindromais: Turnerio, Hermansky-Pudlak, glikogeno atsargų sindromais, cistine fibroze, pachidermoperiostoze.
2.3.2. Uždegimines žarnų ligas lemiantys genetiniai veiksniai
Ieškant UŽL lemiančių genetinių veiksnių buvo atliekama viso genomo analizė bei genų-kandidatų tyrimai. Sistemiškai tiriant visą genomą buvo ieškoma sąsajos tarp vieno ir daugiau polimorfinių DNR markerių, kurie išsibarstę atsitiktinai įvairiuose chromosomų regionuose, ir ligų. Panaudojant šį analizės metodą buvo nustatytas pirmasis UŽL (o ypač KRL) išsivystymą sąlygojantis genetinis regionas – UŽL1, esantis 16 chromosomoje. Kadangi šiame regione yra keletas genų, atlikus detalesnes studijas buvo nustatytas pirmasis UŽL genetinis žymuo – NOD2. Taip pat buvo nustatyti ir kiti genetiniai lokusai išsidėstę 12 chromosomoje – UŽL2, 6 – UŽL3, 14 – UŽL4 ir kt. (2 lentelė) (106). Tuo tarpu atliekant genų-kandidatų tyrimus buvo ieškoma sąsajos tarp ligos ir konkretaus geno polimorfizmo. Dažniausiai buvo pasirenkami genai kandidatai, kurie koduoja imuninės sistemos ar uždegiminius procesus reguliuojančius veiksnius, molekules užtikrinančias gleivinės barjerines funkcijas bei genai, kurių sąsają su UŽL etiologija buvo nustatyta viso genomo analizės metu.
2 lentelė. UŽL sąsaja su genetiniais veiksniais Genetinis
lokusas Chromo-soma Liga Genas Fenotipas
UŽL1 16q12
Krono liga CARD15/NOD2 Ligos pasireiškimas
jauname amžiuje, lokalizacija plonajame žarnyne, striktūrizuo-janti ligos forma UŽL2 12q13 Nedeterminuotas kolitas ir Krono ligos terminalinis
ileitas
VDR, NRAMP2, STAT6 IR
MMP-18 nenurodyta
UŽL3 6p13 Krono liga ir opinis kolitas MHC ir TNF nenurodyta UŽL4 14q11
Krono liga TCRα/δ, leukotreino B4 receptorius, I klasės MHC, proteosomų regionas, susijęs su antigeno pristatymu
nenurodyta
UŽL5 5q Nedeterminuotas kolitas ir Krono ligos kolitas ir ileokolitas
Citokinų regionas (IL-3, IL-4, IL-5, IL-13; IRF-1; CSF-2)
Perianalinis pažeidimas ir ligos pasireiškimas jauname amžiuje
UŽL6 19p Krono liga ICAM-1 ir DDXL nenurodyta
UŽL7 1p Krono liga ir opinis kolitas Mucinas 3, EGFR ir HGF nenurodyta
Paaiškinimai. CARD = kaspazes aktyvuojantis ir sutelkiantis domenas; CSF-2 = kolonijų stimuliavimo veiksnio 2 izoforma; DDXL = mirties efektorių domeno helikazė; EGFR = epidermio augimo faktoriaus receptorius; HGF = hepatocitų augimo veiksnys; UŽL = uždegiminės žarnų ligos; ICAM-1 = viduląstelinės sąveikos molekulė-1; IL = interleukinas; IRF-1 = interferono kontrolės veiksnio 1 izoforma; MHC = pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas; MMP = matrikso metalo proteazė; NRAMP2 = makrofago baltymas 2, nulemiantis natūralų atsparumą; STAT = signalo perdavėjas bei transkripcijos aktyvintojas; TCR = T ląstelių receptorius; TNF = auglio nekrozės veiksnys; VDR = vitamino D receptorius.
2.4. CARD15 genas (angl. caspase recruitment domain)
2001 m. trys nepriklausomos mokslininkų grupės (Ogura, Hugot, Hampe), atlikusios viso genomo sankibos ištyrimą, nustatė ir patvirtino pirmąjį (UŽL1) su Krono liga susijusį geną (62, 64, 107). Šis genas pavadintas NOD2, vėliau Tarptautinis Nomenklatūros komitetas pakeitė geno pavadinimą į CARD15.
Klonavus NOD2/CARD15 geną buvo nustatyta, kad jis randasi 16q12 chromosomoje (64). Jo ilgis – 7.0–5.5 kb, susideda iš 12 egzonų. CARD15 genas priklauso apoptozės reguliatorių Apaf – 1/Ced4 superšeimai. Šis genas koduoja viduląstelinį baltymą NOD2, kuris dalyvauja atpažįstant bakterinės kilmės produktus ir aktyvuojant įgimtos imuninės sistemos komponentus (6 pav.).
6 pav. NOD bei TLR signalo perdavimo keliai, kuriuos aktyvuoja bakterinės kilmės
produktai (108)
Šį batymą, susidedantį iš 1040 aminorūgščių, sudaro trys svarbiausi domenai: du kaspazes sutelkiantys domenai (CARD), nukleotidą jungiantis oligomerizacijos domenas (NBD) ir dešimt leucino kartotinių sekų (LRR) (7 pav.). Didžiausi NOD2 kiekiai randami monocituose bei Paneto ląstelėse terminalinėje klubinės žarnos srityje. Bakterinių produktų atpažinimas vyksta per NOD2 bei TLR2 ar TLR6 receptorius (angl. Toll like receptor) (6 pav.). Prisijungus muramildipeptidui (MDP) prie NOD2 LRR regiono, vyksta NOD2 baltymo oligomerizacija, jungiasi RIP-2 kinazė. Ši, paveikdama IKK-γNEMO, aktyvuoja IKK kompleksą. Tuomet įvyksta IkpB fosforilinimas, ubikvitinimas ir degradacija. Viso šio proceso pasekoje aktyvuojasi NF-kappaB. NOD2, sąveikaudama su MAP kinazės signalo perdavimo kelio komponentais,
gali aktyvuoti AP-1 transkripcijos faktorius. TLR2 ir TLR6 kompleksai signalizuoja NF-kappaB aktyvaciją dviem keliais: 1) per sąveiką su TRAF-6 ir IKK kompleksą; 2) per MAP kinazę p38, JNK ir ERK. NF-kappaB ir MAPK signalinimo rezultatas – prouždegiminių citokinų indukcija makrofaguose ir kriptinų bei defensinų indukcija Paneto ląstelėse.
