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RISULTATI E DISCUSSIONE
Gli oligodendrociti sono le cellule predisposte, a livello del SNC, alla produzione della mielina, componente principale della guaina che riveste gli assoni neuronali, garantendo un’efficiente trasmissione dell’impulso nervoso. Gli oligodendrociti sono cellule gliali differenziate che evolvono a partire dai propri precursori, OPC (Oligodendrocyte Precursor Cells), e vanno incontro ad un preciso programma di proliferazione, migrazione, differenziazione, al fine di produrre la guaina isolante degli assoni. Lo sviluppo degli oligodendrociti in vitro progredisce attraverso stadi distinti (nominati da 1 a 5), caratterizzati da una combinazione molto dinamica di fattori di trascrizione e specifici fenotipi antigenici.
Tra i numerosi fattori implicati nel processo di mielinizzazione ritroviamo il GPR17. Il GPR17 è un recettore accoppiato a proteine G (GPCR), prevalentemente di tipo inibitorio; si tratta di un recettore dualistico, che risponde a due famiglie distinte di ligandi: i nucleotidi uridinici (UDP, UDP-glucosio), e i cisteinil-leucotrieni (LTD4, LTC4,
LTE4), con affinità rispettivamente nell’ordine del micromolare e del nanomolare.
Durante la maturazione degli OPC, l’espressione del GPR17 segue un andamento spazio-temporale caratteristico: aumenta proporzionalmente nei primi stadi di differenziamento, raggiungendo un picco massimo di espressione nei pre-oligodendrociti (stadio 3), per poi diminuire fino a divenire nulla negli oligodendrociti maturi (stadio 5). Studi precedenti hanno dimostrato come la maturazione degli OPC sia fortemente influenzata dal GPR17: sia in vitro che in vivo, la stimolazione del GPR17 con agonisti promuove il differenziamento, ma la forzata espressione di tale recettore nella fase di pre-oligodendrocita blocca il completamento del processo di maturazione di tali cellule (Chen et al., 2009; Fumagalli et al., 2011).
Da qui, l’ipotesi che l’attivazione del recettore, attraverso il legame con ligandi endogeni, possa servire da innesco per il differenziamento degli OPC. Allo stesso tempo, una volta attivato questo processo, lo spegnimento del GPR17 sembra essere necessario per permettere la completa maturazione cellulare. Tale spegnimento potrebbe avvenire attraverso opportuni meccanismi di desensitizzazione (perdita di funzionalità), internalizzazione e down-regulation e questo risulta utile nel
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combattere il danno da demielinizzazione, tipico di alcune patologie come la sclerosi multipla.
La riduzione dell’attività recettoriale di un GPCR, ovvero la sua desensitizzazione, si verifica in seguito ad esposizione prolungata ad un agonista. Il meccanismo prevede l’intervento di GRK, che inducono la fosforilazione di alcuni residui amminoacidici, in particolare delle proteine treonina e serina, portando ad un aumento di affinità recettoriale per la proteina citoplasmatica β-arrestina. La β-arrestina promuove il disaccoppiamento del recettore dalla proteina G e la sua internalizzazione in endosomi. A questo punto il destino recettoriale può essere diverso, o viene degradato da parte di enzimi lisosomiali, oppure riciclato su membrana in uno stato funzionalmente attivo.
L’obiettivo del presente lavoro è stato quello di andare a comprendere i meccanismi di regolazione del recettore GPR17 durante la maturazione degli OPC, ed in particolare il ruolo di specifiche GRK in tale processo. L’attenzione è stata rivolta verso due isoforme di GRK: la GRK2 e la GRK5, le quali sono coinvolte nella desensitizzazione dei GPCR e in diverse patologie infiammatorie del SNC.
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3.1 ANDAMENTO DI ESPRESSIONE DELLA GRK2 E GRK5
DURANTE IL DIFFERENZIAMENTO DEGLI OPC
Come primo step siamo andati a valutare l’andamento dell’espressione delle due isoforme, 2 e 5, delle GRK, in parallelo con quella del GPR17, durante la maturazione degli OPC. A tal fine, gli OPC sono stati isolati, e differenziati a vari giorni (0, 3, 6 e 9 giorni, corrispondenti ai diversi stadi di maturazione in vitro). Dopo estrazione dell’mRNA e retrotrascrizione a cDNA, è stata eseguita un’analisi Real-Time PCR, utilizzando primer specifici per le GRK e per il GPR17 di ratto; la GAPDH (gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) è il gene house keeping.
