Mast cell count in feline, bitch uterus and ovary

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS VETERINARIJOS AKADEMIJA

Veterinarijos fakultetas

Karolis Rožaitis

Putliųjų ląstelių kiekis kačių, kalių gimdoje bei kiaušidėse

Mast cell count in feline, bitch uterus and ovary

Veterinarinės medicinos vientisųjų studijų

Darbo vadovas: doc. dr. Nomeda Juodžiukynienė

2 DARBAS ATLIKTAS VETERINARINĖS PATOBIOLOGIJOS KATEDROJE

PATVIRTINIMAS APIE ATLIKTO DARBO SAVARANKIŠKUMĄ Patvirtinu, kad įteikiamas magistro baigiamasis darbas „Putliųjų ląstelių kiekis kačių, kalių gimdoje bei kiaušidėse“.

1. Yra atliktas mano paties (pačios).

2. Nebuvo naudotas kitame universitete Lietuvoje ir užsienyje.

3. Nenaudojau šaltinių, kurie nėra nurodyti darbe, ir pateikiu visą naudotos literatūros sąrašą.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

PATVIRTINIMAS APIE ATSAKOMYBĘ UŽ LIETUVIŲ KALBOS TAISYKLINGUMĄ ATLIKTAME DARBE

Patvirtinu lietuvių kalbos taisyklingumą atliktame darbe.

(data) (autoriaus vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMOJO DARBO VADOVO IŠVADA DĖL DARBO GYNIMO

(data) (darbo vadovo vardas, pavardė) (parašas)

MAGISTRO BAIGIAMASIS DARBAS APROBUOTAS KATEDROJE (KLINIKOJE)

(aprobacijos data) (katedros (klinikos) vedėjo (-os) vardas, pavardė)

(parašas)

Magistro baigiamojo darbo recenzentai 1)

2)

(vardas, pavardė) (parašai)

Magistro baigiamųjų darbų gynimo komisijos įvertinimas:

3

TURINYS

1.1 Patelių lytinės sistemos anatomija ... 8

1.1.1 Patelių kiaušidžių (ovaries) anatomija, histologija... 8

1.1.2 Gimda (uterus) ... 12

1.2 Lytinis ciklas ... 13

1.2.1 Kačių lytinio ciklo ypatumai. ... 13

1.2.2 Kalių lytinio ciklo ypatumai ... 14

1.3 Morfologiniai, histologiniai kiaušidžių bei gimdos pokyčiai lytinio ciklo metu ... 15

1.3.1. Kiaušidžių morfologiniai ir histologiniai pokyčiai lytinio ciklo metu. ... 15

1.3.2 Gimdos morfologiniai, histologiniai pokyčiai lytinio ciklo metu. ... 15

1.4 Putiosios ląstelės, jų skirstymas bei gamyba kaulų čiulpuose ... 16

1.4.1. Putliųjų ląstelių reikšmė ... 17

1.4.2. Putliųjų ląstelių išskiriami mediatoriai. ... 18

1.4.3. Putliųjų ląstelių funkcijos fiziologiniuose bei patologiniuose procesuose ... 19

1.5. Putliųjų ląstelių reikšmė kiaušidėse bei gimdoje ... 20

1.5.1. Putliųjų ląstelių funkcijos ir pasiskirstymas kiaušidėse. ... 20

1.5.2. Putliųjų ląstelių funkcijos bei pasiskirstymas gimdoje ... 21

1.5.3. Putliųjų ląstelių vaidmuo kiaušidžių bei gimdos patologiniuose procesuose... 22

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA ... 24

2.1 Histopatologinis tyrimas ... 24

2.1.1 Mėginių paruošimas bei dažymas hemotoksilino ir eozino dažais... 24

2.1.2 Histologinių preparatų dažymas Gimzos metodu ... 25

2.1.3 Paruoštų histologinių mėginių tyrimas ... 26

2.2 Statistinė analizė ... 26

3. TYRIMO REZULTATAI ... 27

4. REZULTATŲ APTARIMAS ... 35

IŠVADOS ... 37

4

SANTRAUKA

Putliųjų ląstelių kiekis kačių, kalių gimdoje bei kiaušidėse Karolis Rožaitis

Magistro baigiamasis darbas

Putliosios ląstelės – tai multifunkcinės ląstelės dalyvaujančios fiziologiniuose bei pataloginiuose procesuose. Šio darbo tikslas: ištirti kačių, kalių kiaušidėse bei gimdoje randamų putliųjų ląstelių skaičių bei jo kitimą priklausomai nuo metų bei lytinio ciklo fazės.

Uždaviniai:

1. Įvertinti putliųjų ląstelių skaičių kačių, kalių kiaušidėse bei gimdoje: i) Iki vienerių metų (<1m.).

ii) Virš vienerių metų (>1m.).

2. Įvertinti putliųjų ląstelių skaičių kačių, kalių kiaušidėse bei gimdoje: i) Priešrujo lytinio ciklo fazėje.

ii) Porujo lytinio ciklo fazėje

Tyrimui mėginiai buvo renkami iš įvairaus amžiaus, veislės kačių, kalių rutinininių ovariohisterektomijos metu, laikantis gyvūnų gerovės bei veterinarijos reikalavimų. Visi mėginiai buvo surinki veterinarijos klinikoje ,,X”. Histologinio tyrimu metu mėginiai buvo paruošti ir nudažyti hematoksilinu ir eozinu įvertinant kiaušides bei gimdą ir suskirstant tiriamuosius pagal lytinio ciklo fazes. Vėliau mėginiai dažyti Giemza dažais, norint išryškinti putliąsias ląsteles skaičiavimams.

Tyrimo rezultatai: kačių grupėje iki vienerių metų (<1m.) kiaušidėse putliųjų ląstelių kiekis

buvo 1,88±2,45, o gimdoje 1,38±1,47. Kačių grupėje virš vienerių metų (>1m.) šių ląstelių

vidutiškai kiaušidėse buvo 6,68±3,74, o gimdoje 4,76±2,27. Kalių grupėje iki vienerių metų (<1m.) buvo stebimas toks pats tendencingumas, kuomet buvo fiksuojami mažesni kiekiai putliųjų ląstelių kiaušidėje vidutiniškai 0,7±0,57, o gimdoje 1,25±0,07, palyginus su grupe virš vienerių metų, kur nustatyta, jog šių ląstelių buvo daugiau kiaušidėse 6,78±0,94 bei gimdoje 6,4±2,6. Kačių grupėje esančioje priešrujyje kiaušidėse buvo fiksuojama vidutiniškai 2,77±2,08 putliosios ląstelės. Gimdoje - 2,14±1,49. Kačių grupeje, esančioje porujyje, putliųjų ląstelių kiekis kiaušidėse buvo 3,8 karto didesnis - 10,75±0,78, o gimdoje 3,3 kartus daugiau - vidutiniškai 7,15±0,5. Kalių grupėje esančioje priešrujyje putliųjų ląstelių skaičius kiaušidėse vidutiniškai buvo 0,7±0,57, o gimdoje 1,25 (±0,07). Porujo grupėje ląstelių buvo nustatyta 9,6 karto daugiau kiaušidėje - 6,78±0,94 bei 5,1 karto daugiau gimdoje - 6,4±2,6. Nustatyta, jog kačių, kalių grupėse virš vienerių metų bei porujyje putliųjų ląstelių kiekis yra didesnis (p>0,05), palyginus su grupėmis iki vienerių metų bei priešrujo.

5

SUMMARY

Mast cell count in feline, bitch uterus and ovary Karolis Rožaitis

Master‘s Thesis

Mast cells are multifunctional cells involved in physiological and pathological processes. The aim of this study is to investigate the mast cell count in feline and bitch uterus and their count changes dependint on the age and oestrus cycle phase.

Tasks:

1. To estimate the number of mast cells in felines and bitches ovary and uterus: i) Up to one year (<1 m).

ii) Over one year (> 1m.).

2. To estimate the number of mast cells in felines and bitches ovary and uterus: i) In proestrus

ii) In diestrus

For this study samples were collected from different age, breed feline and bitches during ovariohysterectomy, in accordance with animal welfare and veterinary requirements. All samples were collected at the Veterinary Clinic X. During the histological examination, samples were prepared and stained with hematoxylin and eozine to examine the ovaries and uterus, and divide the subjects according to the oestrus cycle phase. Subsequently, samples were painted with Giemza dyes to highlight mast cells.

Results of the study: in the feline group up to one year (<1 m.) mast cell count was 1.88± 2.45 and in the uterus 1.38±1.47. In the feline group over one year (> 1m.) there were three times more of these cells in the ovaries 6.68± 3.74, and in the uterus 4.76±2.27. In the bitch group up to one year (<1 m.), the same tendency was observed with less mast cells in ovaries averaging 0.7±0.57 and in the uterus 1.25±0.07. Compared to the group over one year (>1m.), where were more of the cells in the ovaries - 6.78±0.94 and 6.4±2.6 in the uterus. On average, 2.77±2.08 mast cells were detected in feline ovaries in proestrus group and in the uterus - 2.14±1.49. In the feline group in diestrus, the number of mast cells count in the ovary was 3,8 times higher - 10.75±0.78, and in the uterus 3,3 times higher - about 7,15±0,5. The number of mast cells in the ovaries in the uterus, in proestrus bitch group, was 0.7±0.57, and in the uterus 1.25±0.07. In the diestrus bitch group the were 9,6 times more mast cells in the ovary - 6.78±0.94 and 5,1 times more in the uterus - 6.4± 2.6. It was established that the number of mast cell in feline, bitch groups over one year and diestrus was higher (p>0,05) compared to groups in up to one year and in proestrus.

6

SANTRUMPOS

CD34+ – pirminės kaulų čiulpų ląstelės TNF-α – alfa navikų nekrozės faktorius IL-4 – interleukinas 4

IL-5 - interleukinas 5 IL-6 - interleukinas 6 IL-15 - interleukinas 15 LTC4 – leukotrienas C4

bFGF - b-fibroblastų augimo faktoriu FGF-2 – fibroblastų augimo faktorius 2 NGF - nervų augimo faktorius

VEGF - kraujagyslių endotelio augimo faktorius PGD2 – prostoglandinas D2

PDGF – iš trombocitų kilęs augimo faktorius MIP - markofagų uždegimo proteinas

CPA3 - karboksipeptidazės A3

CCR3, CCR4, CCR5 - chemokinų receptoriai ant putliųjų ląstelių 3,4,5 TGF-β – transformuojantis augimo faktorius beta

IgE – imunoglobulinas E

MMPs – tarpląstelinės medžiagos metaloproteinazė

MHCI - pagrindinis histologinio suderinamumo kompleksas I MHCII - pagrindinis histologinio suderinamumo kompleksas II c-Kit – putliųjų/kamieninių ląstelių augimo faktoriaus receptorius FSH – folikulus stimuliuojantis hormonas

LH – lutenizuojantis hormonas Pav. – paveikslėlis.