Manoma, kad dėl mutacijų, įvykusių NOD2 gene, Paneto ląstelėse pablogėja antimikrobinių peptidų išskyrimas, sutrinka bakterijų ląstelės sienelės komponentų „atpažinimas“, ir net į normalią organizmo mikroflorą reaguojama aktyvuojant NF–kappaB ekspresiją bei uždegiminių citokinų gamybą (109). Tikslūs NF – kappaB aktyvacijos mechanizmai iki šiol nėra pakankamai žinomi.
2.4.1. CARD15 geno polimorfizmas
Nustatyta, kad būtent CARD15 gene įvykusios trys taškinės – Arg702Trp(VNP8) ir Gly908Arg(VNP12) – dvi vieno nukleotido pakaitos, misens mutacijos, bei 3020insC (VNP13) – viena skaitymo rėmelio – mutacijos (7 pav.) lemia ne tik KRL išsivystymą, bet ir sunkesnę šios ligos eigą, ankstyvesnę ligos pradžią, greitą jos progresavimą bei komplikacijas.
7 pav. CARD15 geno mutacijos leucino srities domenuose (LRR)
Dėl missens mutacijų pakitus nukleotidui, pasikeičia ir kodonas. Jis ima koduoti jau kitos aminorūgšties įterpimą į polipeptidinę grandinę. Taip baltyme viena aminorūgštis pakeičiama kita aminorūgštimi. Ivykus VNP8 mutacijai, vietoj arginino pradedamas sintetinti triptofanas, esant VNP12 mutacijai – vietoj glicino sintetinamas argininas. Skaitymo rėmelis pasislenka todėl, kad, įvykus vieno ar kelių nukleotidų iškritai ar intarpui, pasikeičia kodonų skaitymo tvarka. VNP13 mutacijos metu įvykus „C“ nukleotido intarpui, skaitymo remelis pasislinko į priekį, tad susidarė naujas baigmės kodonas, todėl sutrumpėjo sintetinamo baltymo grandinė (mutuotas NOD2 baltymas vietoj 1040 aminorūgščių dėl įvykusios rėmelio skaitymo mutacijos susideda iš 1007 aminorūgščių).
1,5–3 kartus padidėja rizika susirgti KRL, jei žmogus nešioja vieną CARD15 geno mutaciją, rizika išauga nuo 10 iki 40 kartų, jeigu nešioja dvi šio geno mutacijas (110).
Remiantis literatūros šaltiniais, 10–30 proc. KRL sergančių pacientų yra heterozigotai pagal vieną iš trijų CARD15 geno mutacijų. 3–15 proc. KRL pacientų yra homozigotai (ta pati mutacija abiejose chromosomose) ar mišrūs heterozigotai (dvi skirtingos mutacijos abiejose chromosomose). Atinkamai 8–15 proc. ir 0–1 proc. sveiki kontrolinės grupės asmenys yra heterozigotai ir homozigotai, ir statistiškai nesiskiria nuo OK.
Nustatytas ryšys tarp NOD2/CARD15 geno ir Krono ligos klinikinės išraiškos. Hampe J. ir kt. (2002, P.815), atlikę vokiečių ir norvegų populiacijų UŽL pacientų genetinius tyrimus, nustatė ryšį tarp NOD2/CARD15 geno mutacijų ir KRL vystymosi klubinėje žarnoje ir dešinės pusės storosios žarnos srityje(111). Vermeire S. ir kt. (2002, P.80), ištyręs Quebeko provincijos populiaciją Kanadoje, taip pat nustatė tiesioginį ryšį tarp CARD15 geno mutacijų ir KRL vystymosi klubinėje žarnoje (112). Giachino D. ir kt. (2004, P.210), ištyręs italų populiaciją, nustatė, kad trys CARD15 mutacijos susiję tik su KRL ir jos striktūrizuojančia bei fistulizuojančia formomis (113).
2.5. Naviko nekrozės faktorius (angl. Tumor necrosis factor, TNF)
Daugelio infekcinių, autoimuninių, onkologinių susirgimų klinikinę eigą įtakoja tam tikras produkuojamų citokinų (pro – ir anti – uždegiminių) profilis. Pacientų, sergančių UŽL, padidėjusi citokinų koncentracija randama ne tik serume, bet ir žarnų gleivinėje (3 lentelė). Citokinų, atsakingų už generalizuotą uždegimą – IL-1 (pasižymi pirogeniniu poveikiu), IL-6, TNF-α – koncentracija randama padidėjusi abiejų ligų, OK ir KRL, metu. OK metu labai padidėja IL-5, atsakingo už Th2 atsaką, koncentracija, o IFN-gama, atsakingo už Th1 imuninį atsaką, padidėja nežymiai. Taip pat nustatyta, kad pacientų, sergančių OK, organizme padidėja IL-8 koncentracija lyginant su KRL pacientais ir kontrolinės grupės tiriamaisiais.