I risultati mostrati (Fig.1) hanno confermato l’andamento del trascritto di GPR17 durante il differenziamento degli OPC (Fumagalli et al., 2011). L’espressione del recettore cresce e raggiunge un picco massimo al sesto giorno (stadio 3) per poi diminuire divenendo progressivamente nulla. In parallelo, per confermare la progressione del differenziamento degli OPC, è stato valutato anche il trascritto di MBP (Myelin Basic Protein), marker degli oligodendrociti maturi. Come aspettato, l’espressione di MPB aumenta progressivamente durante il differenziamento, raggiungendo un picco al nono giorno in vitro, confermando la fisiologica maturazione delle nostre cellule in coltura.
Per quanto riguarda GRK2 e GRK5, dai risultati è emerso che entrambe le chinasi presentano un livello basale, negli OPC non differenziati, più alto del GPR17, ma la loro espressione ha un evoluzione molto simile a quella del recettore, raggiungendo un massimo nei pre-oligodendrociti (stadio 3), per poi diminuire negli oligodendrociti maturi (stadio 5).
In parallelo abbiamo anche valutato i livelli di espressione della proteina GRK2 ai vari stadi di differenziamento mediante tecnica Western blot (Fig.2).
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La figura 2A mostra un’immagine rappresentativa di analisi Western blot relativo alla marcatura di GRK2, rispetto ad un controllo interno, la proteina housekeeping α-tubulina. L’anticorpo anti-GRK2 riconosce una specifica banda, a circa 80 KDa, che corrisponde alla GRK2 di ratto. Dall’analisi densitometrica delle bande immuno -reattive (Fig. 2B) si evidenzia già un livello elevato di espressione della proteina al secondo giorno di differenziamento; nonostante una riduzione al quarto giorno, si raggiunge un picco al sesto e in seguito si assiste ad una diminuzione di espressione al progredire della maturazione.
2 gg
4 gg
6 gg
8 gg
10 gg
12 gg
Figura 2A. Immagine rappresentativa di Western blot relativo all’espressione della GRK2 a diversi
giorni di differenziamento degli OPC, controllo costituito da α-tubulina.
Figura 1: Andamento del trascritto di GPR17, MBP, GRK2, GRK5. La specificità dell’analisi PCR deriva
dall’uso della curva di Melting e dall’elettroforesi su gel; i dati sono stati analizzati mediante il metodo della curva standard. I livelli di mRNA per ogni esempio trascritto sono stati normalizzati rispetto a quelli di GAPDH (100%) e vengono espressi come media±SEM.
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3.2 FOSFORILAZIONE DEL RECETTORE GPR17
Abbiamo quindi indagato se, a seguito all’esposizione del GPR17 ad elevate concentrazione di agonista, vi fosse fosforilazione del recettore, in particolar modo su residui amminoacidici tipicamente fosforilati dalle GRK quali la serina e treonina. Gli OPC sono stati piastrati e fatti differenziare fino allo stadio 3, quindi sono stati trattati con UDP-glucosio 5 µM o con LTD4 50 nM per 5 minuti. Terminato il
trattamento, il recettore GPR17 è stato isolato tramite immunoprecipitazione; sugli immunoprecipitati è stata quindi eseguita un’analisi Western blot utilizzando anticorpi specifici per i residui di serina o treonina fosforilati.
La figura 3A mostra un’immagine rappresentativa dell’analisi Western blot. L’analisi densitometrica delle bande immuno-reattive (Fig. 3B) dimostra che, in seguito a stimolazione con UDP-glucosio o LTD4, il GPR17 viene fosforilato in maniera significativa su residui di treonina (UDP-glucosio: 156.7±4.022%; LTD4 212.2±3.818%) e di serina (198.467±3.971% per UDP-glucosio; 195.1±3.208% per LTD4). La fosforilazione recettoriale avviene in misura paragonabile per le due classi
di agonisti.
Figura 2B.Quantizzazione dei livelli proteici della chinasi GRK2 a vari giorni di differenziamento degli
OPC. Al fine di garantire la presenza di un adeguato contenuto proteico i valori sono stati normalizzati
sul contenuto proteico di α-tubulina, utilizzata come controllo, rapportando il valore del picco massimo a 100.
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3.3 ASSOCIAZIONE DEL RECETTORE GPR17 ALLE GRK
Per indagare il coinvolgimento delle singole GRK (GRK2 e GRK5) nel processo di fosforilazione, abbiamo valutato l’associazione tra il GPR17 e le due chinasi.