7

ĮVADAS

Putliosios ląstelės laikomos multifunkcinėmis imuninėmis ląstelėmis dalyvaujančiomis įvairiose organizmo funkcijose ir susirgimuose. Platus šių ląstelių pasiskirstymas bei atliekamų funkcijų įvairovė audiniuose parodo, jog šios ląstelės reaguoja į aplinkos pokyčius bei geba komunikuoti su kitomis ląstelėmis dalyvaujančioms fiziologiniuose, imunologiniuose, uždegiminiuose procesuose (12,19). Putliosios ląstelės dalyvauja audinių atkūrime, žaizdų gyjime, angiogenezėje. Manoma, jog šios ląstelės turi ypatingą vaidmenį įgimtame, įgytame imunitete, imuninėje tolerancijoje bei dalyvauja lėtinėse alergininėse, uždegiminėse, autoimuninėse reakcijose bei navikiniuose susirgimuose (19). Pateikiama vis daugiau įrodymų apie putliųjų ląstelių vaidmenį uždegiminiuose procesuose, kur jos yra aktyvuojamos nealerginių reakcijų metų veikiant neuropeptidams ir citokinams. Šios ląstelės geba selektyviai išskirti uždegiminius mediatorius nedegranuliuodamos. Pavykus išsiaiškinti putliųjų ląstelių selektyvią sekreciją tai leistų sukurti unikalius putliųjų ląstelių inhibitorius (12).

Išskiriamas šių ląstelių vaidmuo reprodukcijoje, kuomet priklausomai nuo lytinio ciklo bei lytinių harmonų kiekio rujos ir neštumo metu putliosios ląstelės yra linkę kauptis pieno liaukose, gimdoje bei kiaušidėse, kur dalyvauja audinių struktūrinėje rekonstrukcijoje (10) bei randamos esant kiaušidžių cistoms (35), gimdos endometriumo polipams (38) bei endometriozei (39). Daugelis autorių išskiria, jog putliosios ląstelės yra vienos iš svarbiausių ląstelių dalyvaujančių reprodukcinės sistemos angiogenezėje (28). Tačiau vis dar nėra aišku kokias specifines funkcijas atlieka šios ląstelės kiaušidžių bei gimdos audiniuose reprodukcijos procese. (26).

Šis darbas aktualus tuo, jog nustačius nuo ko priklauso šių ląstelių atsiradimas ir koks jų vaidmuo, būtų įmanoma labiau valdyti įvairius fiziologinius ir patologinius procesus vykstančius kačių, kalių kiaušidėse bei gimdoje.

Savo baigiamajame darbe apžvelgiau kiaušidėse bei gimdoje esančių putliųjų ląstelių funkciją, jų paskirstymą bei kiekį priklausomai nuo metų ir lytinio ciklo fazės.

Darbo tikslas: Ištirti kačių, kalių kiaušidėse bei gimdoje randamų putliųjų ląstelių skaičių bei jo kitimą priklausomai nuo metų bei lytinio ciklo fazės.

Uždaviniai:

1. Įvertinti putliųjų ląstelių skaičių kačių, kalių kiaušidėse bei gimdoje: i) Iki vienerių metų (<1m.).

ii) Virš vienerių metų (>1m.).

2. Įvertinti putliųjų ląstelių skaičių kačių, kalių kiaušidės bei gimdoje: i) Priešrujo lytinio ciklo fazėje.

8

1. LITERATŪROS APŽVALGA

1.1 Patelių lytinės sistemos anatomija

Patelių lytinė sistema sudaryta iš porinių gonadų – kiaušidžių (ovaries), kurios produkuoja moteriškąsias gametas (kiaušialąstes) bei hormonus. Porinių kiaušintakių (tuba uterine), kurie pagauna subrandintą kiaušialąstę ovuliacijos metus ir dalyvauja jos pernešime į gimdą. Gimdos (uterus), kuri sudaryta iš dešnio bei kairio gimdos ragų (cornua uteri dextrum et sinistrum), gimdos kūno (corpus uteri), bei gimdos kaklelio (cervix uteri), kuris toliau pereina į makštį. Makštis savo ruoštu atsiveria į išorinius lytinius organus, kuriuos sudaro vulva (pubendum feminum), klitoris (clitoridis) ir šlaplė (urethra feminina) (1,2).

1.1.1 Patelių kiaušidžių (ovaries) anatomija, histologija

Kiaušidės atlieka gametogenines, kiaušaląstės formavimo, brandinimo ir endokrinines funkcijas (2). Pas šunis, kates kiaušidės nekeičia savo vietos nuo vystymosi pradžios ir išlieka dorsalinėje pilvo ertmės dalyje, kaudaliai nuo inkstų (22). Kiaušidės yra nuo ovalo iki apvalios formos, o jų dydis gali varijuoti priklausomai nuo lytinio ciklo stadijos. Kiaušidžių histologinė struktūra priklauso nuo patelės rūšies, amžiaus ir lytinio ciklo stadijos. Subrendusios patelės organizme, kiaušidžių paviršius dažniausiai yra padengtas paprastu kūbiniu arba plokščiuoju paviršiniu epiteliu (epithelium superficiale), po kuriuo galima rasti tankų, vaskuliarizuotą netaisyklingo jungiamojo audinio sluoksnį vadinamą balzganuoju dangalu (tunica albuginea), kuris sudaro kapsulę kiaušidėms. Šio dangalo struktūra gali būti suardoma folikulo augimo metu bei bręstant geltonkūniui. Balzganasis dangalas dengia pirmąjį kiaušidžių sluoknį - žievę (cortex), po kuria galima rasti kiaušidžių šerdį (medulla), kuri yra centrinė kiaušidžių dalis apsupta žievės (3,6,7).

Kiaušidžių žievė (cortex ovarii) sudaryta iš puriojo kologeninio jungiamojo audinio, kuris formuoja stromą aplink įvairius kiaušidės žievės parenchimos elementus, kaip įvairios stadijos folikulus esančius žievėje, geltonuosius kūnus, endokrinocitų eiles ir jų sankaupas bei kraujagysles ir nervus (3,6). Kiaušidėse esantis purusis jungiamasis audinys yra sudarytas iš fibroblastų, fibrocitų, adipocitų, putliųjų ląstelių, plazmocitų, makrofagocitų bei kalogeno, retikulinių ir elastinių skaidulų, tarp kurių yra išsidėstęs tankus kapiliarų tinklas, kuris maitina ovacitus ir dalyvauja kiaušidės pūsliniam folikulams transformuojantis į geltonąjį kūną (4,6). Kalių kiaušidėse po balzganuoju dangalu galima rasti trumpų vamzdelių, kurie yra sudaryti iš viensluoksnio kubiškojo epitelio ir įprastai atsiveria į kiaušidės paviršiaus epitelį (6,7).

Kiaušidės šerdis (medulla ovarii) sudaryta neruožuotųjų miocitų virželių bei puraus kologeninio jungiamojo audinio nusitęsiančių į kiaušidės raištį. Intersticiniame audinyje galima rasti kraujagyslių, nervų bei limfagyslių, kurie į kiaušidę įeina pro jos vartus (hillus ovarii), kurios

9 yra apsuptos puraus jungiamojo audinio, kuriame gausu elastinių ir retikulinių skaidulų. Kiaušidės šerdyje esančios arterijos yra susivijusios į spiralę, kas leidžia joms prisitaikyti prie nuolat kintančios kiaušidės formos bei apimties ciklo metu. Mėsaėdžių kiaušidės šerdyje, kiaušidės vartuose ar mezovariume galima rasti kiaušidės tinklo (rete ovarii) liekaną, kuris savo struktūra yra panaši į sėklidės tinklą, kuris yra suformuotas iš šerdies stygų (chorda medullaris) sudarytų iš kūbiškųjų epiteliocitų ar anastomozuojančių, kubiškuoju epiteliu išklotų šerdies vamzdelių (tubuli

medullaris) (3,6). Yra teigiama, jog šio tinklo ląstelės gali diferencijuotis į folikulų ląsteles, kuomet

susigretina su ovacitu arba dalyvauja susidarant folikuliniam epiteliocitams bręstančiose folikuluose bei valdo mejozę besidalyjančiame ovacite (3,7).

Arterijos į kiaušidę patenka per kiaušidės vartus. Šerdyje jos formuoja rezginius iš kurių išeina šakos į folikulus, geltonąjį kūną ir stromą. Aplink didelius folikulus arterijų šakos formuoja kapiliarų tinklą. Esant ciklinei geltonojo kūno ir folikulų regresijai, raumenų hipertrofija ir sklerozė pasireiškia arterijose aprūpinačioje šias struktūras, o veninė kraujotaka kiaušidėje grįžta į tokį pat lygį paraleliai su arterine.

Kiaušidės dažniausiai randami bemieliai nervų aksonai. Pagal prigimtį, jie yra vazomatoriniai tačiau turi sensorinių skaidulų. Visi nervai eina lygiagrečiai su kraujagyslemis ir užsibaigia kraujagyslių sienelėse, folikuluose, geltonajame kūne bei balzganajame audinyje. Nervai patenkantys į kiaušides daugiausiai yra iš simpatinės nervų sistemos ir ateina iš inkstų, aortos nervinių rezginių. Yra išskiriama, jog dešimtasis galvos nervas, klajojantis nervas, taip pat turi savo atšakų kiaušidėse (7).

Kiaušidžių folikulai. Didžioji žievės dalis yra sudaryta iš folikulų, kurie yra suformuoti iš užuomazginių lytinių ląstelių, kurios yra diferencijavusios iš ovogonijų embrioninio vystymosi metu, kuomet formavosi moteriškosios gametos (2). Folikulai esantys kiekvienos kiaušidės žievėje yra sudaryti iš pirminių oocitų bei juos apsupančių palaikančiųjų ląstelių, kurios yra apsuptos specializuotų stromos ląstelių (3). Folikulai bręsta tokia tvarka: užmuomazginiai, pirminiai folikulai, antriniai folikulai, maži ir dideli pūsliniai folikulai. Visi folikulai kiekvienoje stadijoje gali regresuoti, išskyrus dominantinį folikulą. Folikulų dydis pradedant nuo užmuomazginio iki mažo pūslinio folikulo, pas šunis, bezdžiones ir žiurkes yra panašaus dydžio. Folikulų augimas iki pūslinių folikulų nėra priklausomas nuo gonadotropinų FSH (18).

