GENŲ DALYVAUJANČIŲ PATOLOGINĖJE ANGIOGENEZĖJE SĄSAJOS SU BURNOS DUGNO VĖŢIO IŠSIVYSTYMU

LIETUVOS SVEIKATOS MOKSLŲ UNIVERSITETAS

MEDICINOS AKADEMIJA

MEDICINOS FAKULTETAS

NEUROMOKLSLŲ INSTITUTAS

OFTALMOLOGIJOS LABORATORIJA

GENŲ DALYVAUJANČIŲ PATOLOGINĖJE ANGIOGENEZĖJE

SĄSAJOS SU BURNOS DUGNO VĖŢIO IŠSIVYSTYMU

Medicinos vientisųjų studijų programos

Baigiamasis magistro darbas

Darbą atliko: Vaiva Tamulionytė

Darbo vadovas: m. dr. Doc. Rasa Liutkevičienė

2

TURINYS

SANTRAUKA ... 4 SUMMARY ... 6 PADĖKA ... 8 INTERESŲ KONFLIKTAS ... 8

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS ... 8

SANTRUMPOS ... 9

SĄVOKOS ... 10

ĮVADAS ... 11

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI ... 12

1. LITERATŪROS APŢVALGA ... 13

1.1. BURNOS ERTMĖS DUGNO VĖŢYS. ... 13

1.1.2. Diagnostika, gydymas. ... 14

1.2. ANGIOGENEZĖ ... 15

1.3. NAGRINĖJAMI GENAI IR JŲ POLIMORFIZMAI ... 15

1.3.1. KCTD10 rs5620906 ... 16 1.3.2. VEGFA rs83306 ... 16 1.3.3. CFI rs10033900 ... 17 1.3.4. COL10A1 rs106458... 17 1.3.5. RAD51B rs801790 ... 17 1.3.6. RP1L1 rs3924612 ... 18 1.3.7. TIMP3 rs180079 ... 18

2. TYRIMO MEDŢIAGA IR METODAI ... 19

2.1.TYRIMO PLANAVIMAS ... 19

2.2.TYRIMO OBJEKTAS ... 19

2.3.TYRIMO METODAI ... 19

2.3.1 Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) išskyrimo metodika ... 20

2.3.2.Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) skyrimas pasitelkiant DNA salting-out–druskų sodinimo metodą ... 20

2.3.3. Druskų nusodinimo eiga. ... 22

2.3.4. DNR koncentracijos matavimai naudojant spektrofotometrą ... 22

2.3.5. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas TL – PGR (tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos) metodu ... 23

3

3. REZULTATAI ... 26

3.1. GENŲ, DALYVAUJANČIŲ PATOLOGINĖJE ANGIOGENEZĖJE POLIMORFIZMŲ GENOTIPŲ DAŢNIŲ ANALIZĖ SERGANTIEMS BURNOS DUGNO VĖŢIU IR KONTROLINĖS GRUPĖS ASMENIMS ... 26

3.2. GENŲ, DALYVAUJANČIŲ PATOLOGINĖJE ANGIOGENEZĖJE POLIMORFIZMŲ GENOTIPŲ SĄSAJŲ SU MORFOLOGINIU BEI KLINIKINIU LIGOS PASIREIŠKIMU ANALIZĖ ... 29

3.3. GENŲ, DAYVAUJANČIŲ PATOLOGINĖJE AGIOGENEZĖJE POLIMORFIZMŲ GENOTIPŲ DAŢNIŲ ANALIZĖ ATSIŢVELGIANT Į TIRIAMŲJŲ LYTĮ IR AMŢIŲ ... 30

4.REZULTATŲ APTARIMAS ... 35

5. IŠVADOS ... 39

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS... 40

4

SANTRAUKA

Baigiamojo magistro darbo autorius: Vaiva Tamulionytė

Tema: Genų dalyvaujančių patologinėje angiogenezėje sąsajos su burnos dugno vėţio išsivystymu. Mokslinis vadovas: m. dr. Doc. Rasa Liutkevičienė

Atlikimo vieta: Lietuvos sveikatos mokslų universitetas, Neuromokslų institutas, Oftalmologijos

laboratorija

Darbo tikslas: Įvertinti genų, dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmų sąsajas su

burnos dugnovėţio pasireiškimu.

Darbo uţdaviniai:

1. Nustatyti genų dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmus sergantiems burnos dugno vėţiu ir sveikiems kontrolinės grupės asmenims.

2. Įvertinti genų dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmus sergantiems burnos dugno vėţiu pagal morfologinį bei klinikinį ligos pasireiškimą.

3. Įvertinti genų dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmus sergantiems burnos dugno vėţiu atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį bei amţių.