3 lentelė. Citokinų profilio palyginimas tarp opinio kolito ir Krono ligos Citokinas Opinis kolitas Krono liga
IL-1 Norma serume;
Padidėjusi koncentracija žarnų gleivinėje
Norma serume,
Padidėjusi koncentracija žarnų gleivinėje
IL-2 Norma serume ir žarnų gleivinėje Padidejusi koncentracija serume ir žarnų gleivinėje
IL-6 Norma serume;
Padidėjusi koncentracija žarnų gleivinėje
Padidejusi koncentracija serume
Padidėjusi koncentracija žarnų gleivinėje
IL-8 Serume neaptinkama.
Padidėjusi koncentracija žarnų gleivinėje
Serume neaptinkama;
Nėra duomenų apie IL – 8 koncenraciją žarnų gleivinėje
INF-γ Serume koncentracija nežinoma;
Normali koncentracija žarnų gleivinėje Serume koncentracija nežinoma; Didelė koncentracija žarnų gleivinėje TNF-α Serume ir žarnų gleivinėje koncentracijos aukštos Serume ir žarnų gleivinėje koncentracijos
Tyrimų su gyvūnais, kuriems eksperimento metu buvo sukeltas kolitas, rezultatai, aiškiai įrodo, jog uždegiminiame procese dalyvauja Th1 ir Th2. Eksperimentuose su pelėmis nustatyta, kad Th1 citokinų (IL-2, IFN-γ, TNF-β) atsakas sąlygoja ūmų transmuralų pažeidimą ir židininius pakitimus, o Th2 citokinų (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10) atsakas sąlygoja difuzinės atrofijos vystymąsį kriptose ir gleivinėje. Th1 atsakas labiau susijęs su KRL, o Th2 atsakas sąlygoja gleivinės pažeidimus OK metu.
Pastaruoju metu tyrinėjant UŽL lemiančius paveldimumo veiksnius ypač didelis dėmesys skiriamas genų, kurie ekspresuoja uždegimo procese dalyvaujančius citokinus, reguliacijos tyrimams. Vienas iš tokių genų yra auglio nekrozės faktoriaus (angl. Tumor necrosis factor, TNF) genas, priskiriamas TNF genų superšeimai. TNF genas randasi pagrindinio histologinio audinių suderinamumo komplekso (angl. Major Histocompatibility Complex, MHC) genetiniame regione. Tai labai polimorfiškas regionas, koduojantis imuninės sistemos reakcijose dalyvaujančius baltymus. MHC genų kompleksas randasi 6 žmogaus chromosomoje (17 pelės chromosomoje) ir yra sudarytas iš keturių regionų (8 pav.). I klasės HLA genai yra išsidėstę telomeriniame regiono gale, o II klasės genai – centromeriniame gale. Viduryje randami kiti du – III klasės bei IV klasės – MHC genetiniai regionai. TNF genas kartu su kitais dviem giminingais genais, koduojančiais limfotoksiną-α (LT-α) bei LT-β, randami IV klasės regione. Šis genas yra 3 kb ilgio, susideda iš 3 intronų ir 4 egzonų. Jis lokalizuojasi 6 chromosomos trumpajame petyje (6p.21.3–p.21.1), 250 kb atstumu nuo HLA-B geno, esančio centromeriniame MHC lokuso gale ir 350 kb atstumu nuo I klasės MHC genų regiono.
TNF genas koduoja prouždegiminius citokinus, kurie, esant žmogaus organizme pusiausvyrai tarp apoptozės ir prouždegiminių procesų, dalyvauja daugelyje svarbių biologinių procesų: reguliuoja ląstelių diferenciaciją, proliferaciją, apoptozę, lipidų metabolizmą, koaguliaciją (9 pav.).
TNF- α ekspresuoja daugelis organizmo ląstelių: makrofagai, CD4+, CD8+, T ląstelės, adipocitai, keratinocitai, žarnyno ląstelės, osteoblastai, putliosios ląstelės, pankreatinės beta ląstelės, astrocitai, neuronai, monocitai. Pirmą kartą TNF- α buvo nustatytas kaip vėžines ląsteles in vivo ir in vitro naikinantis veiksnys pelių ir triušių serume. Šio baltymo cDNR seka buvo izoliuota ir sekvenuota 1985 m. Nustatyta, kad neglikozilintas TNF- α baltymas yra sudarytas iš 233 aminorūgščių, jo molekulinė masė – 25,6 kDa.
9 pav. TNF veikimo mechanizmas ląstelėse (114)
Šis baltymas randamas dviejų formų: transmembraninės ir tirpios. Pastaroji forma susidaro metaloproteinazei integrinui TACE pašalinus neįprastai ilgą N-galo vedančiąją seką, sudarytą iš 76 aminorūgščių. Susidaro funkcionali 157 aminorūgščių ilgio, 17kD svorio TNF- α molekulė. Tiek transmembraninė, tiek ir tirpi baltymo forma ne uždegimo metu jungiasi prie dviejų receptorių – TNFR1 (žmogaus – p60, pelės – p55), TNFR2 (žmogaus – p80, pelės – p75) – ir sukelia intraląstelinio signalo perdavimą 3 ir 8 kaspazių ir MAPK kinazių kaskadai, kuri aktyvuoja NF-kB, o šis indukuoja ląstelių apoptozę arba nekrozę.
2.5.1. TNF geno polimorfizmas
Pastarųjų metų vienas iš svarbiausių mokslinių autoimuninių, uždegiminės kilmės ligų tyrimų objektų yra MHC lokuso genai. Tačiau dėl šio regiono polimorfiškumo jame esančių genų sąsajos su įvairių ligų etiologija tyrimai yra apsunkinami.