Užuomazginiai kiaušidės folikulai – vystosi iš oogonijų, kurios atsiranda iš vidinių epitelinių ląstelių sankaupų, kurios vėliau atsikiria ir kiekvieno telkinio centre formuojasi oogonija, kuri pasiekia mejozės pirmo etapo profazę ir tampa pirminiu ovacitu (3). Pirminį ovacitą dengia vieno sluoksnio plokštieji nediferencijuoti folikuliniai epiteliocitai (6). Toks pirminis ovacitas susiformavęs iš oogonijos yra pradėjęs pirmąjį mejozinį dalijamąsi ir įvykdęs mejozė profazės stadijos leptotenos, zigotenos, pachitenos fazes ir lieka vėlyvojoje diplotenos fazėje iki ovuliacijos

10 arba patelės lytinio ciklo išnykimo. Profazės stadija nebus tol baigta iki kol įvyks ovuliacija, net ir po daugelio metų. Suformuoti šimtaitūkstančių iki kelių milijonų pirminių ovacitų vaisiaus vystymosi metu yra saugomi užuomazginiuose folikuluose, kurie randami periferinėje kiaušidžių žievės dalyje prie balzganojo dangalo. Dauguma šių pirmapradžių folikulų degeneruoja dar vaisiaus vystymosi metu ir toliau degeneruoja po gimimo. Galiausiai tik keli šimtai pirmapradžių užuomazginių folikulų subręs ir ovuliuos patelės gyvenimo laiku. Daugumos tokių folikulų brendimas sustos įvairiose brendimo stadijose ir galiausiai bus sunaikinti folikulų atrezijos metu (2,6).

Pirminiai kiaušidės folikulai – subrendusiame patelės organizme pavieniai užuomazginiai folikulai pradeda bręsti ir tampa pirminiais. Formuojasi pūslelės, kurios išlieka salyginai mažos bei atsiranda multipūsleliniai kūnai. Folikulą vis dar supa viensluoksnis kūbiškasis epitelis (3). Mėsaėdžių kiaušidėse pirminiai folikulai pasiskirsto grupėmis (6).

Antriniai kiaušidės folikulai - pirminis ovacitas didėja, o ovacitą supantys folikuliniai epiteliocitai dalijasi ir tapdami daugiasluoksniu epiteliu. Šiame etape folikulo ląstelės lieka prisijungę prie sustorėjusios pamatinės membranos (membrana limitans externa) gretimai stromos. Apikaliai, folikulinės ląstelės atsiskria nuo pirminio ovocito ir sudaro erdvę vadinamą skaidriaja zona (zona pellucida), kuri gaubia ovocitą. Ši zona sudaryta iš amorfinės medžiagos, kurią sekretuoja pirminis ovocitas (3). Aplink ovocito membraną, iš pūslelių yra išleidžiami įvairūs glikoproteinai, kurie dalyvauja skaidriosios zonos susidaryme, o folikuliniai epiteliocitai suformuoja vieną stulpiškųjų epiteliocitų sluoksnį aplink pirminį ovocitą – spindulinį vainiką (corona radiata) (3,6). Šių ląstelių mikrogaureliai įsiterpę į skaidriąją zoną jungiasi su pirminio ovacito plazmolema suauginėmis dėmėmis (6).

Pūslinis kiaušidės folikulas – folikulo ląstelės toliau proliferuoja ir atsiranda tarpas tarp folikulinių epiteliocitų vadinamas folikuline ertme (antrum folliculare). Ši ertmė prisipildo į plazmą panašiu skysčiu, kuriame galima rasti glikozaminoglikanų, su steroidais susijusių proteinų ir hialurono rūgšties, kurie sudaro folikulinį skystį (liquor folliculi) ir susiformuoja pūslinis kiaušidės folikulas (3,6). Šiame folikule ovocitas dėl skyčių yra nustumiamas į vieną folikulo pusę (3). Šalia esančios folikulinės ląstelės apsupa ovacitą, padidėjusios tampa stulpiškuoju epiteliu ir radialiai išsidėstę aplink ovacitą suformuoja spindulinį vainiką (corona radiata) (3,6). Šio folikulo sienelę formuojantis vidinis folikulinių epiteliocitų sluoksnis ir išorinis žievės jungiamojo audinio apvalkalas yra sudarytas iš išorinio apvalkalėlio (theca externa) bei vidinio apvalkalėlio (theca

interna) (6). Bręstant pūsliniam kiaušidės folikului folikuliniai epiteliocitai formuojantys vidinį

apvalkalėlį tampa epitelioidinėmis ląstelėmis pasižyminčiomis metaboliniu akyvumu, kuris yra panašus į steroidus produkuojančias ląsteles ir yra vadinamos apvalkalėlio endokrinocitais (3,6). Šios ląstelės priešrujo ir rujos metu yra atsakingo už steroidinių hormonų, kaip estradiolis, estriolis

11 ir estronas sintezavimą (6). Išorinio apvalkalėlio ląstelės išlieka fibroblastiškos ir formuoja ploną puraus kologeninio jungiamojo audinio sluoksnį aplink vidinį apvalkalėlį bei apsupa dideles kraujagysles, kurios vidiniam apvalkalėlio sluoksnį šakojasi į kapiliarus (3).

Pilnai subrendus pūsliniam folikului, šis skverbiasi per balzganąjį dangalą ir plyštą ploniausioje vietoje - folikuliniame gumburėlyje (stigma folliculare) ir įvyksta ovuliacija. Visus šiuos pokyčius sukelia adenohipofizės liutenizuojantis hormonas, kuris skatiną pirminį ovacitą baigti pirmą mejozės dalijamasi, o antrinį ovacitą pereiti į antrąjį mejozinį dalijamasi. Padidėjęs LH, histamino lygis išplečia kraujagysles, kas skatina skysčius kauptis folikulinėje ertmėje, didina kraujospūdį kiaušidės folikulo sienelės kapiliaruose ir stroma tampa edemiška. Kartu vykstantis prostoglandinų išskyrimas, salygoja padidėjusį tarpląstelinės medžiagos metaloproteinazės (MMP) aktyvumą, kas kartu su kologenaze ir kitais enzimais dalyvauja kiaušidės jungiamojo audinio ekstraląstelinės medžiagos degeneracijoje, pertvarkyme. Prostoglandinai stimuliuoja kiaušidės folikulines ląsteles sekretuoti selektyvų MMP, sudarytą iš kolagenazės kurie prisideda prie folikulo sienos suardymo folikuliniame gumburėlyje ir yra susijęs su lydinčiu uždegiminiu atsaku, kai leukocitai skverbiasi į tą regioną. Vis šie procesai padeda efektyviai pašalinti kiaušidės folikulinę sienelę bei balzganąjį dangalą ir ovocitas apgaubtas spindulio vainiko išsilaisvina (3,6).

Po ovuliacijos, pūslinio folikulo vietoje, formuojasis geltonasis kūnas (corpus luteum). Geltonasis kūnas formuojasi per eilę stadijų, kurias sudaro proliferacija, vaskuliarizacija, liutenizaciją bei regresiją. Proliferacijos metu vystosi hemoraginis kūnas (corpus hemorrhagicum), toliau vaskuliarizacijos metu iš vidinio folikulo sienelės apvalkalo įauga jungiamojo audinio pertvaros, kartu su kraujagyslėmis, kurių kapiliarai aprūpina folikulines ląsteles (6). Liutenizacija yra procesas vykstantis po ovuliacijos, kurio metu ląstelės pakinta tiek morfologiškai tiek biochemiškai. Folikuliniai epiteliocitai ir vidinio apvalkalėlio lastelės dalyvauja lutenizacijos procese. Ovuliacija folikulinius epiteliocitus ir vidinio apvalkalėlio ląsteles verčia į lutoeocitines ląsteles. Ansksčiau buvo manoma, kad šios ląstelės negali vykdyti mitozės, tačiau atlikti tyrimai rodo, kad proliferuojančios ir subrendusio ląstlės yra randamos kartu ankstyvame geltonkūnyje. Šios savybės mažėja, kai bręsta geltonkūnis. Liutenizacija kartu apima ir invaziją ekstrafolikuliarinių elementų, kaip vidinio apvalkalėlio ląstelių, kraujagyslių, bei reitkuloendotelinių komponentų (18). Luteinizacijos etape folikuliniai epiteliocitai ir vidinio apvalkalėlio ląstelės keičiasi ir pradeda formuoti endokrininį organą, kurį sudaro geltonojo kūno endokrinocitai – grūdėtieji luteocitai (granulosoluteicyti) bei tekaluteocitai (thecaluteocyti). Grūdėtieji luteocitai susidaro iš pūslinio folikulo sienelės folikulinių epiteliocitų, kurie porujo ir tarprujo metu dėl ląstelėse esančių organelių geba sintezuoti steroidinius hormonus. Tekaluteocitai susidaro iš folikulo sienelės vidinio apvalkalo ląstelių. Šie endokrinocitai dėstosi geltonojo kūno

12 periferijoje ir jungiamojo audinio pertvarose tarp grūdėtųjų luteocitų ir kartu jie sintetina progesteroną (6).

1.1.2 Gimda (uterus)

Gimda yra praplatėjusi lytinės sistemos dalis, į kurią patekęs embrionas implantuojasi, vyksta mainai tarp patelės ir vaisiaus kraujotakų bei yra saugomas iki kol subręs (2). Gimda guli dorsaliai plonųjų žarnų ir susideda iš trumpo gimdos kaklelio, gimdos kūno iš kurio išeina du ilgi gimdos ragai nukrypstantys į kiaušides esančias kaudaliai inkstų (22). Pas visus naminius gyvūnus randama dviragė gimda, kuri pereina į kiaušintakius. Kaudaliai gimdos randamas gimdos kaklelis, kuris toliau pereina į makštį ir atlieka sfinkserio funkciją tarp makšties bei gimdos. Gimdos ragai yra tiesūs pas kales (2).