Tyrimo metodika: Ištirti 56 pacientai, kuriems diagnozuotas burnos dugno vėţys ir 150 sveikų

kontrolinės grupės asmenų. DNR buvo išskirta iš tiriamųjų veninio kraujo,naudojant druskų nusodinimo metodą. Genotipavimui pasitelkta tikro laiko PGR metodika. Statistinė analizė atlikta naudojant programinį paketą IBM SPSS Statistics 25.

Rezultatai: Tyrime buvo pasirinkti šie genų polimorfizmai: KCTD10 rs5620906; VEGFA rs833068; CFIrs10033900; COL10A1 rs106458; RAD51B rs801790; RPIL1 rs3924612; TIMP3 rs1800795.

Gauti rezultatai parodė, jog genų polimorfizmų KCTD10 rs5620906 ir VEGFA rs833068 genotipų skirtumai buvo statistiškai reikšmingi tarp sergančiųjų burnos dugno vėţiu bei kontrolinės grupės asmenų. Abiejų šių polimorfizmų heterozigotinis AG genotipas yra statistiškai reikšmingai daţnesnis kontrolinėje grupėje (p=0,0214 ir p=0,013). Atlikus dvinarę logistinę regresiją nustatyta, kad geno

KCTD10 polimorfizmo rs56209061 AG genotipas siejamas su apie 70% sumaţėjusia tikimybe sirgti

burnos dugno vėţiu kodominantiniame modelyje (p=0,011) ir overdominiantiniame modelyje (p=0,017). Tiriant geno VEGFA polimorfizmą rs833068 stebima, jog AG ir AA genotipai lyginant su GG genotipu kodominantiniame modelyje, galimybę sirgti burnos dugno vėţiu maţino 0,3 karto (p=0,001; p=0,052). Dominantiniame modelyje AG ir AA genotipai lyginant su genotipu GG šią galimybę maţina 0,5 karto (p=0,026), overdominantiniame modelyje – 0,3 karto (p=0,017). Taip pat

5

stebėti ir statistiškai reikšmingi skirtumai atsiţvelgiant į vyrišką lytį – nustatyta, jog kiekvienas A alelis maţina galimybę vystytis bunos dugno vėţiui apie 0,4 karto (p=0,005).

Išvados: Genų polimorfizmų KCTD10rs5620906 ir VEGFA rs833068 heterozigotinio genotipo

daţniai statistiškai reikšmingai daţnesni tarp kontrolinės grupės asmenų lyginant su burnos dugno vėţiu sergančiaisiais. Tyrimui pasirinktų polimorfizmų genotipų daţnis nebuvo statistiškai reikšmingas atsiţvelgaint į klinikinę ir morfologinę burnos dugno vėţio išraiškas. Pagal tiriamųjų lytį nustayta, jog

KCTD10 rs5620906 ir VEGFA rs833068 A aleliai maţino galimybę vystytis burnos dugno vėţiui tarp

vyrų; su amţiumi susijusių skirtumų nustatyta nebuvo.

6

SUMMARY

Author of master thesis: Vaiva Tamulionytė

Title: Genes taking part in pathological angiogenesis association with mouth floor cancer. Scientific supervisor: MD – PhD. Rasa Liutkevičienė

Work was performed at: Lithuanian University of Health Sciences; Neuroscience Institute,

Laboratory of Ophthalmology.

Purpose: To determine genes taking part in pathological angiogenesis associations with mouth floor

cancer.

Tasks:

1. To determine genes taking part in pathological angiogenesis polymorphisms between affected and control group.

2. To determine genes taking part in pathological angiogenesis polymorphisms in affected group by clinical stages and tumor morphology.

3. To determine genes taking part in pathological angiogenesis polymorphisms in affected group by gender and age.

Methods: The study enrolled 56 patients with mouth floor cancer and 150 people of control group.

DNA was purified from peripheral venous blood by salting-out method. Genotyping was performed by using real-time polymerase chain reaction. For statistical analysis results were calculated by IBM SPSS

Statistics 25.

Results: Polymorphisms as such were chosen for this study: KCTD10 rs5620906; VEGFA rs833068; CFI rs10033900; COL10A1 rs106458; RAD51B rs801790; RPIL1 rs3924612; TIMP3 rs1800795.Data

analysis showed that KCTD10 rs5620906 and VEGFA rs83306 genotype differences were statistically significant between patients with mouth floor cancer and control group. In both polymorphisms genotype AG was significantly more frequent in control group (p=0,0214 ir p=0,013). After binary logistic regression analysis it is concluded that gene KCTD10 polymorphism rs56209061 genotype AG reduces the risk of mouth floor cancer development by 70% in codominant model (p=0,011) and overdominant model (p=0,017). Gene VEGFA polymorphism rs833068 genotypes AG and AA comparing to genotype GG reduces the risk by 0,3 times (p=0,001; p=0,052). In dominant model – by 0,5 times (p=0,026), in overdominant model – by 0,3 times (p=0,017). Also, we determined that each A allele reduces the risk by 0,4 times (p=0,005) between males of affected and control groups.