Nustačius, kad sutrikus TNF- α gamybai yra blokuojama daugybė fiziologinių bei imunologinių procesų ir išsivysto tokios ligos kaip cerebralinė maliarija, reumatinis artritas, išsėtinė sklerozė, vėžys, Krono liga ir kt., pradėti detalesni šį baltymą koduojančio geno tyrimai. Atlikta labai daug tyrimų, nagrinėjusių, ar genų polimorfizmas gali sąlygoti citokinų ekspresijos lygį ir tuo pačiu metu įtakoti bendrą imuninį atsaką. Skirtinga citokinų produkcija UŽL metu buvo siejama su genų VNP promotoriaus srityje, signalo seka bei genų intronais. Pavyzdžiui, TNF- α geno promotoriaus polimorfizmas –308A sąlygoja didesnę citokino TNF– α produkciją, kurios perteklius palaiko uždegiminį procesą organizme, ir T limfocitų proliferaciją. Neabejotina α reikšmė UŽL procese įrodyta, sukūrus antikūnus prieš α – infliksimabą, kuris sėkmingai šiuo metu taikomas, gydant Krono ligą (115–123).
Promotorius būtinas geno nurašymui. RNR polimerazė tiesiogiai ar per tarpininkus atpažįsta reguliacinės – akceptorinės dalies nukleotidų seką, vadinamą promotoriumi (lot. promotio – pasistūmėjimas į priekį), ir, sąveikaudama su juo, pradeda iRNR sintezę (10 pav.). Kadangi RNR sintezė vyksta 5’→ 3’ kryptimi, promotorius turi būti išsidėstęs ties struktūrinio geno (t.y. koduojančios DNR grandinės) 5’ galu. Įvairioms polimerazėms promotoriai yra skirtingi. Kadangi promotorius yra tam tikrų nukleotidų sekų rinkinys, skirtingi tokių sekų deriniai sustiprina arba susilpnina RNR polimerazės ir promotoriaus sąveiką, taigi ir geno nurašymo intensyvumą.Viena iš svarbiausių promotoriaus ypatybių – geno aktyvumas normalioje ir kraštutinėse situacijose. Geno promotoriaus mutacijos būna įvairios: nukleotidų pakaitos, iškritos, intarpai. Tačiau jos pakeičia ne aminorūgščių seką baltymo molekulėje, bet geno veiklos reguliavimą, pakeisdamas nurašymo (tuo pačiu ir baltymo sintezės) intensyvumą.
10 pav. Genų transkripcija
Su TNF−α promotoriaus polimorfizmu siejama sunkesnė KRL eiga vaikų amžiuje (124). Atlikus dvi atskiras kaukaziečių kohortines studijas ir ištyrus 587 UŽL sergančias šeimas, buvo nustatytas teigiamas ryšys tarp TNF geno –857C polimorfizmo ir UŽL (125). Japonijoje ištyrus 124 KRL sergančius pacientus, 106 OK ir 111 kontrolinės grupės pacientus, nustatyta, kad TNF geno promotoriaus mutacijos –308G/A ir –238G/A statistiškai reikšmingesnis ryšys su opiniu kolitu, o ne
su KRL ar kontroline grupe (126). Australijoje ištyrus 170 UŽL sergančiųjų šeimas (daugiau nei 600 asmenų) ir genotipavus keturis TNF- α geno promotoriaus polimorfizmus, nustatyta ryški sąsaja tarp –857C alelio ir UŽL(127). Pastaroji sąsaja buvo ryškiausia tose šeimose, kuriose taip pat buvo nustatytas NOD2/CARD15 geno rizikos alelis. Korėjos tyrimų duomenimis (ištirta 91 pacientas, sergantis OK, 63 pacientai – KRL ir 200 sveiki kontrolinės grupės asmenys), TNF-α geno promotoriaus –238A polimorfizmas labiau susietas su KRL perianaliniu pažeidimu(128). Remiantis Vengrijos (ištirta 74 KRL pacientai, 50 – OK, 138 – sveiki kontrolinės grupės asmenys) tyrimų duomenimis, nerasta ryšio tarp TNF- α geno promotoriaus –308A ir – 238A polimorfizmo ir UŽL, tačiau nustatyta, kad C reaktyvinio baltymo (CRB) koncentracija kraujyje buvo žymiai didesnė tiems pacientams, kurie buvo – 308A alelio nešiotojai (129). Kinijoje, ištyrus 131 pacientą, sergantį UŽL, nustatyta, kad TNF- α –308A genotipų ir alelių dažnis buvo didesnis tarp sergančiųjų OK nei tarp sergančiųjų Krono liga, tarp kontrolinės grupės ir KRL nerasta jokio skirtumo. Nenustatytas ryšys tarp TNF-α geno promotoriaus –308A polimorfizmo ir pacientų amžiaus, lyties, ligos aktyvumo, uždegimo vietos virškinamajame trakte. Korėjiečių populiacijoje nustatytas teigiamas ryšys tarp TNF-α geno promotoriaus –308A polomorfizmo ir teigiamų antineutrofilinių citoplazmos antikūnių (sutrump.ANCA) tarp UŽL sergančių pacientų lyginant su neigiama ANCA turinčiais UŽL pacientais. Tačiau daugelio atliktų tyrimų duomenys prieštaringi. Atlikus kohortinius ryšių ir genų sankibos tyrimus, kurių metu buvo tirti penkių genų (TNF- α, TGF-β, IL-10, IL-6, IFN-γ) polimorfizmai –1082 (G/A), –819 (T/C) bei –592 (A/C) IL-10 promotoriuje, –308 (G/A) TNF-α promotoriuje, kodonas 10(T/C) ir kodonas 25 (G/C) TGF-β signalo sekoje, +874 (T/A) IFN-γ pirmame introne ir –174 (C/G) IL-6 promotoriuje, nustatyta, kad šių genų polimorfizmas neįtakoja UŽL vystymosi (130–132). Ispanų (Madridas) tyrimų duomenys (tirta 470 UŽL sergančių pacientų: 242 OK pacientai ir 228 KRL pacientai) rodo, kad IL-10 geno –1082G alelio polimorfizmas buvo reikšmingai dažnesnis tarp KRL sergančių pacientų (133) Tiriant Airijos populiaciją buvo vertinamas genų IL-1 beta, IL-6, IL-10, TNF-α (–308A), ryšys su UŽL (ištirta 172 UŽL sergantys pacientai ir 389 sveiki kontrolinės grupės asmenys), tačiau jokio ryšio tarp šių genų polimorfizmo ir UŽL nerasta. Kanadiečiai taip pat vertino genų TNF- α, TGF-β (kodoną 10 T/C, kodoną 25 G/C), IL-10 (–1082G/A, –819T/C, –592A/C), IL-6 (–174C/G), IFN-γ introne 1 +874 (T/A) promotorių polimorfizmus ir jų ryšį su UŽL, tačiau taip pat nenustatytas ryšys (ištirta 193 UŽL ir 92 sveiki kontrolines grupės asmenys). Norvegų ir Didžiosios Britanijos mokslininkų atlikto tyrimo metu buvo vertinama, ar yra TNF-α geno-308 polimorfizmo ir IL-10 geno –627 polimorfizmo ryšys su pirminiu sklerozuojančiu cholangitu (134). Ištyrus 160 pacientų, sergančių PSCH, ir 145 kontrolinės grupės pacientus, nustatytas ryšys tarp TNF- α geno-308 polimorfizmo ir PSCH, tačiau nerasta jokio ryšio tarp IL-10 geno –627 polimorfizmo ir PSCH (134).