Gimda yra sudaryta iš serozinio (perimetrium), raumeninio (myometrium) ir gleivinio (endometrium) dangalo (2).

Serozinis dangalas, mezometriumas, ateina iš plačiojo gimdos raiščio (2). Šiame sluoksnyje dėstosi daugybė kraujagyslių, neruožuotųjų miocitų, nervinių skaidulų bei limfagyslių apsuptų glaudaus kologeninio jungiamojo audinio, padengto mezoteliu (6).

Raumeninis dangalas, miometriumas, yra sudarytas iš silpno išorinio išilginio bei storesnio vidinio žiedinio raumeninio dangalo (2). Abejuose sluoksniuose neruožuotojų miocitų ląstlėlės sudaro pluoštus, kurie yra sujungti vienas su kitu ir juos dengia ploni sluoksniai jungiamojo audinio, kurį sudaro fibrocitai, histiocitai, putliosios ląstelės, kologeninės bei elastinės skaidulos (3). Šiuos sluoksnius skiria labai vaskuliarizuotas kraujagyslinis sluoksnis (2). Jame dėstosi taip pat stambios limfagyslės, nervai apsupti puraus kologeninio jungiamojo audinio (6). Raumeninio sluoksnio audiniai, ypač išorinio sluoknio išilginiai raumenys nusitęsia į platųjį gimdos raištį (2). Dėl padidėjusio estrogenų kiekio neruožuotieji miocitai gali padidėti iki 10 kartų, o nesant estrogenų vyksta jų atrofija (3).

Gimdos gleivinė, endometriumas, yra padengtą paprastais stulpiškais epiteliocitais, o jos paviršiuje atsiveria daugybė vamzdinių liaukų (2). Gleivinės sandara yra nepastovi ir priklausoma nuo lytinio ciklo stadijų. Gleivinėje išskiriamas epitelis bei savo gleivinės plokštelė, kurias atskiria pamatinė membrana (6). Savojoje gleivinės plokštelėje sudarytoje iš puraus kologeninio jungiamojo audinio skiriami du sluoksniai - paviršinis funkcinis gimdos gleivinės sluoksnis, kuris kinta esant nėštumai ar rujai, bei pamatinis gimdos gleivinės sluoksnis, iš kurio atsistato funkcinis gleivinės sluoknis. Paviršinis funkcinis gimdos gleivinės sluoksnis yra ypač vaskuliarizuotas ir jame dėstosis makrofagai, limfocitai, fibroblastai, bazofiliniai, neutrofiliniai granuliocitai, plazmocitai bei paprastos, šakotos ar vingiuotos vamzdinės gimdos liaukos (6).

13 Gimdos vaskuliarizacija yra priklausoma nuo kiaušidės arterijos gimdos atšakos bei iš makšties arterijos išeinačios gimdos arterijos (2). Į gimdą ateinantys autonominiai nervai sudaro rezginius savojoje gleivinės plokštelėje bei aplink neruožuotuosius miocitus. Juntamosios nervų galūnėlės išsidėsto kiekviename gimdos sienelės sluoksnyje (6).

1.2 Lytinis ciklas

Nors katės ir turi panašų lytinį ciklą į kitų naminių gyvūnų, tačiau jis yra neįprastas (16). Katės subręsta apie 7-12 mėnesių, priklausomai nuo genotipo bei nuo išorinių aplinkos veiksnių kaip mitybos, metų laiko, klimato, ligų (5). Naminės katės turi sezoniškai pasireiškiantį poliestrinį lytinį ciklą, kuris yra priklausomas nuo šviesos kiekio. Esant mažiau nei 8 valandoms dienos šviesos per parą yra slopinamas lytinis ciklas, o 14 valandų per parą apšvietimas skatina lytinį ciklą, kuris sugrįžta per 15,6±0,5 dienas. Kačių patelės turi provokacinę ovuliaciją, kurią skatiną išoriniai stimulai, kaip natūralus poravimosi aktas. Tuomet hipofizė išskiria LH hormonus ir ovuliuoja subrendę folikulai. Iki 60% kačių gali ovuliuoti neturėję jokio stimulo, poravimosi akto (14). Katingumas ir psuedokatingumas - sutrikdo periodinį estradiolio išskyrimą, nes tuo metu susiformavęs geltonkūnis išskiria progesteroną, kuris slopina pagumburio – adenohipofizės sistemą (16).

Pas kates išskiriami keturi atskiri lytinio ciklo etapai, kuriuos sudaro priešrujis, ruja, porujus ir tarprujis. Tačiau dėl sezoniškai pasireiškiančio poliestrinio ciklo ir pravokacinės ovuliacijos katės patelė gali patekti į kitą lytinio ciklo etapą – interestrus (nonesrous) (17).

Priešrujis – reprodukcinės sitemos suaktyvėjimas, kurios metu auga folikulai ir regresuoja policikliniams gyvūnams praėjusio ciklo metu susiformavęs geltonkūnis (5). Folikulai paauga nuo 1mm iki 1,5mm. Sintetinamas ir išskiriamas estrogenas. Folikulinės fazė pradžia laikoma, kuomet šio hormono koncentracija pasiekia 20pg/ml, kas parodo folikulų aktyvumą (17).

Ruja – patelė prisileidžia patiną (17). Folikulai vis dar auga kiaušidėse, kol pilnai nefunkcionuoja geltonasis kūnas, o pagrindiniu hormonu išlieka estrogenas (5). Kiaušidės padidėja, jose matomi 2-3mm permatomi folikulai (17). Rujos metu katės gali turėti nuo 5 iki 8 subrendusių folikulų abiejose kiaušidė (5). Šioje stadijoje gali įvykti ovuliacija, kurį pas kates yra provokacinė (ovulatio provacata). Provokacinė ovuliacija sukeliama lytinio akto metu kuomet yra stimuliuojami makšties bei gimdos kaklelio receptoriai (5). Tai inicijuoja neuroendokrininį refleksą, kurio metu yra aktyvuojami GnRH neuronai, kurie toliau akyvina hipofizę išskirti LH (5). Pakartotinis kergimas užtrikrina, jog bus išskirtas tinkamas kiekis LH (16). Padidėja kraujyje cirkuliuojančio estradiolio 17-β koncentracija (14). Priešrujo ir rujos lytinio ciklo fazės yra vadinamos folikulų augimo fazėmis (5). Pirmąją dieną pasireiškus folikuliniai fazei, estrogeno koncentracija būna iki

14 25pg/ml, kuri vėliau kyla iki 45pg/ml trečiąją dieną ir iki 50pg/ml penktąją dieną. Septintą dieną mažėja iki 20-25pg/ml ir nukrenta iki 10pg/ml aštuntąją dieną (17).

Interestrus - pas mišrūnes, namines kates interestrus etapas vidutiniškai trunka apie 9±7,6 dienas per dauginimos sezoną, nebent pasireiškia ovuliacija. Veislinėms katėms, kurioms pasireiškė, ovuliacija, bet neįvyko apvaisinimas, interestrus etapas gali trukti iki 50.3±2,7 dienų (14).

Porujis – šiuo metu geltonkūnis pilnai funkcionuoja ir sekretuoja didelius kiekius progesterono. Ši fazė vadinama luteinine ciklo faze (5).

Tarprujis – šiame etape bręstančių folikulų mažai, geltonasis kūnas regresuoja bei nustoja funkcionuoti (5). Dauguma kačių tarprujo ar interestrus fazių metu estrogeno koncentracija kraujo plazmoje būną žemiau 12pg/ml ar iki 15pg/ml (17).

1.2.2 Kalių lytinio ciklo ypatumai

Kalės turi nuo sezono nepriklausantį monoestrinį lytinį ciklą kuomet spontaniškai ovuliuoja vieną ar du kartus per metus, o ovuliacija gali įvykti, bet kuriuo metų laiku (14). Pirmoji ruja priklausomai nuo veislės ir dydžio kalėms pasireiškia 6-14 mėnesių (15).

Visos kalės turi ilgą ramybės ciklo fazę, nepriklausomai ar jos buvo apvaisintos ar ne. Vidutinis intervalas tarp rujų yra 7 mėnesiai, tačiau gali varijuoti priklausomai nuo veislės. Lytinis ciklas pas kales yra suskirstytas į keturias fazes: proestrus (priešrujo), estrus (rujos), diestrus (porujo) ir anestrus (ramybės) lytinio ciklos fazes (5).

Priešrujis – trunka 5-20 dienų (15). Šioje stadijoje pradeda bręsti folikulai, kurie pasiekia 0,7-1,1cm dydį, kiaušidės padidėja (5). Pasiekiamas estradiolio pikas (15).

Ruja – trunka nuo 5 iki 15 dienų (15). Ovuliacija įvyksta po 1-2 dienų po rujos, tačiau kai kurie folikulai vis dar gali ovuliuoti iki 14 dienos. Ovuliacija spontaninė ir daugumą folikulų plyšta per 48 valandas. Geltonkūnis pilnai susiformuoja po 10 dienų ir būna 0,6-1,0cm. Progesterono lygis pradeda kilti iki ovuliacijos likus 60-70valandų, kas parodo, kad vyksta priešovuliacinė subrendusių folikulų lutenizacija. Estrogenų lygis pakyla dar prieš ovuliaciją ir seka paskui LH piką ir trunka 36±55valandas, o ovuliacija įvyksta po 24-96 valandų po šio reiškinio (5).

Porujis – trunka apie 50-80 dienų (15). Ši stadija atsiranda, kai kalė nustoja prisileisti patiną ir baigiasi, kai geltonkūnis regresuoja apie 70-80 dieną ar kol persitvarko endometriumas 130-140 dieną. Geltonkūnis pradeda regresuoti 30-ą dieną po ovuliacijos (5). Progesterono pikas nustatomas porujo pradžioje (15).

Ramybės – trunka nuo 80 iki 240 dienų (15). Kiaušidės ovalios formos, truputį suplokštėję. Matomos gelsvos ar rudos zonos kiaušidėje regeresavusio geltonojo kūno (5).

15

1.3 Morfologiniai, histologiniai kiaušidžių bei gimdos pokyčiai lytinio ciklo metu

1.3.1. Kiaušidžių morfologiniai ir histologiniai pokyčiai lytinio ciklo metu.

Kalių lytinio ciklo metu abi kiaušidės patiria vienodus morfologinius pokyčius. Ovuliacija įvyksta vienu kartu abejose kiaušidėse. Ovuliuoja nuo 4 iki 15 subrendusių folikulų (18).