Conclusions: Both gene polymorphisms KCTD10 rs5620906 and VEGFA rs833068 heterozygous

7

genotypes and clinical stage of cancer or tumor morphology. It was determined that each A allele reduces the risk by 0,4 times (p=0,005) between males of affected and control groups. There were no significant differences between distinctive age groups or female gender.

8

PADĖKA

Dėkoju m. dr. doc. Rasai Liutkevičienei uţ operatyvų, profesionalų ir rūpestingą vadovavimą rašant baigiamąjį magistro darbą; m. dr. doc. Vykintui Liutkevičiui uţ pagalbą planuojant ir renkant duomenis tyrimui. Dėkoju Neuromokslų instituto oftalmologijos laboratorijos genetikėms Gretai Gedvilaitei bei Alvitai Vilkevičiūtei uţ naudingas įţvalgas, patarimus ir visokeriopą metodinę pagalbą.

INTERESŲ KONFLIKTAS

Autoriui nebuvo interesų konflikto.

ETIKOS KOMITETO LEIDIMAS

9

SANTRUMPOS

LSMU – Lietuvos sveikatos mokslų universitetas DNR – deoksiribonukleininė rūgštis

RNR – ribonukleininė rūgštis

TL-PGR – tikro laiko polimerazės grandininė reakcija VNP – vieno nukleotido polimorfizmas

OSCC – Oral Squamous Cell Carcinoma/ Burnos Plokščialąstelinė Karcinoma TJA – tarpląstelinis jungiamasis audinys

MDK – multidisciplininis konsiliumas KT – kompiuterinė tomografija

MRT – magnetinio rezonanso tyrimas ANG – ausų, nosies ir gerklės

GS – galimybių santykis

10

SĄVOKOS

Angiogenezė – naujų kraujagyslių augimas iš jau esančios vaskuliarizacijos. Karcinogenezė – procesas, kurio metu normalios ląstelės virsta vėţinėmis.

Genotipas – organizmo paveldimumo faktorių, esančių organizmo chromosomose, visuma.

11

ĮVADAS

Onkologiniai susirgimai yra viena iš pasaulyje dominuojančių mirties prieţasčių šiandien. Viena daţniausių lokalizacijų neoplazminiams procesams – burnos ertmė. Burnos ertmės vėţys apima 2-4% visų navikinių susirgimų [1,2]. Jis priskiriamas galvos ir kaklo navikų grupei, yra daţnesnis bei sukelia daugiau mirčių, nei bet kuris kitas burnos ertmės susirgimas [3]. Burnos ertmės vėţys apima neoplazijų grupę, kurios lokalizuojasi bet kuriame gerklų, seilių liaukų, prienosinių ančių, burnos ertmės regione: lieţuvyje (daţniausias atvejis), skruostuose, gomuryje, burnos dugne [4]. Šiame darbe bus tiriami burnos dugno vėţiu sergantys pacientai.

Literatūroje burnos ertmės vėţys dar vadinamas OSCC (oral squamous cell carcinoma / burnos plokščialąsteline karcinoma). Ši histologinė forma pati daţniausia iš visų burnos neoplazijų, sudaro daugiau nei 90% visų atvejų [1, 2].

Rizikos veiksniai, darantys įtaką burnos ertmės vėţio išsivystymui yra tabako ir alkoholio vartojimas, genetinė predispozicija [5].

Karcinogenezė yra sudėtinis procesas, kuris apjungia onkogenų ir tumorosupresinių genų sąveiką. Šiuo metu ypatingas dėmesys yra skiriamas būtent įvairių genetinių veiksnių nagrinėjimui. Molekuliniai vėţio ţymenys, atsiţvelgiant į jų funkcijas, skirstomi į penkias grupes: naviko augimo, proliferacijos ir apoptozės, naviką slopinantys, imuninio atsako, naviko invazijos ir metastazavimo, angiogenezės [6].