Gli OPC in coltura sono stati differenziati fino al terzo stadio, quindi esposti a trattamento con UDP-glucosio 5 µM o con LTD4 50 nM per 5 minuti; la figura 4A
mostra un’immagine rappresentativa dell’analisi Western blot. L’analisi densitometrica delle bande immuno-reattive (Fig. 4B) dimostra che a seguito della stimolazione con UDP-glucosio o LTD4, il GPR17 si associa fisicamente ad entrambe le GRK. L’analisi densitometrica ha però evidenziato delle differenze a seconda della classe di agonista usato. In particolare: la stimolazione con UDP-glucosio porta ad
Figura 3B. Analisi densitometrica dei livelli di fosforilazione dei residui amminoacidici serina e
treonina del recettore GPR17. I dati ottenuti sono espressi come % rispetto al controllo (100%) e rappresentano la media±SEM di tre diversi esperimenti.
Figura 3A. Immagine rappresentativa di
Western blot, che mostra la fosforilazione sui residui di serina e treonina del GPR17 immunoprecipitato da OPC al terzo stadio di maturazione, tramite l’utilizzo di anticorpi rivolti verso i residui di serina e treonina.
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associazione preferenziale con la GRK5 (5.14±0.36 n° volte rispetto al basale) rispetto alla GRK2 (3.935±0.36 n° volte rispetto al basale). Al contrario, la stimolazione con LTD4 comporta l’associazione recettoriale con entrambe le GRK, anche se in misura
maggiore con la GRK2 (GRK2: 8.37±0.43 n° volte rispetto al basale; GRK5: 2.82±0.24 n° volte rispetto al basale).
Figura 4A.Immagine rappresentativa
di Western blot, che dimostra l’associazione tra GPR17 e GRK2/5 su immunoprecipitati allo stadio 3 di maturazione.
80 KDa
65 KDa
Figura 4B. Analisi densitometrica dell’associazione tra GPR17 e GRK2/5. I dati ottenuti sono espressi
rispetto al controllo (settato a 1) e rappresentano la media ± SEM di tre diversi esperimenti.
Basal UD P-glu cose LTD4 Basal UD P-glu cose LTD4 0 2 4 6 8 10 * ** * *** GRK2 GRK5 A ss oc iaz io n eG R K -G P R 1 7 (n u m d i vo lt e r is p et to al b as a le )
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3.4 VALUTAZIONE DELLA DESENSITIZZAZIONE DEL
RECETTORE GPR17 A VARI STADI DI MATURAZIONE
CELLULARE
Per valutare le cinetiche di desensitizzazione del GPR17, abbiamo monitorato la funzionalità del recettore dopo esposizione prolungata ai suoi agonisti utilizzando un saggio di valutazione della produzione di cAMP. Visto che il GPR17 è accoppiato ad una proteina Gi, in caso di sua normale funzionalità i livelli di cAMP diminuiscono in seguito a stimolo con agonista, nel nostro caso UDP-glucosio o LTD4. Quando invece si
ha diminuzione della funzionalità recettoriale, la capacità di inibire la produzione di cAMP risulta ridotta.
La desensitizzazione del recettore è stata monitorata:
allo stadio 3, dove l’espressione del GPR17 è massima;
allo stadio 4, dove si presenza un decremento dei livelli recettoriali.
3.4.1 DESENSITIZZAZIONE DEL GPR17 ALLO STADIO DI
PRE-OLIGODENDROCITI
Al terzo stadio di maturazione, gli OPC sono stati trattati con elevate co ncentrazioni di agonista (UDP-glucosio 5 µM o LTD4 50 nM) per diversi tempi: 15, 30, 60, 90, 120
minuti. Terminato questo pre-trattamento, le cellule sono state stimolate con UDP-glucosio 500 nM e LTD4 5 nM, in presenza e forskolina (FK) 10µM, in modo da
mettere in risalto l’inibizione della produzione di cAMP da parte di un agonista recettoriale.
I risultati ottenuti hanno mostrato che entrambi gli agonisti promuovo una desensitizzazione omologa dei propri siti recettoriali, con una cinetica di tipo tempo -dipendente. Si osserva, infatti, una progressiva diminuzione della risposta del recettore, con significatività a partire da 60 minuti di pre-trattamento per UDP-glucosio e 30 minuti per LTD4. La cinetica appare quindi più veloce quando indotta
dall’agonista leucotrienico (Fig.5A/B).