Priešrujo metu (1 pav.) du ar keturi dideli folikulai gali būti matomi sagitaliniame vienpusiame kiaušidžių pjūvyje (18).

Rujos metu folikulo ląstelės yra transformuojamos į luteinines ląsteles ir toliau vyksta folikulo sienų susiglaudimas. Liutenizuoti folikulai trūksta ir iškiriamas ovocitas (18).

Ankstyvoje porujo stadijoje (1 pav.), abiejose kiaušidėse galima rasti didelius geltonuosius kūnus. Regresuojant geltoniesiams kūnams, vėlyvesnėse porujo stadijose, luteininių ląstelių citoplazmoje galima matyti vakuoles (18).

Ramybės metu (1 pav.) geltonasis kūnas palaipsniui regresuoja, mažėja jo dydis (18).

1 pav. Kalių kiaušidžių histologiniai, morfologiniai pokyčiai priešrujo, rujos, porujo, ramybės fazėse. PF – priešovuliacinis folikulas FC – funkcionuojantis geltonasis kūnas, RC – regresuojantis geltonasis kūnas (18).

1.3.2 Gimdos morfologiniai, histologiniai pokyčiai lytinio ciklo metu.

Priešrujo metu (2 pav.) lytinė sistema, buvusi neaktyvi ramybės laikotarpiu, greitai vystosi. Gimdos sienelė tampa storesnė. Gleivinės sluoksnis proliferuoja, tampa hiperemiškas (2). Grūdėtieji neutrofilai infiltruoja gleivinę, o savoji gleivinės plokštelė tampa labiau vaskuliarizuota, edemiška. Liaukos išslieka tiesios, bet šiek tiek pailgėja (3).

Rujos metu (2 pav.) gleivinės epitelis ir toliau tankėja, tampa infiltruotas mononukleariniais leukocitais. Savoji gleivinės plokštelė tampa maksimaliai vaskuliarizuota, hemoragiška bei edemiška. Randama didžiausias putliųjų ląstelių kiekis, bei matoma mikroskopinė hemoragija ir metroragija prieš ovuliaciją (3).

16 Porujo metu (2 pav.), kraujagyslės mažiau pripildytos kraujo, mažėja audinių edema. Liaukos šakojasi ir tampa labiau vingiuotos. Neįvykus apvaisinimui šios liaukos palaipsniui involiucionuoja (3).

Ramybės metu (2 pav.) epitelis ir savoji gleivinės plokštelė pastebimai suplonėja, o epitelis tampa kubiškas. Vykstant liaukų regresijai matomi paprasti vamzdiniai ir šakoti adenomerai (3).

2 pav. Kalių gimdos histologiniai, morfologiniai pokyčiai priešrujo, rujos, porujo, ramybės fazėse. (18)

1.4 Putiosios ląstelės, jų skirstymas bei gamyba kaulų čiulpuose

Putliosios ląstelės yra šiek tiek kiaušinio formos ir gali būti didesnės nei makrofagai su 20-30μm ar didesniu diametru. Citoplazma išsiskiria daugybe sekrecinių bazofilinių granulių. Taip pat galima rasti išmėtytas mitochondrijas, grūdėtąjį endoplazminį tinklą, polisomas ir Goldžio aparatą. Granulės, kurios yra apsuptos plazminėmis membranomis, turi savyje įvairiausių medžiagų įskaitant sulfatinį gliukozaminoglikano hepariną, kuris reaguoja metachromatiška su tam tikrais dažais, kaip toluidino mėlynasis. Šios granulės apsupa dažniausiai centre ląstelės lokalizuotą sferinį, ovalų branduolį (8).

Putliųjų ląstelių citoplazmoje esančiose granulėse randamos skirtingos medžiagos, kas sąlygoja šių ląstelių skirtingą dažymąsi. Šios ląstelės pasižymi heterogeninėmis, histocheminėmis charakteristikomis, kai yra dažomos Alciano mėlynuoju, safraninu (8). Skiriami du skirtingi tipai putliųjų ląstelių (37):

 Gleivinės putliosios ląstelės (MCT) – įprastai randamos kvėpavimo bei virškinimo trakto

gleivinėse, o jų skaičius gali padidėti nuo limfocitų priklausančiam imuniniame atsake, kuomet veikia Th2 limfocitai (10, 11). Šių ląstelių granulėse galima rasti triptazės (7,37).  Jungiamojo audinio putliosios ląstelės (MCTC) – jungiamojo audinio ląstelės nėra

priklausomos nuo T limfocitų (11). Pelių jungiamojo audinio putliosios ląstelės išskiria proteazę 4, chimazę 1, triptazę beta 2, triptazę alfa/beta 1 ir karboksipeptidazę A3, bet

17 neturi gleivinių putliosiose ląstelėse randamu proteazės 1 ir 2 (10,37). MCTC pas šunis ir

kates sudaro apie 70% visų putliųjų ląstelių organizme (7).

Anksčiau putliosios ląstelės buvo vadinamos ,,audinių bazofilinėmis ląstelėmis“ (7). Dabartiniai tyrimai rodo, jog bazofilai ir putliosios ląstelės yra skirtingi ląstelių tipai. Putliosios ląstelės ir bazofiliniai granuliocitai kartu su kitais granuliocitais ir monocitais yra kilę ir diferencijavęsi iš kaulų čiulpuose esančių bendrų CD34+ pirmtakų ląstelių (11,37). CD34+ ląstelių diferencijacija į putliąsias ląsteles bei bazofilus priklauso nuo kamieninių ląstelių faktoriaus glikoproteino, kuris reaguoja su kitais citokinais ir yra gaminamas kaulų čiulpuose fibroblastų ir kraujagyslių endotelio ląstelių. Nėra jokių įrodymų, kad bazofiliniai granuliocitai gali diferencijuotis į audinių putliąsias ląsteles (11). Didžiausias skirtumas tas kad, bazofilai yra galutinai diferencijuoti dar prieš jiems patenkant į kraujo cirkuliaciją, kai putliosios ląstelės palikę kaulų čiulpus diferencijuojasi tik patekę į audinius. Putliosios ląstelės gali patirti mitozinį dalijimasi, o bazofilai jau nebegali. Taip pat bazofiliniai granuliocitai turi trumpesnį gyvenimo laiką, kuris trunka iki kelių dienų, o putliosios ląstelės gali išgyventi kelias savaites ar mėnesius (7).

1.4.1. Putliųjų ląstelių reikšmė

Putliosios ląstelės laikomos multifunkcinėmis imuninėmis ląstelėmis dalyvaujančiomis įvairiose organizmo funkcijose ir susirgimuose. Platus šių ląstelių pasiskirstymas bei atliekamų funkcijų įvairovė audiniuose parodo, jog šios ląstelės reaguoja į aplinkos pokyčius bei geba komunikuoti su kitomis ląstelėmis dalyvaujančiomis fiziologiniuose bei imunologiniuose procesuose (19). Putliosios ląstelės dalyvauja audinių atkūrime, žaizdų gyjime, angiogenezėje. Manoma, jog šios ląstelės turi ypatingą vaidmenį įgimtame, įgytame imunitete, imuninėje tolerancijoje bei dalyvauja lėtinėse alergininėse, uždegiminėse, autoimuninėse reakcijose bei vėžiniuose susirgimuose (19). Taip pat nurodomas šių ląstelių vaidmuo reprodukcijoje, kuomet priklausomai nuo lytinio ciklo bei lytinių harmonų kiekio rujos ir neštumo metu putliosios ląstelės yra linkę kauptis pieno liaukose, gimdoje bei kiaušidėse, kur dalyvauja audinių struktūrinėje rekonstrukcijoje (10). Daugelis autorių išskiria, jog putliosios ląstelės yra vienos iš svarbiausių ląstelių dalyvaujančių reprodukcinės sistemos angiogenezėje (28).

Putliosios ląstelės yra linkę išsidėstyti tokiose vietose (oda, kvėpavimo sistemos gleivinė, virškinimo traktas gleivinė) per kurias gali patekti potencialus patogenas ar įvykti kontaktas su pavojingomis medžiagomis. Putliosios ląstelės pagrinde randamos jungiamajame audinyje, kuris apsupa kraujagysles, nervus, lygiąsias raumenų ląsteles, gleivinės liaukas ir plaukų folikulus bei poepiteliniuose regionuose. Nepaisant to, jog šios ląstelės yra hemopoetinės prigimties jų nesubrendę pirmakai keliauja kraujo srove į periferinius audinius, kur vėliau subręsta. Yra pabrėžiama, jog kai kurie integrinai, adhezinės molekulės, chemokinai ir jų receptoriai, citokinai,

18 augimo faktoriai yra svarbūs veiksniai nulemiantys putliųjų ląstelių migraciją į audinius esant normalioms ir pataloginėms sąlygoms (19).

1.4.2. Putliųjų ląstelių išskiriami mediatoriai.

Putliosios ląstelės turi skirtingas morfologines, biochemines ir funkcines savybes skirtingose kūno dalyse. Jų aktyvumas ir atliekamos funkcijos yra reguliuojamos eilės faktorių, įskaitant citokinus, kurie veikia putliųjų ląstelių brendimą, diferencijaciją ir proliferaciją (8). Medžiagos esančios putliosiose ląstelėse yra vandenyje tirpios ir gali funkcionuoti taip, kad išskirtos sukeltų vietinę uždegiminę reakciją (3). Putliosios ląstelės gali būti aktyvuotos ir degranuliuoti traumu metu, veikiant šviesai, imuninių reakcijų metu veikiant imunoglobulinui E (IgE), komplemento sistemai ar citokinamas, bei esant neurogeniniams stimulams - neuropeptidams (7). Putliųjų ląstelių funkcijas atspindi jų gebėjimas sekretuoti įvairiausias biologiškai aktyvias medžiagas. Aktyvuotos putliosios ląstelės išskiria įvairiausius uždegiminius mediatorius. Išskiriami trys mediatorių tipai, kuriuos sekretuoja šios ląstelės:

 Paruošti mediatoriai – saugomi putliųjų ląstelių citoplazmoje esančiose granulėse.  Lipidiniai mediatoriai – gaunami iš ląstelės membranos lipidų.

 Naujai sintezuojami – šių mediatorių gamybą priklauso nuo stimulo tipo bei aktyvuoto receptoriaus (19).