Taigi, šio darbo tikslas yra nustatyti genų, dalyvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmų sąsajas su burnos dugno vėţio pasireiškimu. Ir nors nei vieno iš minėtų ţymenų nustatymas nėra taikomas rutiniškai klinikinėje praktikoje, daugelio atliktų mokslinių tyrimų autoriai tiki jų sėkmingo panaudojimo galimybe įvertinant diagnozuojant, prognozuojant, pasirenkant tinkamesnę medikamentinio gydymo schemą pacientams, sergantiems burnos dugno vėţiu.

Tikimasi, jog pasirinktų genų polimorfizmų sąsajos suteiks naujos informacijos apie burnos dugno vėţio vystymąsį.

12

DARBO TIKSLAS IR UŢDAVINIAI

Darbo tikslas

Nustatyti genų, dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmų sąsajas su burnos dugno vėţio pasireiškimu.

Darbo uţdaviniai

1. Nustatyti genų dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmus sergantiems burnos dugno vėţiu ir sveikiems kontrolinės grupės asmenims.

2. Įvertinti genų dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmus sergantiems burnos dugno vėţiu pagal morfologinį bei klinikinį ligos pasireiškimą.

3. Įvertinti genų dayvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmus sergantiems burnos dugno vėţiu atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį bei amţių.

13

1. LITERATŪROS APŢVALGA

Literatūros apţvalga buvo vykdoma ieškant informacijos elektroninėse mokslinių straipsnių šaltiniuose (PubMed, Science direct), vadovėliuose, statistinių duomenų bazėse bei genų ţemėlapiuose. Naudoti tokie raktiniai ţodţiai, kaip: oral cancer, pathological angiogenesis,

angiogenesis participating genes, cancer genetics; buvo apţvelgta pagrindinė informacija, aktualijos,

reikalingos darbo reikšmės, naujumo suvokimui bei tolesniam darbo vystymui.

1.1. Burnos ertmės dugno vėţys.

1.1.1. Anatomija, paplitimas, patogenezė.

Burno ertmės dugno anatomija yra labai svarbi, kai nagrinėjamas šios srities onkologinis susirgimas. Neoplazijos lokalizacija gali tiesiogiai sąlygoti metastazavimo kelius, paciento funkcinius sutrikimus bei ligos prognozę [7].

Burnos ertmės dugnas sudaro apatinę burnos ertmės sieną. Tai pasagos formos struktūrų visuma, esanti po judančia lieţuvio dalimi sudaryta iš raumenų virš polieţuvinio kaulo: m.

Mylohyoideus; m. Genohyoideus. Burnos dugne esti tokios struktūros, kaip polieţuvinė liauka ir jos

latakas; gilioji paţandinės liaukos dalis ir jos latakas; lieţuvio pasaitėlis; gilioji lieţuvio arterija ir venos; lieţuvinis nervas. Burnos dugnas siejasi su kitomis organizmo anatominėmis sritimis, iš kur galimos metastazės (pvz.: nosies ertmė, prienosiniai ančiai). Struktūros iš kaklo ir infratemporalinės duobės susisiekia su burnos ertmės dugnu per didesniąją trikampę apertūrą. Polieţuvinis kaulas skiria burnos ertmės dugną nuo dorsaliai esančios ryklės ir ţemiau išsidėsčiųsių gerklų [8, 9].

Burnos ertmės dugnas yra gerai vaskuliarizuotas, krauju jį aprūpina lieţuvinė arterija, o drenuoja dorsalinė ir gilioji lieţuvio venos. Įnervacija – lieţuvinis nervas prasideda infratemporalinėje duobėje ir priekine jos dalimi eina iki burnos ertmės dugno. Limfotaka yra ypač svarbi dėl tolimesnio navikinio audinio plitimo iš burnos ertmės dugno. Limfa iš pasmakrinių ir poţandikaulinių limfmazgių yra drenuojama į giliuosius kaklo limfmazgius [9].

Burnos ertmė išklota minkšta, rausva gleivine, kuri padengta daugiasluoksniu plokščiuoju neragėjančiu epiteliu, iš kurio, dėl vykstančios karcinogenezės, gali išsivystyti burnos ertmės vėţinis susirgimas, tad daţniausiai tai – karcinomos [2]. Burnos ertmės dugno vėţys gali pasireikšti, kaip pirminis paţeidimas burnos ertmės audiniuose, taip pat, kaip atokioji metastazė ar šalia esančios struktūros (pvz.: nosies ertmės) naviko tąsa [10].