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3.4.2 DESENSITIZZAZIONE DEL GPR17 NEGLI OLIGODENDROCITI
IMMATURI
La valutazione della desensitizzazione del GPR17 è stata ripetuta anche allo stadio 4 di differenziazione (oligodendrociti immaturi). I risultati hanno innanzitutto evidenziato una minore capacità di entrambi gli agonisti ad inibire la produzione di cAMP, mediato da FK. Ciò potrebbe essere giustificato dalla notevole diminuzione dell’espressione del GPR17 a questo stadio di maturazione degli OPC.
Figura 5A/5B. Valutazione della
desensitizzazione del GPR17 indotta da UDP-glucosio (A) o LTD4 (B) allo stadio 3 del differenziamento cellulare; i dati risultano espressi in percentuale rispetto ai livelli di cAMP stimolati da FK, settata 100% e riportati come media±SEM di quattro esperimenti indipendenti. La significatività statistica è stata determinata con ANOVA e Bonferroni post-test: *P<0.05, ***P<0.001 vs 10 µM FK; ##P<0.01, ###P<0.001 vs 500 nM UDP-glucosio o 5 nM LTD4. .
A
B
FK 10µ M 5' 15' 30' 60' 90' 120' 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Pre-trattamento 5 µM UDP-glucose * * vs FK # vs UDP-glucosio 500 nM 500 nM UDP-glucosio *** *** *** *** ## ### ### c A M P /w e ll vs F K 1 0µ M (r if e r it o a l 1 0 0 % ) FK 10µ M 5' 15' 30' 60' 90' 120' 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 * vs FK # vs LTD4 *** *** *** ### ### ### Pre-trattamento 50 nM LTD4 5 nM LTD4 * ## cA M P /w el l vs F K 1 0µ M (r if er it o a l 1 0 0 % )58
Inoltre, i risultati ottenuti dagli esperimenti di desensitizzazione hanno mostrato una cinetica differente rispetto a quella osservata nello stadio 3: il fenomeno di desensitizzazione negli oligodendrociti immaturi appare più lenta, e appena significativa solo dopo due ore di pre-trattamento con UDP-glucosio (62.08% vs FK) o LTD4 (67.05% vs FK) (Fig.6A/B).
Questi risultati sono in linea con i livelli delle GRK a questo stadio di differenziamento degli OPC: la bassa espressione delle GRK comporta infatti una più lenta e meno marcata perdita di funzionalità di un GPCR, e quindi anche del GPR17.
A
Figura 6 A/B. Valutazione della
desensitizzazione del GPR17 allo stadio 4 di maturazione degli OPC indotta da UDP-glucosio (A) o LTD4 (B). I dati risultano espressi in percentuale rispetto ai livelli di cAMP stimolati da FK, settata a 100% e riportati come media±SEM di quattro esperimenti indipendenti. La significatività statistica è stata determinata con ANOVA e Bonferroni post-test: *P<0.05, ***P<0.001 vs 10 µM FK; ##P<0.01, ###P<0.001 vs 500 nM UDP-glucosio o 5 nM LTD4.
B
FK 10µ M 5' 15' 30' 60' 90' 120' 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Pre-trattamento 5 µM UDP-glucosio 500 nM UDP-glucosio ** *** ** ** *** *** ** # cA M P /w e ll vs F K 1 0µ M (r if e r it o a l 1 0 0 % ) FK 10µ M 5' 15' 30' 60' 90' 120' 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Pre-trattamento 50 nM LTD4 5 nM LTD4 *** *** ** ** *** *** # cA M P /w el l vs F K 1 0µ M (r if e r it o a l 1 0 0 % )59
3.5 VALUTAZIONE DEL COINVOLGIMENTO DELLA GRK2
NELLA DESENSITIZZAZIONE DEL RECETTORE GPR17
Infine, per valutare il coinvolgimento delle singole chinasi durante il fenomeno di desensitizzazione, abbiamo monitorato nuovamente la risposta funzionale del recettore GPR17, allo stadio 3 di maturazione degli OPC, ma in aggiunta ad un inibitore specifico che provoca il blocco farmacologico della chinasi GRK2, l’inibitore KRX29.
Allo stadio 3 di maturazione gli OPC vengono trattati con elevate concentrazioni di agonista (UDP-g 5 µM o LTD4 50 nM) per diversi tempi: 15, 30, 60, 90, 120 minuti.