Degranuluojant putliosioms ląstelėms yra išskiriama TNF-α histaminas, neutrali proteazė, proteoglikanai (chondroitino sulfatas ir heparinas), seratoninas (pas graužikus), triptazė, chimazė, įvairūs citokinai ir augimo faktoriai kaip TNF, IL-4, b-fibroblastų augimo faktoriu (bFGF), VEGF, transformuojantis augimo faktorius-β (TGF-β), nervų augimo faktorius (NGF), IL-5, IL-6, IL-15 bei kamieninių ląstelių augimo faktorių. P medžiaga sekretuojama sensorinių nervinių ląstelių ar makrofagų taip pat priverčia degranuliuoti putliąsias ląteles. Histaminas kartu su medžiaga P yra kartus susiję, nes histamino išskyrimas iš putliųjų ląstelių mažina P medžiagos išskyrimą iš nervinių skaidulų, kas sumažina uždegiminių molekulių kiekį. Putliųjų ląstelių bei P medžiagos sąryšis dažnai vadinamas neurouždegiminiu-neuroiminuniu keliu.(11)

Putliosios ląstelės taip pat sintezuoja leukotrienus (LT) C4 (LTC4), PAF, prostoglandinus (PG) D2 (PGD2), hepariną ir CC chemokinus, kaip markofagų uždegimo proteiną (MIP)-1-α ir makrofagų chemotaksio proteiną (MCP)-1. Šių mediatorių išskyrimas skatina formuotis ūmų uždegiminį procesą. Tačiau fiziologinės koncentracijos šių produktų leidžia reguliuoti kraujagyslių pralaidumą. Putliosios ląstelės taip pat išskiria proteolitinius enzimus, kaip triptazė ir chimazė, kurios dalyvauja pertvarkant esktraląstelinę medžiagą. Išskiriami dideli kiekiai triptazės ir chimazės padidina ekstraląstelinės medžiagos degeneraciją ir prisideda prie fibrozės ir audinių performavimo. Putliųjų ląstelių granulėse taip pat yra lizociminių fermentų heksoaminidazės, gliukuronidazės,

19 gliukozaminidazės, galaktozidų, arylsulfatazės, katepsinų (B, C, L, D, E), histamino, dopamino, poliaminų ir karboksipeptidazės A3 (CPA3). Chemokinai ir citokinai išskirti šių ląstelių dalyvauja įgimto imuniteto gynyboje kuomet vyksta chemotaksis ir išskiriami antimikrobiniai peptidai. Šie mediatoriai taip pat padidiną galimybę atsirasti adhesinėms molekulėms ant šalimai esančių kraujagyslių endotelio ląstelių ir leukocitų, kurie patenka į tą vietą (11).

1.4.3. Putliųjų ląstelių funkcijos fiziologiniuose bei patologiniuose procesuose

Putliosios ląstelės dalyvauja ne vien tik imuninės sistemos procesuose, bet ir eilėje biologinių procesų bei organizmo homeostazės palaikyme (19).

Homoestazė ir audinių atkūrimas, modeliavimas. Putliosios ląstelės ypač svarbios palaikant audinių funkcijas bei vientisumą. Daugybė putliųjų ląstelių išskiriamų mediatorių, kaip NGF, PDGF, VEGF, FGF-2, histaminas, triptazė sukelia epitelio ląstelių ir fibroblastų proliferaciją. Taip pat, dalyvauja visuose audinių gijimo etapuose, pradedant uždegimine reakcija ir baigiant tarpląstelinės medžiagos remodeliavimu (19).

Nervų sistemos. mediatoriai išskiriami putliųjų ląstelių bei neuronų dalyvauja neuroimuninio ryšio palaikyme (19).

Angiogenezė. Putliosios ląstelės išskiria mediatorius dalyvaujančius angiogenezėje. Mediatoriai angiopoetinas-1, FGF-2, VEGF, IL-8, TGF-β, TNF-α, histaminas, heparinas, triptazė bei chimazė (19).

Įgimtas imunitetas. Yra vienos iš pirmųjų imuninės sistemos ląstelių sąveikaujančių su antigenais, toksinais ir patogenais. Savo paviršiuje turi eilę receptorių gebančių atpažinti potencialiai žalingus signalus ir priversti ląstelę degranuliuoti (19).

Įgytas imunitetas. Putliosios ląstelės geba apdoroti ir pateikti patekusius antigenus per MHCI ir MHCII kompleksus. Putliųjų ląstelių išskiriami mediatoriai geba aktyvuoti dendritines ląsteles bei priversit jas migruoti į limfinius mazgus. Išskirdamos TNF gali tiesiogiai aktyvuoti T limfocitus (19).

Neadekvatus putliųjų ląstelių funkcijų aktyvavimas gali turėti rimtų pasėkmių organizmui (19).

Alergijos. Putliosios ląstelės yra pagrindiniai efektoriai atsakingi už IgE reguliuojamas alergines reakcijas. Šios ląstelės geba pateikti antigenus per MHCI ir MHCII kompleksus ir dalyvauja organizmo sensibilizacijoje (19).

Autoimuniniai susirgimai. Sutrikus imuninės sistemos veiklai, kuomet ji nebesugeba atpažinti savų molekulių nuo nesavų, limfocitai gali būti aktyvuoti įgimto imuniteto ląstelių ir suformuoti autoimuninę reakciją. Yra nustatyta, jog putliosios ląstelės gali sukelti padidėjusias uždegimines reakcijas keletos ligų stadijose. Šios ląstelės geba stimuliuoti autoreaktyvias ląsteles

20 bei skatinti jas atsirasti uždegimo židinyje. Putliųjų ląstelių suformuota uždegimininė reakcija gali sukelti T ląstelių aktyvaciją ir kartu gali inicijuoti audinių pažeidimus (19).

Mastocitozės. Tai sutrikimas, kuriam būdingas putliųjų ląstelių susikaupimas odoje, virškinimo trakte, kaulų čiulpuose, kepenyse, blūžnyje ir limfiniuose mazguose. Dažniausiai to priežatis įvykusi mutacija c-Kit receptoriuose (19).

Širdies ir kraujagyslių ligos. Dalyvauja arterosklerozės, širdies vainikinių kraujagyslių uždegime bei širdies išemijoje (19).

Navikiniai susirgimai. Santykis tarp putliųjų ląstelių, uždegimo bei vežinių susirgimų vis dar yra prieštaringas. Manoma, jog putliosios ląstelės geba skatinti bei saugoti nuo vėžinių susirgimų. Pastebima, jog šios ląstelės yra linkę dėliotis aplink žmonių ir graužikų navikus (19) ir dalyvauja kai kurių gyvūnų navikų formavimo procese, kurių metu reguliuoja angiogenezę (37).

1.5. Putliųjų ląstelių reikšmė kiaušidėse bei gimdoje

Putliosios ląstelės, bazofiliniai granuliocitai, trombocitai ir endotelio ląstelės yra svarbūs histamino šaltiniai kiaušidėse (35). Histaminas reguliuoja kraujo tekėjimą ir kraujagyslių pralaidumą kiaušidžių audiniuose, taip pat dalyvauja folikulų brendime bei ovuliacijoje (20). Putliosios ląstelės savo paviršiuje turi receptorius jautrius estradioliui ir progesteronui. Šių harmonų stimuliacija sukelia putliųjų ląstelių degranuliaciją, kurios metu iškiriamas histaminas, VEGF, proteazė, metaloproteinazė. Metaloproteinazė ir proteazė mažina ekstraląstelinio tarpląstelinio audinio kiekį, o VEGF moduliuoja neovaskuliarizaciją. Heparinas ir histaminas padidina kapiliarų pralaidumą ir kraujo tekėjimą kiaušidėse. Atskirai heparinas didina mitotinį ląstelių aktyvumą bei endotelio ląstelių migraciją, o hitaminas susijęs su ovuliacija. Taip pat žiurkių kiaušidėse putliosios ląstelės dalyvauja geltonkūnio vaskuliarizacijoje (8).

Putliųjų ląstelių kiekis gimdoje, kiaušidėse, kiaušintakiuose priklausomai nuo lytinio ciklo etapo kinta (8). Tiriant peles yra pastebėta, jog putliosios ląstelės kiaušidėje gali pasirodyti dar prieš lytinį subrendimą (10). Nustatyta, jog putliųjų ląstelių kiekis ožkų, karvių gimdoje, kiaušidėse bei kiaušintakyje kinta priklausomai nuo lytinio ciklo stadijos. Pas žiurkes toki pokyčiai fiksuojami tik kiaušidėse, o pas avis nepastebėta jokio skirtumo tarp putliųjų ląstelių kiekio patelių lytiniuose organuose lytinio ciklo metu (8). Pagal atliktus tyrimus ant pelių buvo nuspręsta, jog kiaušidėse pagrinde randamos jungiamojo audinio putliosio ląstelės, kurios turi tiesioginį kontaktą su bręstančiu ovacitu. Putliosios ląstelės pelių kiaušidės pagrinde yra randamos žievėje nei šerdyje, o labiausiai susikaupia ties išoriniu kiaušidę dengiančiu epiteliu. Atlikti tyrimai parodo, jog putliųjų ląstelių atsiradimas naujagimio kiaušidėse yra priklausomas nuo genotipo ir kad šios ląstelės prisideda prie ankstyvo folikulų brendimo pelėse ir kad jų skaičius koreliuoja su bręstančiais ovocitais (10).

21 Didžiausi kiekiai putliųjų ląstelių žiurkių kiaušidėse buvo pastebėti rujos ir porujo metu. Šios ląstelės žiurkių kiaušidėse pasiskirstę šerdyje, balzganajame dangale bei žievės intersticiniame jungiamajame audinyje (8). Ožkų kiaušidėse šios ląstelės yra pasiskirstę daugiausiai kiaušidžių žievėje, žievės intersticiniame audinyje, bet nerasta šalia folikulų ar geltonojo kūno, o didesni kiekiai šių ląstelių randami priešrujo metu (9). Karvių kiaušidėse šios ląstelės dėstosi išorininėje geltonkūnio kapsulėje, išoriniame pūslinio folikulo apvalkalėlyje bei šerdyje (20).