14

Didţiausias sergamumas stebimas penktąjį gyvenimo dešimtmetį. Sergant OSCC 5 metų išgyvenamumas yra 40 – 50%. Šis vėţys daţnai yra diagnozuojamas jau paţengus navikiniam susirgimui, nors ir yra sąlyginai nesunkiai kliniškai apţiūrimoje burnos ertmėje [11]. Daţniausiomis vėlyvos diagnostikos prieţastimis įvardinamos šios: gydytojo arba paciento neatidumas pirmiesiems simptomams ir uţdelstas kreipimasis į gydymo įstaigą, vėlyva specialisto apţiūra bei klaidinga preliminari diagnozė. Dėl vėlyvoje stadijoje diagnozuojamo vėţio, stebimos traumuojančios, gyvenimo kokybę bloginančios komplikacijos: disfagija, kalbos sutrikimai, veido – kaklo malformacijos [11, 12].

Kaip ir kitiems onkologiniams susirgimams, taip ir burnos dugno vėţio vystymuisi svarbi karcinogenezė. Tai pakitimai, kurie vyksta ląstelėje dėl cheminių, fizinių, biologinių ir genetinių veiksnių. Piktybinių navikų augimas – daugiapakopis procesas, kuriame navikinių ląstelių plitimas priklauso nuo proteolizės proceso sąlygoto ląstelės – tarpląstelinio jungiamojo audinio (TJA) tarpusavio sąveikos. Vėţinės ląstelės atsidalinusios nuo pirminio naviko skverbiasi per bazines membranas ir stromos TJA. Navikui progresuojant aplinkiniai audiniai intensyviai ardomi dėl naviko išskiriamų aktyvių medţiagų, kurios ardo TJA, stimuliuoja patologinę angiogenezę [6].

1.1.2. Diagnostika, gydymas.

Pirminei diagnostikai svarbu visus pacientus, kuriems stebimi neţinomos kilmės paţeidimai burnos gleivinėje ilgiau nei dvi savaites, nedelsiant nukreipti gydytojo specialisto konsultacijai. Dėmesį derėtų atkreipti į visas ţaizdas ir opas, patinimą, skausmą, lieţuvio ar dantų tirpimą, kraujavimą, kaklo tinimą, nemalonų kvapą iš burnos (fetor). Ausų, nosies ir gerklės (ANG) ligų gydytojo konsultacijos metu turėtų būti įvertinama, ar tai nėra kito naviko tąsa [13]. Taip pat reikomenduojama paskirti tyrimus tikslioms naviko riboms nustatyti bei tolimųjų metastazių paieškai: kompiuterinę tomografiją (KT) ir magnetinio rezonanso tyrimą (MRT). Naviko morfologijai nustatyti reikalingas histologinis ištyrimas iš biopsinės ar intraoperacinės medţiagos pavyzdţių [14].

Gydymas privalo būti individualus, priimtas multidisciplininių konsiliumų (MDK) metu, kuriuose dalyvauja gydytojai specialistai – veido ir ţandikaulių chirurgai, ANG ligų gydytojai, radiologai, onkologai ir patologai. Svarstant dėl galimo chirurginio gydymo reikia atsiţvelgti į operacijos radikalumo galimybę (5mm ir daugiau sveikas rezekcinis kraštas – siekiamybė) ir paciento gyvenimo kokybę po operacijos. Į operacijos planą būtina įtraukti ir reikalingus rekonstrukcinius veiksmus bei priemones. Taip pat radikalumui pasiekti gali prireikti I – III zonos sritinių limfmazgių pašalinimo [15, 16].

15

Pooperacinis gydymas taip pat turėtų būti aptariamas MDK metu dėl kiekvieno atvejo individualumo ir atliktos operacijos radikalumo. Pooperacinė radioterapija ar radiochemoterapija yra rekomenduojama pacientams, kurių liga yra klasifikuojama kaip T3 – T4, operacijos metu sveikas rezekcinis kraštas buvo per siauras arba ties naviko riba, taip pat, jei navikinis procesas aptinkamas ir nerviniame audinyje, kraujagyslėse ar limfmazgiuose. Rekomenduojama pradėti radioterapiją kuo anksčiau po operacijos [17]. Pirminiam konservatyviam gydymui turėtų būti skiriama kombinuota radiochemoterapija, kurios rezultatai yra apie 30% geresni, nei atskirai taikant radioterapiją ar chemoterapiją [18]. Chemoterapijai daţniausiai naudojami cisplatinos preparatai, gydymas jais teikia 2,5 karto geresnius rezultatus lyginant su chemoterapijos schemomis, kuriose nebuvo įtraukta cisplatinos preparatų [18, 19]. Gydymą tęsti turėtų paciento reabilitacija ir rekonstrukcinės procedūros, tokios kaip dantų implantacija, burnos ertmės plastika, įvairūs protezai bei fonopediniai uţsiėmimai [20].