Terminato il pre-trattamento abbiamo proceduto con una seconda incubazione con UDP-glucosio 500 nM e LTD4 5 nM in presenza di forskolina (FK) 10µM.
In cellule di controllo (barre bianche), la risposta recettoriale agli agonisti diminuisce dopo pre-trattamento con quest’ultimi, in maniera significativa a partire da 30-60 minuti, come mostrato negli esperimenti precedenti. In cellule trattate con l’inibitore GRK2 (barre nere), invece, la desensitizzazione del GPR17 indotta dall’agonista leucotrienico risulta bloccata: la diminuzione della produzione di cAMP è significativamente diversa in cellule trattate con inibitore GRK2 (rispetto a quelle di controllo) particolarmente dopo 90-120 minuti di pre-trattamento quando cioè negli OPC di controllo è maggiormente evidente il fenomeno della desensitizzazione
(Fig.7A/B). Non si mostra, invece, alcun effetto dopo blocco della GRK2 in caso dell’UDP-glucosio: il ligando purinergico induce desensitizzazione recettoriale in maniera comparabile agli OPC con GRK2 funzionale.
Tali dati suggeriscono un coinvolgimento della GRK2 nella desensitizzazione del sito leucotrienico, ma non in quello purinergico.
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Sono, ad oggi, in corso studi che mirano a comprendere il ruolo della GRK5 nel fenomeno di desensitizzazione del recettore GPR17.
Figura 7A/B. Valutazione della desensitizzazione del GPR17 in OPC al terzo stadio di differenziamento
in presenza di inibitore GRK2, KRX29, indotta da UDP-glucosio (A) o LTD4 (B).I dati risultano espressi in percentuale rispetto ai livelli di cAMP stimolati da FK, settata al 100%, e riportati secondo media±SEM di quattro esperimenti indipendenti. La significatività statistica è stata determinata con ANOVA e Bonferroni post-test: *P<0.05, ***P<0.001 vs 10 µM FK; ##P<0.01, ###P<0.001 vs 500 nM UDP-glucosio o 5 nM LTD4. FK 0 25 50 75 100 Pre-trattamento 5 µM UDP-glucosio *** *** * ** *** 5 15 30 60 90 120 min controllo inibitore GRK2 *** *** *** *** *** 500 nM UDP-glucosio cA M P /w el l ( % v s FK ) FK 0 25 50 75 100 Pre-trattamento 50 nM LTD4 inibitore GRK2 controllo * *** *** 5 15 30 60 90 120 min 5 nM LTD4 ### # ** cA M P /w el l ( % v s FK )
B
A
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CONCLUSIONI
Valutando i risultati ottenuti si può dedurre che:
1. In precursori degli oligodendrociti, il recettore GPR17, in seguito a stimolo con
gli agonisti UDP-glucosio o LTD4, va incontro a fosforilazione, sui i residui
amminoacidici di serina e treonina;
2. Dopo stimolo con i propri agonisti, UDP-glucosio o LTD4, si assiste ad una
associazione fisica tra le GRK e il recettore: GRK5 si associa con il GPR17 preferenzialmente quando questo è stimolato da UDP-glucosio; al contrario in seguito alla stimolazione con LTD4, l’associazione del recettore avviene con
entrambe le GRK, anche se in misura preferenziale con la GRK2.
3. Entrambi gli agonisti inducono desensitizzazione omologa del recettore.
Questo processo avviene con una cinetica tempo-dipendente, quando l’espressione del recettore è massima, nei pre-oligodendrociti (stadio 3). Negli oligodendrociti immaturi invece, la desensitizzazione omologa+ avviene con una cinetica più lenta e appare significativa solo dopo due ore di pre-trattamento, in linea con più bassi livelli di GRK a questo stadio di maturazione degli OPC.
4. Per quanto riguarda il sito leucotrienico, il fenomeno di desensitizzazione
sembra coinvolgere principalmente la GRK2: infatti LTD4 media
desensitizzazione solo in presenza di GRK2 funzionalmente attiva. Dati preliminari suggeriscono invece che il ligando purinergico induca desensitizzazione recettoriale attraverso la GRK5.
Tali risultati dimostrano che lo stesso recettore, attivato da classi di ligandi chimicamente diversi tra loro, può seguire vie intracellulari diverse.
I dati risultano utili nella comprensione della regolazione del GPR17 durante la mielinizzazione degli OPC.