1.5.2. Putliųjų ląstelių funkcijos bei pasiskirstymas gimdoje

Putliosios ląstelės yra svarbios embriono implantacijos metu, kuomet joms degranuliuojant išskiriamas histaminas, triptazė, MMPs, VEGF. Šie faktoriai yra ypatingai svarbūs ekstraląstelinės medžiagos degradavimui, neovaskuliarizacijai, kurie yra reikalingi teisingam embriono įsitvirtinimui bei vystymuisi gimdoje (21). Sėkminga blastocitos implantacija žinduolių gimdos endometriume bei tolimesnis gleivinės ląstelių vystymasis yra priklausomas nuo ryšio tarp patelės bei vaisiaus. Teigiama, jog histaminas išskiriamas iš gimdos yra vienas iš pagrindinių veiksnių leidžiančių įvykti implantacijai, nes dalyvauja gimdos kraujagyslių pralaidumo reguliavime bei sukelia gimdos gleivinės stromos ląstelių morfologinius ir funkcinius pokyčius (21), reguliuoja kraujo pasiskirstymą placentoje (8) bei gimdos raumeninio audinio kontraktūrą nėštumo metu (30) Histaminas randamas gimdoje ir placentoje pagrinde yra išskiriamas putliųjų ląstelių. Pažymima, jog žmonių blastocitai, trofoblastas išskiria histamino relizingo faktorius, kurie sukelia putliųjų ląstelių degranuliaciją išskiriant histaminą (21). Putliosios ląstelės gali dalyvauti sukeliant priešlaikinį gimdymą (8,36). Toki priešlaikiniai gimdymai būdingi sisteminėmis mastocitozėmis (36) bei astma sergantčioms moterims (8). Patvirtina, jog suprastėjusi embriono implantacija bei placentos formavimasis pelių gimdoje, buvo susijęs su mažeseniu putliųjų ląstelių kiekiu bei c-Kit receptorių trukumu (24).

Tyrimu metų buvo įrodyta, kad šių ląstelių kiekis pelių, žiurkių, jūrų kiaulyčių bei karvių gimdoje kinta lytinio ciklo metu, kas parodo lytinių harmonų poveikį šių ląstelių skaičiui gimdoje (21). Yra pademonstruota, jog žmonių, pelių bei žiurkių putliosios ląstelės turi progesteronui ir estradioliui jautrius receptorius (29). Nustatyta, jog kumelių gimdos kaklelio audinyje putliųjų ląstelių kiekis yra didžiausias kuomet estradiolio-17β kiekis yra pakilęs (27). Putliosios ląstelės harmonų poveikyje migruoja iš periferijos į gimda, kur galutinai subręsta ir išskiria mediatorius gimdos audiniuose. Estradiolis ir progesteronas moduliuoja chemokino receptorių atsiradimą ant putliųjų ląstelių pirmtakų, randamų periferijojoje ir kartu su chemokinais pritraukia putliąsias ląsteles į gimdą. Chemokinų receptoriai CCR4, CCR5 (pas žmones) ir CCR3, CCR5 (pas žiurkes) esantys ant pultiųjų ląstelių reguliuoja šių ląstelių patekimą į gimda, esant harmoniniams pokyčiams lytinio ciklo metu. Žmonių, pelių gimda produkuoja chemokinus priklausomai nuo lytinio ciklo

22 etapo ir dalyvauja leukocitų chemotaksį, aktyvacijoje bei atsiradime audiniuose. Putliųjų ląstelių pirmtakai, kiekvieno lytinio ciklo metu, esant apvaisinimui ir nėštumui, gali migruoti iš periferijos į gimdą. Harmonų įtakos veikloje pelių gimda išskiria chemokinus, kurie dalyvauja pritraukiant putliąsias ląsteles į gimdą (21). Pažymima, jog šių ląstelių pasiskirstymas audiniuose yra priklausomas nuo rūšies ir negali būti pritaikomas skirtingom rūšims (27).

Žmonių gimdoje putliosios ląstelės daugiausiai randamos gimdos raumeniniame audinyje nei endometriume ir yra glaudžiai susijusios su gimdos neruožuotaisiais miocitais, fibroblastais bei kolagenu (25). Žiurkių gimdos gleivinėje putliosios ląstelės dažniausiai randamos stromoje arti prie epitelio ląstelių, bet ne epitelyje. Raumeniniame gimdos sluoksnyje šios ląstelės dėstosi tarp raumenų pluoštų bei kraujagyslių. Šios ląstelės gimdoje nustatytos visuose lytinio ciklo etapuose, išskyrus priešrujį (26).

1.5.3. Putliųjų ląstelių vaidmuo kiaušidžių bei gimdos patologiniuose procesuose.

Kiaušidžių cistos. Manoma, jog hormoninių pokyčių metu, putliosios ląstelės dalyvauja cistų formavimesi kiaušidėse. Esant šiam pakitimui fiksuojamas žymus progesterono, FSH lygio sumažėjimas bei padidėję estrogenų ir LH hormonų kiekiai. Kylant estradiolio kiekiu kraujyje fiksuojami didesni kiekiai putliųjų ląstelių kiaušidėse. Užsienio tyrėjų atliktų ekspermentų metu pastebėta, jog žiurkių cistinėse kiaušidėse putliosios ląstelės daugiausiai dėstosi folikulų išoriniame, vidiniame apvalkalėlyje bei kiaušidžių žievėje, ko nėra pastebima sveikose kiaušidėse. Teigiama, jog putliosios ląstelės cistinių kiaušidžių žievėje gali dalyvauti kraujotakos reguliavime. Manoma, jog šių ląstelių pasirodymas kiaušidžių žievėje gali pasitarnauti kaip biomarkeris, kuris gali parodyti besiformuojančią cistą (35). Katėms bei kalėms išskiriamos ovarinės ir paraovarinės citos (44). Iš ovarinių cistų, kiaušidės tinklo cistos kalėms yra diagnozuojamos dažniau nei kitos cistos, o katėms šio tipo cistos aptinkamos dar dažniau nei kalėms (45). Folikulinės cistos kalėms yra diagnozuojamos salyginai reičiau nei kitų tipų kiaušidžių cistos, o tokių cistų formavimąsi gali skatinti ankstyvas kalingumas (42). Paraovarinės cistos dažniau nustatomos kalėms nei katėms ir pagrinde randamos tarp kiaušidės ir gimdos rago (2).

Gimdos endometriumo polipai. Randama iki 7 kartų daugiau putliųjų ląstelių gimdoje susiformavusiuose polipuose (38). Tiksli šių ląstelių funkcija nėra žinoma, bet manoma, jog triptazė sužadinta per proteazės aktivuotus receptorius veikia, kaip augimo faktorius tam tikroms epitelio ląstelėms (37). Tiriant kales nustatyta, jog endometriumo polipai dažniau randami kartu su cistine endometriumo hiperplazija ar piometra, tačiau pasitaiko atvejų kuomet kalės yra kliniškai sveikos (41).

Endometriumo cistos ir endometriozė. Nustatyta, jog putliosios ląstelės dėliojasi aplink endometriumo cistas bei kraujagysles. Toks šių ląstelių išsidėliojimas, manoma susijęs su jų

23 dalyvavimu formuojantis fibroziniam audiniui bei audinių adhezijai (39). Putliosios ląstelės taip pat dalyvauja su endometrioze susijusio lėtinio, neuropatinio skausmo formavimesi. Šios ląstelės išskirdamos mediatorius (histaminą, TNF- α, triptazę, PGs, seratoniną, IL-1 ir NGF) gali jautrinti ar aktyvuoti pirminius nocicepcinius neuronus, o neuronų išskiriama medžiaga P, NGF gali sukelti putliųjų ląstelių degranuliaciją bei jų chemotaksį. Esant giliai, infiltruotai endometriozės formai randami didesni kiekiai degranuliuojančių putliųjų ląstelių aplink nervus (37). M.A. Demirel (2016) aprašė atvejį, kurio metu šuningai kalei kiaušidžių endometriozė sukėlė spontaninį abortą. (40).

24

2. TYRIMO METODAI IR MEDŽIAGA

Baigiamojo darbo tiriamoji dalis buvo altikta nuo 2016 metų rugsėjo 1 dienos iki 2017 metų rugsėjo 1 dienos.

Tyrimui mėginiai buvo renkami iš įvairaus amžiaus, veislės kačių, kalių rutinininių ovariohisterektomijos metu, laikantis gyvūnų gerovės bei veterinarijos reikalavimų. Visi mėginiai buvo surinki privačios praktikos metu veterinarijos klinikoje ,,X”.

Tyrimo laikotarpiu buvo surinkta 15 mėginių (n=15) su kačių, kalių gimdomis bei kiaušidėmis. Surinkta anemnezė apie gyvūną, jo amžių, lytį, veislę. Bendrai Lietuvos sveikatos mokslų universiteto, veterinarijos akademijos, veterinarinės patobiologijos katedroje histologinių tyrimų metu buvo ištirta 15 kiaušidžių bei 15 gimdų mėginių.

2.1 Histopatologinis tyrimas

2.1.1 Mėginių paruošimas bei dažymas hemotoksilino ir eozino dažais

Mėginiai surinkti rutinininių ovariohisterektomijų metu buvo sudėti į plastmasinius indelius ir fiksuoti 10 procentų formalino fosfatiniame buferiniame tirpale nuo trijų iki penkių dienų. Paruošti mėginiai pjaustomi 2 – 3 mm storio pjūviais ir dedami į biopsines kasetes. Šios kasetės yra merkiamos į šaltą tekančios srovės vandenį vienai parai. Tokiu būdu iš paimtos medžiagos yra pašalinama fiksuojamoji medžiaga.

Paruoštos biopsinės kasetės toliau yra sudedamos į audinių įmirkymo procesorių ,,Shandon Pathcentre“ (Didžioji Britanija). Toliau biopsinės kasetės buvo dehidratuotos 2 - 3 valandas 60º , 80º ir 96º etilo alkoholyje. Vėliau 1 – 3 valandas izopropanolio alkoholiu. Po šių etapų audiniai buvo skaidrinami 1- 3 valandas chloroforme. Įvykdžius šiuos etapus toliau atliekamas medžiagos užliejimas parafinu A, B, C, D, kurie trunka po 1 valandą, naudojant parafininių blokų formavimo įrenginį ,,TES99‘‘ (JAV).