1.2. Angiogenezė

Angiogenezė - naujų kraujagyslių susidarymas iš jau esančios vaskuliarizacijos. Ţinduolių populiacijose egzistuoja genetinės variacijos, kurios daro įtaką angiogenezei. Šie pakitimai, esantys angiogenezeje dalyvaujančiuose genuose yra siejami su padidėjusia rizika sirgti ligomis, kurių etiologijoje jie vaidina svarbų vaidmenį, pavyzdţiui, artritu, endometrioze, diabetine retinopatija, sarkoidoze, psoriaze ir įvairiais onkologiniais susirgimais [21].

Angiogenezė yra kritiškai svarbi ne tik vėţio atsiradimui, bet ir progresavimui. Normali angiogenezė yra reguliuojama proangiogeninių ir antiangiogeninių molekulių, kurių balanso sutrikimas yra stebimas onkologinių procesų metu [22]. Vykstant patologinei angiogenezei pasireiškia didesnė ir spartesnė, nei įprastai audinio vaskuliarizacija bei netaisyklinga kraujagyslių remodeliacija. Molekulinės genetikos tyrimų rezultatai nurodo skirtumus tarp normalios ir patologinės angiogenezės, išskiria pagrindinius genus, kurie yra atsakingi uţ patologinę angiogenezę [23].

1.3. Nagrinėjami genai ir jų polimorfizmai

Šio tyrimo metu nustatysime šių genų polimorfizmo sąsajas su burnos dugno vėţio išsivystimu:

KCTD10 rs5620906; VEGFA rs833068; CFIrs10033900; COL10A1 rs106458; RAD51B rs801790; RPIL1 rs3924612; TIMP3 rs180079.

16 1.3.1. KCTD10 rs5620906

POTASSIUM CHANNEL TETRAMERIZATION DOMAIN-CONTAINING PROTEIN 10

KCTD10 genas yra lokalizuotas 12-os ţmogaus chromosomos ilgajame petyje - 12q24.11 (1 paveikslas). Jo koduojamas baltymas prisijungia proliferuojančios ląstelės branduolio antigeną (Proliferating Cell Nuclear Antigen - PCNA) ir gali būti įtraukiamas į DNR sintezę bei ląstelių

(galimai ir endotelio) proliferaciją, tikėtina, jog tai turi įtakos ir angiogeniniams procesams. Yra duomenų, jog tam tikri šio geno polimorfimai yra atsakingi uţ lipidų apykaitą ir aukštesnę didelio tankio proteinų koncentraciją plazmoje [24]. Taip pat nustatyta, jog šio geno koduojamas baltymas gali būti tumorsupresorius [25]. Didţiausia geno ekspresija randama skydliaukėje bei endometriume.

1 paveikslas. Geno KCTD10 vieta 12-oje žmogaus chromosomoje (pažymėta raudonai)

1.3.2. VEGFA rs83306

VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR A

VEGFA genas lokalizuotas 6-os ţmogaus chromosomos trumpajame petyje - 6p21.2 (2 paveikslas). Šis genas priklauso PDGF/VEGF augimo faktorių šeimai. Koduoja hepariną jungiantį

proteiną, kuris veikia kaip disulfidinės jungties homodimeras. Jis yra būtinas normaliai ir patologinei angiogenezei. Suţadina endotelio ląstelių augimą, sukelia ląstelių migraciją ir inhibuoja apoptozę [26]. Šio geno mutacijos buvo susietos su proliferuojančia ir neproliferuojančia diabetine retinopatija, įvaririais onkologiniais susirgimais. Įrodyta tiesioginė koreliacija tarp VEGFA geno ekspresijos ir navikų stadijos bei vystymosi [27].

17 1.3.3. CFI rs10033900

COMPLEMENT FACTOR I

CFI genas lokalizuotas 4-os ţmogaus chromosoms ilgajame petyje - 4q25 (3 paveikslas). Šis

genas koduoja serino proteinazę, kuri yra būtina reguliuojant komplemento kaskadą, tad tai yra itin svarbi mūsų imuniteto sudedamoji dalis. Įrodyta, jog komplemento kaskados defektai galimai susiję su onkologinių ligų pasireiškimu. Taip pat, esantys šiame gene yra siejami su predispozija atipiniam hemolitiniam sindromui ir su senatvine geltonosios dėmės degeneracija [28,29].

3 paveikslas.Geno CFI vieta 4-oje žmogaus chromosomoje (pažymėta raudonai)

1.3.4. COL10A1 rs106458

COLLAGEN TYPE X ALPHA 1 CHAIN

COL10A1 genas lokalizuotas 6-os ţmogaus chromosomos ilgajame petyje – 6q22.1 (4

paveikslas). Šis genas koduoja X tipo kolageno alpha grandinę, trumpos grandinės kolageną.