Nustatytas TNF-α –308 polimorfizmo ryšys ne tik su UŽL, bet ir daugeliu kitų ligų: ankilozuojančiu spondilitu, alkoholiniu steatohepatitu, celiakine liga, lėtiniu hepatitu B, lėtiniu aktyviu hepatitu C, lėtine limfocitine leukemija, širdies – kraujagyslių ligomis, herpetiforminiu dermatitu, ŽIV – encefalitu, I ir II tipo cukriniu diabetu, rezistentiškumu insulinui, leproze, išsėtine skleroze, epidemine nefropatija, nutukimu, suaugusiųjų periodontitu, pirminiu sklerozuojančiu cholangitu, reumatoidiniu artritu, sistemine raudonąja vilklige, sunkios eigos sepsiu, maliarija, bronchine astma, širdies ir inkstų transplanto atmetimu, storosios žarnos vėžiu, ne Hodžkino limfoma.
Kadangi TNF-α genas randasi greta MHC komplekso 6-oje chromosomoje (UŽL3), atlikti išsamūs genų sankibos ir ryšių analizės tyrimai, ieškant HLA I ir II klasės genų įtakos uždegiminių žarnų ligų etiopatogenezei (102, 135–143) (11 pav.).
Didžiojoje Britanijoje ištyrus pacientus, sergančius pirminiu sklerozuojančiu cholangitu, nustatyta teigiamas ryšys tarp šios ligos ir TNF- α geno promotoriaus –308A polimorfizmo bei A1 – B8 – DRB1*0301 – DQA1*0501 – DQB1*0201 genotipų (144). Ištyrus 53 estų populiacijos pacientus nustatyta, kad tarp OK pacientų su teigiama ANCA yra didesnis TNF-α geno promotoriaus –308A polimorfizmo ir HLA – DRB1*15 alelių dažnis, lyginant su kontroline grupe (145). Danų populiacijoje (ištirta 153 UŽL sergantys pacientai: 64 KRL ir 89 OK; 54 kontrolinės grupės asmenys) nerasta statistiškai reikšmingo skirtumo tarp TNF geno –308A haplotipų pasiskirstymo ir teigiamos pANCA bei neigiamos pANCA tarp sergančiųjų OK.
11 pav. Pagrindinis audinių suderinamumo kompleksas. Viršutinė juosta: genetinio regiono
Daugelio atliktų ryšių tyrimų metaanalizė nurodo teigiamą sąsają tarp OK ir DR2, DR9 ir DRB1*0103; neigiamas ryšys nustatytas tarp OK ir DR4 (146). Krono ligos atveju nustatytas teigiamas ryšys su DR7, DRB3+0301 ir DQ4, o neigiamas – su DR2 ir DR3. DRB1*0103 alelis 2 siejamas su sunkesne OK eiga ir didesniu uždegimo išplitimu bei su ekstraintestininių požymių pasireiškimu. HLA DR3 DQ2 haplotipas siejamas su išplitusiu OK. Nustatytas pirmo tipo periferinės artropatijos (jos metu pažeidžiami mažiau nei 5 sąnariai, uždegimas tęsiasi mažiau nei 5 savaites ir susijes su uždegiminės žarnų ligos paūmėjimu ir ekstraintestininių požymių pasireiskimu) ryšys su HLA B27, HLA B35 tipais, ir ryškiausia sąsaja – su HLA DR1*0103 haplotipu. Antro tipo artritas (pažeidžia 5 ar daugiau sąnarių, vidutinė ligos trukmė 3 metai, siejamas su uveitu, bet ne su mazgine eritema) siejamas su HLA B44. Keliose atliktose studijose, kuriose buvo tiriamas nedidelis Krono liga sergančių pacientų skaičius, nustatyta, kad DRB1*03 apsaugo nuo perianalinės fistulizuojančios ligos pasireiškimo formos, o HLA DR7 – retesne sąsaja su Krono ileitu nei su KRL kolitu.