3 pav. Tiriamojo darbo schema. (Autoriaus paveikslas)

Kačių, kalių ovariohisterektomijos

Mėginių surinkimas

Mėginių paruošimas, dažymas

Paruoštų mėginių vertinimas

Dažymas Giemza dažais ir skaičiavimas

25 Paruošti parafininiai blokai su tiriamaja medžiaga yra pjaustomi rotacininiu mikrotomu ,,Leica RM 2235“ (Vokietija) atliekant 4 μm storio pjūvius. Atpjovus medžiagos ji buvo perkleti į vandens vonelę, kurioje yra ištiesinami adatėlės pagalba ir perkeliami ant objektyvinio stiklelio. Toki paruošti stikleliai dedami ant stiklelių išdžiovinimo įrenginio. Išdžiūvus objektyviniams stikleliams šie buvo sudėti į 370C termostatą 24 valandoms. Toliau mėginiai yra dažomi hemotoksilino ir eozino dažais sudedant paruoštus objektyvinius stiklelius į histologinių pjūvių automatinio dažymo įrenginį ,,Sakura Tissue-Tek DRS“ (Japonija). Nudažyti stikleliai yra uždengiami dengiamaisiais stikleliai priklijuojant juos Kanados balzamą.

Paruoštų histologiniai mėginių tyrimai buvo atliekami OLYMPUS BX41 mikroskopu su integruota videokamera Olympus DP72.

2.1.2 Histologinių preparatų dažymas Gimzos metodu

Paruošti parafininiai blokai su tiriamaja medžiaga toliau yra pjaustomi rotacininiu mikrotomu ,,Leica RM 2235“ (Vokietija) atliekant 4 μm storio pjūvius. Atpjovus medžiagos ji buvo perkelta į vandens vonelę, kurioje yra ištiesinama adatėlės pagalba ir perkeliami ant objektyvinio stiklelio. Stikleliai paliekami išdžiūti.

Paruošti stikleliai toliau yra deparafinuojami. Objektyviniai stikleliai sudedami į stiklinę dėžutę su rankenėle. Deparafinavimo eiga:

1. Merkiama į ksileno tirpalą 10 minučių (2 kartus) 2. Perdedama į izopropanolio tirpalą 5 minutėms. 3. Įmerkiama į 96oC etilo alkoholį 5 minutėms.

4. Laikoma 5 minutes po tekančiu vandeniu pašalinti buvusių tirpalų likučius.

Atlikus šiuos etapus toliau vykdomas dažymas Giemza dažais ,,GS500 SIGMA Giemza stain, modified“. Dažymo eiga:

1. Stiklinė dėžutė su sudėtais objektyviniais stikleliai dedama į paruoštus Giemza dažus (80ml distiliuoto vandens ir 20ml Gimzos dažų) 1 valandai.

2. Merkiama į paruoštą acto rūgšties tirpalą (100ml distiliuoto vandens bei keli lašai ledinės acto rūgšties). Mirkinimo laikas priklauso nuo spalvos pokyčių.

3. Perkialiama į 96oC etilo alkoholį 4-5 sekundėms. 4. Perdedama į izopropanolio tirpalą 2 sekundėms. 5. Galiausiai į ksileno tirpalą.

Toliau nudažyti objektyviniai stikleliai su tiriama medžiaga imami po vieną iš ksileno tirpalo ir naudojant Kanados balzamą yra užklijuojami dengiamieji stikleliai (4pav.). Paliekami džiūti 24 valandoms.

Paruoštų histologiniai mėginių tyrimai buvo atliekami OLYMPUS BX41 mikroskopu su integruota videokamera Olympus DP72.

26

4 pav. Dengiamųjų stiklelių klijavimas ant Giemza dažais nudažytų tiriamų mėginių objektyvinių stiklelių. (Autoriaus paveikslas)

2.1.3 Paruoštų histologinių mėginių tyrimas

Pirma išanalizuoti mėginiai dažyti eozinu ir hemotoksilinu. Šiuose mėginiuose buvo įvertinta ar tiriamųjų kačių, kalių kiaušidėse bei gimdoje yra patalogijų. Taip pat buvo įvertinta, kurioje lytinio ciklo fazėje (priešrujis, porujis) yra gyvūnas vertinant kiaušidžių ir gimdos histologinį vaizda. Vertinama buvo pagal matomus kiaušidėje folikulus, geltonkūnį, gimdos gleivinės sluoksnio išvešėjimą bei liaukas. Remiantis atlikto histologinio tyrimu metu gautais duomenimis buvo sudarytos tiriamųjų grupės esančios priešrujo bei porujo lytinio ciklo fazėse.

Toliau buvo tiriama Giemza dažais dažyti histologiniai prieparatai. Skaičiuojamas putliųjų ląstelių skaičius 10 mikroskopuojamų laukų kiaušidėse bei gimdoje naudojant 20x priartinimą. Iš gautų duomenų vedamas putliųjų ląstelių skaičiaus aritmetinis vidurkis.

2.2 Statistinė analizė

Statistinės analizės tikslas nustatyti kuomet putliųjų ląstelių kiekis yra didžiausias kiaušidės bei gimdoje. Atlikus histologinių prieparatų vertinimą bei pasitelkus anamnezės duomenis apie tiriamą gyvūną buvo sudarytos tiriamųjų grupės. Iki vienerių metų grupę (<1m.) sudarė iš viso 6 tiriamieji (n=6) iš kurių 4 buvo katės (n=4) bei 2 kalės (n=2).Virš vienerių metų grupėje buvo iš viso 9 tiriamieji (n=9) iš kurių 5 buvo katės (n=5) ir 4 kalės (n=4). Kitoje grupėje, kurią sudarė priešrujyje esantys tiriamieji gyvūnai iš viso buvo 11 tiriamųjų (n=11), kuriuos sudarė 7 katės (n=7) bei 4 kalės (n=4). Porujo grupėje buvo 2 katės (n=2) ir 2 kalės (n=2).

Gauti skaičiavimai buvo atlikti naudojantis statistinės analizės programa Microsoft ,,EXCEL 2010“. Suskaičiuoti vidurkiai, standartiniai nuokrypiai, mediana. Palygintos tiriamųjų grupės ir nustatytas rodiklių statistinis patikimumas. Tyrimo duomenys patikimi kai p<0,05, p<0,01, ir p<0,001 ir nepatikimi, kai p> 0,05. Toliau pateikiamos nuotraukos baigiamojo darbo autoriaus.

27

3.

TYRIMO REZULTATAI

Baigiamojo darbo tiriamoji dalis buvo altikta nuo 2016 metų rugsėjo 1 dienos iki 2017 metų rugsėjo 1 dienos. Tyrimui mėginiai rinkti iš įvairaus amžiaus, veislės kačių, kalių rutinininių ovariohisterektomijų metu, laikantis gyvūnų gerovės bei veterinarijos reikalavimų. Tyrimo laikotarpiu buvo surinkta 15 mėginių (n=15) su kačių, kalių gimdomis bei kiaušidėmis.

5 pav. Putliųjų ląstelių skaičius kačių kiaušidėse bei gimdoje tiriamųjų grupėje iki 1 metų (n=4).

Remiantis tyrimo duomenimis (5 pav.) kačių grupės kiaušidėse iki 1 metų amžiaus iš tirtų 4 tiriamųjų putliųjų ląstelių vidutiniškai buvo randama 1,88±2,45, mediana 1,1. Gimdoje šie skaičiai buvo mažesni ir vidutiniškai viename mikroskopuojamame lauke (6 pav.) buvo nustatyta 1,38±1,47 putliųjų ląstelių, mediana 0,85. Lyginant su grupe virš 1 metų amžiaus statistiniai duomenys yra nepatikimi (p>0,05).

6 pav. Putliosios ląstelės katės gimdoje. Didinimas 10x. Dažyta Giemza dažais. Putliosios ląstelės pažymėtos rodyklėmis, kraujagyslė (b), vidinis žiedinis raumenins sluoksnis (c),

kraujagyslinis sluoksnis (d), išorinis išilginis raumeninis sluoksnis (e).

b

e

d

c

28

7 pav. Putliųjų ląstelių skaičius kačių kiaušidėse bei gimdoje tiriamųjų grupėje virš 1 metų (n=5).

Atlikto histologinio tyrimo metu (7 pav.) kačių kiaušidėse, grupėje virš 1 metų amžiaus, buvo nustatyta, jog viename mikroskopuojamame kiaušidžių lauke (8 pav.) putliųjų ląstelių vidutiniškai buvo suskaičiuojam apie 6,68±3,74 regimajame lauke, mediana 4,3. Gimdoje šie skaičiai buvo mažesni nei kiaušidėse, kuomet regimajame lauke buvo suskaičiuojam apie 4,76±2,27 putliosios ląstelės, mediana 4. Palyginus tirtų grupių duomenis (iki 1 metų ir virš 1 metų) tarp putliųjų ląstelių kiekio kiaušidėse bei gimdoje nebuvo nustatytas statistiškai patikimas rezultatas, nes p>0,05.

8 pav. Putliosios ląstelės katės kiaušidės šerdyje. Didinimas 10x. Dažyta Giemza dažais. Putliosios ląstelės pažymėtos rodyklėmis.

29

9 pav. Putliųjų ląstelių skaičius kalių kiaušidėse bei gimdoje tiriamųjų grupėje iki 1 metų (n=2).

Remiantis tyrimo duomenimis (9 pav.) vidutiniškai kalių kiaušidėse iki 1 metų amžiaus iš tirtų 2 tiriamųjų vidutiniškai putliųjų ląstelių buvo randama 0,7±0,57, mediana 0,7. Gimdoje šie skaičiai buvo mažesni ir vidutinškai 10 mikroskopuotų laukų (10 pav.) buvo nustatyta 1,25±0,07 putliųjų ląstelių, mediana 1,25. Lyginant su kalių grupe virš 1 metų amžiaus statistiniai duomenys yra nepatikimi (p>0,05).

10 pav. Putliosios ląstelės kalės gimdoje. Didinimas 10x. Dažyta Giemza dažais. Putliosios ląstelės pažymėtos rodyklėmis.

30

11 pav. Putliųjų ląstelių skaičius kalių kiaušidėse bei gimdoje tiriamųjų grupėje virš 1 metų (n=4).

Kalių grupėje virš vienerių metų (11 pav.) iš tirtų 4 tiriamųjų putliųjų ląstelių kiekis 10 mikroskopuojamų laukų kiaušidėse (12 pav.) vidutiniškai buvo 6,78±0,94, mediana 6,65, o gimdoje 6,4±2,6, mediana 5,55. Palyginus šiuo duomenis su grupe iki vienerių metų nebuvo nustatytas statistiškai patikimas rezultatas (p>0,05).

12 pav. Putliosios ląstelės kalės kiaušidės šerdyje. Didinimas 10x. Dažyta Giemza dažais. Putliosios ląstelės pažymėtos rodyklėmis.