COL10A1 geno mutacijos yra siejamos su metafizine chondrodisplazija. Šio geno kodojamas baltymas

yra pradinėse tyrimų fazėse, kaip biomarkeris storosios ţarnos navikams [30].

4 paveikslas. Geno COL10A1 vieta 6-oje žmogaus chromosomoje (pažymėta raudonai)

1.3.5. RAD51B rs801790

RAD51 RECOMBINASE PARALOG B

RAD51B genas lokalizuojasi 14-os ţmogaus chromosomos ilgajame petyje – 14q24.1 (5

paveikslas). Skatina centrinės rekombinazės aktyvumą ir taip dalyvauja homologiniame rekombinantiniame DNR atkūrime. Nesant ar trūkstant RAD51B baltymo nesusidaro nukleoproteino filamentas ir tokiu būdu paţeidţiama DNR, ko pasekoje didėja galimybė sutrikti onkogenų – tumorosupresorių balansui ir vystytis onkologiniam procesui [31].

18 5 paveikslas. Geno RAD51B vieta 14-oje žmogaus chromosomoje (pažymėta raudonai)

1.3.6. RP1L1 rs3924612

RETINITIS PIGMENTOSA 1-LIKE 1 PROTEIN

RP1L1 genas lokalizuojasi 8-os ţmogaus chromosomos trumpajame petyje – 8p23.1 (6

paveikslas). Šis genas koduoja baltymus, kurie priklauso dvigubų kortinų šeimai. Jie sudaryti iš dviejų N-terminalinių sričių, kurios riša mikrotubules ir reguliuoja jų polimerizaciją, taip pat iš dviejų didelių C-terminalinių sričių, kuriose gausu gliutamino ir gliutamato rūgšties pėdsakų [32]. Tai tinklainei specifiškas baltymas, kurio ilgis varijuoja priklausomai nuo individų. Šis baltymas sinergistiškai veikia su kitu, tik tinklainei specifišku baltymu RP1 ir uţima itin svarbią vietą fotosensibilizacijoje. Mutacijos RP1L1gene yra siejamos su okultine makuline distrofija [33].

6 paveikslas. Geno RP1L1 vieta 8-oje žmogaus chromosomoje (pažymėta raudonai)

1.3.7. TIMP3 rs180079

TIMP METALLOPEPTIDASE INHIBITOR 3

TIMP3 genas lokalizuojasi 22-os ţmogaus chromosomos ilgajame petyje – 22q12.3 (7

paveikslas). Šis genas priklauso TIMP genų šeimai. Jis koduoja matricos metaloproteinazės inhibitorius, tai tokios peptidazės, kurios yra susijusios su ekstraceliulinės matricos degradacija. Šio geno ekspresiją indukuoja mitogeninės stimuliacijos atsakas. Mutacijos šiame gene siejamos su Sorsby dugno distrofija, paveldima autosominiu dominantiniu būdu [34, 35].

19

2. TYRIMO MEDŢIAGA IR METODAI

2.1. Tyrimo planavimas

Baigiamasis magistro darbas ir jo tyrimai buvo atliekami LSMU Neuromokslų instituto oftalmologijos laboratorijoje.

Šis tiriamasis darbas atliktas trijų pakopų principu. Pirmoji – literatūros ir problemos aktualumo analizė. Antroji pakopa – tyrimai laboratorijoje pagal standartizuotas metodikas su reikalingais reagentais ir atitinkama aparatūra. Trečiosios pakopos metu buvo vertinami gauti rezultatai, atliekama jų statistinė analizė.

2.2. Tyrimo objektas

Baigiamojo magistro darbo tyrimų metu buvo nagrinėjami šie genų polimorfizmai bei jų patogeneziniai mechanizmai: KCTD10 rs5620906; VEGFA rs833068; CFIrs10033900; COL10A1

rs106458; RAD51B rs801790; RPIL1 rs3924612; TIMP3 rs180079.

Tyrimai atlikti pacientams, kuriems diagnozuotas burnos dugno vėţinis susirgimas (n=56) ir kontrolinei grupei, kurią sudarė terapiškai sveiki asmenys (n=150).

2.3. Tyrimo metodai

Tiriamųjų grupės sudarymo kriterijai:

1. Diagnozuotas burnos dugno vėţinis susirgimas. 2. Pasirašyta informuoto asmens sutikimo anketa. Kontrolinės grupės sudarymo kriterijai:

1. Otorinolaringologiškai sveiki tiriamieji.

2. Asmenys, kurie neserga lėtinėmis ar ūminėmis infekcinėmis bei neinfekcinėmis ligomis.

20 2.3.1 Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) išskyrimo metodika

DNR buvo išskiriama iš kraujo surinkto į standartinius vakuuminius megintuvėlius, kuriuose yra antikoagulianto EDTA (etilendiamintetraacetato). Toks kraujo saugojimo būdas buvo pasirinktas norint išvengti mikrokoaguliacijos. DNR išskyrimas vykdytas iš leukocitų esančių periferiniame kraujyje.