2.6. Kiti genai, siejami su uždegiminėmis žarnų ligomis
Antrasis rastas genas, siejamas su mažesne UŽL rizika, yra DLG5 (angl. discs, large homolog 5 (Drosophila)), esantis 10q23 chromosomoje (147). DLG5 koduoja baltymą, atsakingą už epitelio vientisumo palaikymą. Kartojant tyrimus, patvirtinančius šio geno įtaką UŽL išsivystymui skirtingose populiacijose, gauti prieštaringi duomenys. Jungtinėse Amerikos Valstijose, atlikus atvejo – kontrolės bei šeiminės analizės tyrimus, nustatytas ryšys tarp UŽL ir DLG5 (148). Tuo tarpu vokiečių ir vengrų populiacijose tiriant DLG5 alelių ir genotipų dažnį, nerasta statistiškai reikšmingo skirtumo tarp sergančiųjų UŽL ir kontrolinės grupės asmenų (149). Kanados, Pietryčių Norvegijos, Škotijos populiacijose taip pat nerasta jokio ryšio tarp DLG5 geno ir UŽL (150, 151).
OCTN1 ir OCTN2 genai (angl. organic cations transporter genes) taip pat siejami su
UŽL. Šie genai, esantys 5q31-33 chromosomoje (UŽL5 lokusas), reguliuoja organinių katijonų transportą ląstelėse. Anglijoje, Škotijoje, Ispanijoje atlikti moksliniai tyrimai nustatytė teigiamą ryšį tarp šių genų ir UŽL (152–154). Tuo tarpu tiriant belgų, vokiečių, vengrų, norvegų populiacijas nerasta ryšio tarp OCTN1 ir OCTN2 genų ir UŽL (150, 155).
MDR-1 geno (angl.multidrug resistance gene), esancio 7q chromosomoje, ryšys su UŽL
pirmąkart nustatyta Didžiojoje Britanijoje(156, 157). Teigiamas šio geno ryšys su UŽL, ypač su OK, nustatyta dar keliose studijose (158–162). Fiziologinė MDR-1 geno koduojamo to paties pavadinimo baltymo funkcija išlieka neaiški. Viena iš hipotezių, jog MDR-1 baltymas pasižymi protekciniu poveikiu, t.y. apsaugo epitelio ląsteles nuo ksenobiotikų.
Nustatytas glaudus IL23R (angl. Interleukin – 23 receptor gene) geno, esančio 1p31 chromosomoje bei koduojančio prouždegiminio citokino interleukino 23 receptorių, ryšys su
Krono liga. Tai patvirtinta, atlikus pakartotinius nepriklausomus kohortinius didelės apimties genomo ryšio nustatymo tarp IL-23R ir UŽL tyrimus. Eksperimentiniuose modeliuose su pelėmis nustatyta, jog monokloniniai antikūnai prieš IL-23 receptoriaus p40 subvienetą blokuoja IL-23 ir IL-12 prouždegiminį aktyvumą. Šie rezultatai teikia daug vilčių, kuriant naujus vaistus Krono ligos gydymui (163).
2.7. Mityba ir uždegiminės žarnų ligos
Pastaraisiais metais vykdomi moksliniai tyrimai sukaupė daug naujų duomenų ne tik apie genetinių, bet ir aplinkos veiksnių įtaką šių ligų atsiradimui bei vystymuisi. Pastarųjų veiksnių įtaką UŽL etiopatogenezei rodo kintantis sergamumas, kasmet augantis pacientų skaičius, nevienodas ligų pasireiškimas bei pačių ligų ypatumai įvairiose šalyse. Šių susirgimų dažnis ypač pakito pastaraisiais dešimtmečiais pradėjus keistis, modernėti žmonių gyvenimo būdui, mitybai, higienai.
Epidemiologinių studijų rezultatai rodo, kad sergančiųjų UŽL skaičius ypač išaugo vakarų, industrinėse, išsivysčiusiose šalyse, kur visuomenė gyvena nuolat dirbtinai švarinamoje aplinkoje, (164), šaldytuvų eroje. Tuo tarpu besivystančiose, trečiojo pasaulio šalyse, kuriose yra labai didelis žmonių tankis, blogesnės sanitarinės sąlygos, UŽL pasireiškimas yra itin retas (165, 166).
Pastaruosius 20 metų vis didėja susidomėjimas ne tik genetinių veiksnių, bet ir vieno iš mažiausiai ištyrinėtų aplinkos veiksnių – mitybos įpročių ar pokyčių – įtaka UŽL patogenezei (167-169). Manyta, kad tam tikri maisto alergenai yra uždegiminio atsako trigeris. Vėliau imta teigti, kad mityba gali sąlygoti virškinamojo trakto mikrofloros pokyčius, kurie sutrikdo imuninio atsako pusiausvyrą ir sukelia uždegiminį atsaką (22, 170).
Europoje atlikta daug atvejo – kontrolės tyrimų, patvirtinančių, kad pacientai, sergantys Krono liga, lyginant su kontrolinės grupės tiriamaisiais, vartoja daugiau rafinuotų angliavandenių (82, 171–177). Vartojant blogai absorbuojamus distalinėje plonosios žarnos ir proksimalinėje storosios žarnos srityse trumpos grandinės karbohidratus ir poliolus (angl. Sutrump. FODMAPs – Fermentable Oligo, Di- ir Mono saccharides and Polyols) ir vykstant fermentacijai, didėja žarnyno gleivinės pralaidumas – predisponuojantis KRL išsivystymo faktorius (178). Kai kurios mokslinės studijos nurodo teigiamą ryšį tarp saldumynų vartojimo ir Krono ligos išsivystymo (179, 180). Pastebėta, jog sergamumas UŽL yra didesnis tose šalyse, kuriose keptų bulvių suvartojimas yra didžiausias. Manoma, kad bulvėse esantys glikoalkaloidai, veikdami į cholesterolį turinčias ląstelių membranas, didina žarnyno gleivinės pralaidumą ir epitelinio barjero pažeidimus ir neigiamai įtakoja UŽL eigą (181). Atvejo-kontrolės tyrimo, nagrinėjusio „modernaus gyvenimo“ sąlygotus mitybos ypatumus, metu
nustatytas teigiamas ryšys tarp nealkoholinių gėrimų, tokių kaip koka-kolos, kramtomosios gumos vartojimo ir Krono ligos išsivystymo (182). Pastaruosius metus didėjantis sergamumas Krono liga Japonijoje koreliuoja su didesniu riebalų vartojimu kasdienėje mityboje (168). Mėsos, ypač raudonos, didesnis bendro baltymų kiekio bei alkoholinių gėrimų vartojimas gali sąlygoti opinio kolito paūmėjimus (171, 183). Daugelis ligonių, sergančių UŽL, netoleruoja kai kurių maisto, ypač pieno, produktų (184, 185). Viena iš prielaidų, paaiškinančių UŽL skaičiaus didėjimą, yra tai, kad, kad gerėjant, „modernėjant“ mūsų gyvenimui, vystantis maisto pramonės tecnnologijoms keitėsi ir mūsų mityba: atsirado ne tik šaldytuvai, bet ir nauji maisto produktai, realizacijos terminams prailginti kuriama ir dedama naujų konservuojančių medžiagų. Po Lietuvos nepriklausomybes atgavimo, atsivėrus sienoms su kitomis užsienio valstybėmis, lietuviškas parduotuves užplūdo vakarietiški maisto produktai. Suintensyvejus gyvenimo ritmui ir darbo tempams vis mažiau laiko lieka pasigaminti maistą iš natūralių produktų namie, todėl daugiau suvartojama pusfabrikačių, tapo populiarios „greito“ maisto kavinukės, kasdien sulaukiančios gausybės lankytojų. Taip pat žmonės ėmė daugiau keliauti ir į kitas užsienio šalis. Jaunos mamos, pagimdžiusios vaikučius, stengiasi kuo labiau sutrumpinti natūralaus maitinimo periodą arba išvis jo atsisako. Atliktose mokslinėse studijose patvirtinta, kad natūralus kūdikių maitinimas motinos pienu gali apsaugoti nuo UŽL vystymosi (186). Dietos svarbą patvirtina tai, kad, esant Krono ligos paūmėjimui, greta įprastinio gydymo paskyrus elementinę dietą, 90 proc. pacientų pasiekiama simptominė ir objektyvi remisija (187–190).
Nuo 1994 m. Lietuvoje atliekamų tarptautinių sveikatą veikiančios gyvensenos tyrimų (FINBALT HEALTH MONITOR) duomenimis, pastarąjį dešimtmetį Lietuvos gyventojų mityba, kaip ir visoje Europoje, labai pakito. Maistui pradėtas vartoti augalinis aliejus, sumažėjo sviesto vartojimas, daugiau suvartojama šviežių vaisių ir daržovių (191–193).
3. TIRIAMOJI DALIS
Darbą sudaro trys atlikti tyrimai:I. Retrospektyvinė sergančiųjų UŽL fenotipinių požymių ir klinikinės eigos analizė. II. Sergančiųjų UŽL genų bei jų ryšio nustatymo su fenotipu tyrimas.
III. Mitybos ypatybių ištyrimas tarp sergančiųjų UŽL ir kontrolinės grupės asmenų.
3.1. Tirtasis kontingentas
I. Tirtasis kontingentasIšanalizuota 273 UŽL sirgusių pacientų (55 – KRL, 218 – OK), kurie gydėsi KMUK Gastroenterologijos klinikoje 1995 -2001 metais, ligos istorijos.
II. Tirtasis kontingentas
Sergantys uždegimine žarnų liga pacientai. Tyrime dalyvavo 123 pacientai, sergantys opiniu kolitu ir 57 pacientai, sergantys Krono liga, kurie nuo 2002 m. lapkričio 1 d. iki 2005 m. gruodžio 1 d. kreipėsi į Kauno medicinos universiteto klinikos gastroenterologus ar tuo metu gydėsi Gastroenterologijos klinikoje. Uždegiminės žarnų ligos diagnozė buvo patvirtinta, įvertinus klinikinių, laboratorinių, endoskopinių, histologinių bei rentgenologinių tyrimų duomenis.
Kontrolinės grupės tiriamieji. Tyrime dalyvavę 182 sveiki kontrolinės grupės tiriamieji,
kurie ambulatoriškai kreipėsi į šeimos gydytoją profilaktiniam patikrininui, nesiskyrė nuo sergančių UŽL pacientų pagal amžių ir lytį.
Visiems tyrime dalyvavusiems asmenims (UŽL sergantiems pacientams ir kontrolinės grupės asmenims) paimta po 2×10 ml veninio kraujo į EDTA apdorotus vakuuminius mėgintuvėlius.
Į demografinius, UŽL anamnezės klausimyno klausimus (pateikiama 2 priede) atsakė 101 pacientas, sergantis OK, 44 – KRL sergantys pacientai ir 178 kontrolinės grupės tiriamieji. Visi tiriamieji buvo įtraukti į tyrimą, gavus jų raštišką sutikimą.
Leidimą atlikti tyrimą suteikė Kauno regioninis biomedicininių tyrimų etikos komitetas (protokolo Nr. 84/2003).
III. Tirtasis kontingentas
Atliktas atvejo-kontrolės tyrimas mitybos ypatybėms palyginti tarp ligonių, sergančių uždegiminėmis žarnų ligomis, ir kontrolinės grupės tiriamųjų. Nuo 2002 m. lapkričio 1 d. iki 2005 m. gruodžio 1 d. apklausti pacientai, kurie kreipėsi į Kauno medicinos universiteto klinikos gastroenterologą ar buvo gydyti Gastroenterologijos klinikoje: 44 pacientai, sergantys Krono liga ir 101 pacientai, sergantys opiniu kolitu.
178 sveiki kontrolinės grupės asmenys apklausti įvairiuose Lietuvos miestuose bei įstaigose vykusių profilaktinių patikrinimų metu.
OK ir Krono liga sergatieji nesiskyrė nuo kontrolines grupės tiriamųjų pagal amžių ir lytį.
3.2. Tyrimo metodai
I. Atlikta retrospektyvi sergančiųjų UŽL fenotipinių požymių ir klinikinės eigos analizė, remiantis ligos istorijomis.
II. Atliktas sergančiųjų UŽL genų bei jų ryšio nustatymo su fenotipu tyrimas.
4 lentelė. Pirma dalis: medžiagos
Medžiaga Gamintojas/Tiekėjas, Šalis 2.2 ml 96 duobučių plokštelės ABgene, Epsom, UK
Taq® DNR polimerazė Qiagen, Hilden, Germany
AmpliTaq® Aukso DNR polimerazė Applied Biosystems; Darmstadt, Germany
Bacilolis® Bode Chemie, Hamburg, Germany
Etanolis Merk; Darmstadt, Germany
Reagentų rinkinys Invisorb Blood Giga Kit Invitek; Berlin, Germany
MicroAmp®optinė 96 duobučių reakcijos plokštelės Applied Biosystems, Darmstadt, Germany Microtitro 96 duobučių plokštelės Sarstedt; Nürnberg, Germany
Microtitro 96 duobučių plokštelės Costar Corning Incorporated; Cambridge, MA, USA 5 lentelė. Antra dalis: medžiagos
Medžiaga Gamintojas/Tiekėjas, Šalis
PicoGreen® Molecular Probes Europe BV; Leiden, The Netherlands
Pipetės (serologinės, sterilios su filtrais 5/10/25 ml) Sarstedt; Nümbrecht, Germany Pipečių antgaliai su filtru (10/200/1,000 µl) Sarstedt; Nürnberg, Germany
TaqMan® Universal PCR Master Mix Applied Biosystems; Darmstadt, Germany Mėgintuvėliai (0,5 / 1,5 / 2,0 ml) Eppendorf; Köln, Germany
Mėgintuvėliai (0,5 / 1,5 / 2,0 ml) Eppendorf; Köln, Germany Mėgintuvėliai, plokščias dugnas (60 ml) Sarstedt; Nümbrecht, Germany Mėgintuvėliai, sterilūs (15 ml) Sarstedt; Nümbrecht, Germany Mėgintuvėliai, sterilūs (50 ml) BD Biosciences; Heidelberg, Germany
6 lentelė. Aparatūra
Aparatūra Gamintojas/Tiekėjas, Šalis 10/100/300/1000 µl daugiakanalės pipetės Eppendorf; Hamburg, Germany
7900HT Sekos Detekcijos Sistema Applied Biosystems; Darmstadt, Germany ABI PRISM®7700 Sekos Detektorius Applied Biosystems; Darmstadt, Germany Biometra® T Gradientas Whatman Biometra GmbH; Göttingen, Germany Biometra® T1 Termocikleris Whatman Biometra GmbH; Göttingen, Germany GeneAmp®PCR sistema 9700 Applied Biosystems; Darmstadt, Germany Hydra™384 Robbins Scientific® Dunn Labortechnik GmbH; Asbah, Germany Hydra™96 Robbins Scientific® Dunn Labortechnik GmbH; Asbah, Germany Plokštelių sandarytojas (Platesealer ALPS-300) Abgene, Epsom, UK
TECAN Genesis RSP 150 Tecan Deutschland GmbH; Crailsheim, Germany TECAN GENESIS Workstation 150 Tecan Deutschland GmbH; Crailsheim, Germany TECAN GENESIS Workstation 200 Tecan Deutschland GmbH; Crailsheim, Germany TECAN Spektrafluorometras Plus Tecan Deutschland GmbH; Crailsheim, Germany Kratytuvas-GENIE 2® G-560E Scientific Industries, Inc., Bohemia, N.Y., USA
Vandens vonelė GFL 1086 Kendro; Hanau, Germany
Heraeus multicentrifūga 3 S - R Kendro; Hanau, Germany Heraues biocentrifūga fresco Kendro; Hanau, Germany Heraeus kaitros (džiovinimo) spinta Kendro; Hanau, Germany
DNR IŠSKYRIMO IR KONCENTRACIJOS NUSTATYMO PROTOKOLAS
Medžiagos:
• Genominės DNR išskyrimo rinkinys „FlexiGene DNR“ (QIAGEN, Vokietija), susidedantis iš: buferio FG1, buferio FG2/ QIAGEN proteazės;
• 100% izopropranololis, • 70% etanolis,
• Tris-EDTA buferis.
Darbo eiga:
1. Iš šaldiklio išimti kraujo mėgintuvėliai atšildomi 37°C temperatūroje vandens vonelėje; visi centrifugavimo etapai atliekami kambario temperatūroje.
2. Leukocitų ir eritrocitų lizės reakcijai į 50 ml mėgintuvėlį įpilama 25 ml buferio FG1 ir 10 ml kraujo. Ląstelių branduoliai ir mitochondrijos nusodinamos centrifuguojant 5 min. esant 2000 aps./min..
3. Viršutinis (vandeninis) sluoksnis pašalinamas. Gautos nuosėdos ištirpinamos užpilama 5 ml buferio FG2/QIAGEN proteazės švelniai pamaišant mėgintuvėlio turinį minipurtykle (Scientific Industries, Inc., Bohemia, N.Y., USA).
4. Mėgintuvėlis švelniai pavartomas (apie 3 kartus) rankose ir inkubuojamas 15 min. 65°C temperatūroje vandens vonelėje. Šio etapo metu taip pat pašalinamos tokios priemaišos, kaip baltymai.