Pirmieji DNR išskyrimo etapai yra svarbūs nukleazių inaktyvinimui, nes jos gali suardyti DNR. Šiuo tikslu naudojami skitingi buferiai, kurie apsaugo DNR nuo degradacijos. Temperatūra yra svarbi visiems DNR išskyrimo etapams. Ţema, apie 0̊C, temperatūra turi būti palaikoma procesų metu, o jau išskirtą DNR rekomenduojama saugoti itin ţemoje -70̊C temperatūroje.

2.3.2.Deoksiribonukleininės rūgšties (DNR) skyrimas pasitelkiant DNA salting-out– druskų sodinimo metodą

DNA salting – out metodas: ląstelės surenkamos centrifugavimo metu, suspenduojamos

buferiniame tirpale, jų membranos suardomos detergentais. Baltymai hidrolizuojami proteinaze K, vykdoma deproteinizacija chloroformu ir etaoliu išsodinama DNR.

Tirpalų ruošimas:

 Lizės buferis nr. 1.

Reikalingi reagentai 1 litrui tirpalo:

 8,29g 155 mM amonio chloridas (NH4Cl) „Roti stoch“ (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija);

 1g 10 mM kalio bikarbonatas (KHCO3) (Sigma-ALORICH Chemie GmbH, Vokietija);

 292,20 mg 1 mM etilendiamino – tetraacetatas (EDTA) (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija);

 Distiliuotas H2O.

1. Į 1 litro talpos kolbą supilami pasverti reagentai ir uţpilami distiliuotu H2O iki 1 litro atţymos.

2. Magnetine maišykle tirpalas maišomas kol ištirpsta visi reagentai.

3. Matuojamas buferio pH. Reikiamas tirpalo pH – 7,4 pasiekiamas naudojant NaOH arba HCl tirpalus.

21

 Lizės buferis nr. 2.

Reikalingi reagentai 1 litrui tirpalo:

 584,40 mg 2 mM etilendiamino – tetraacetatas (EDTA) (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija);

 1,576 g 10 mM tris – vandenilio chloridas (Tris HCl) (Carl Roth GmbH + Co, Vokietija);

 23,37 g 400 mM natriochloridas (NaCl) (Merck KgaA, Vokietija);

 Distiliuotas H2O.

1. Į 1 litro talpos kolbą supilami pasverti reagentai ir uţpilami distiliuotu H2O iki 1 litro atţymos.

2. Magnetine maišykle tirpalas maišomas kol ištirpsta visi reagentai.

3. Matuojamas buferio pH. Reikiamas tirpalo pH – 8,2 pasiekiamas naudojant NaOH arba HCl tirpalus.

4. Tirpalą reikia laikyti kambario temperatūroje.

 10% Natrio duodecilsulfato (SDS) tirpalas. Reikalingi reagentai 0,5 litro tirpalo:

 50 g SDS – natrio laurilsulfatas (AppliChem, Vokietija);

 Distiliuotas H2O;

1. Į matavimo indą supilami SDS milteliai ir iki 0,5 l ţymos pilama distiliuoto H2O. 2. Magnetine maišykle tirpalas maišomas kol ištirpsta nuosėdos.

3. Tirpalą reikia laikyti kambario temperatūroje.

 6M NaCl tirpalas:

Reikalingi reagentai 0,5 litro tirpalo:

 175,38 g NaCl (Merck KgaA, Vokietija);

 Distiliuoto H2O.

1. Į matavimo indą supilami NaCl milteliai ir iki 0,5 l ţymos pilama distiliuoto H2O.

2. Magnetine maišykle tirpalas maišomas, tačiau nuosėdos neištirpsta visiškai dėl tirpalo persotinimo.

22 2.3.3. Druskų nusodinimo eiga:

1. Kraujas atšildomas ir iš vakuuminių mėgintuvėlių perpilamas į specialius 15 ml talpos centrifuginius mėgintuvėlius.

2. Pilamas šaltas lizės buferis nr.1 (6 ml) ir taip vykdoma eritrocitų hemolizė. 30 min laikoma šaldytuve, tuomet centrifuguojama 15 min, 2500 – 3000 aps., 4̊ C.

3. Gautas supernatantas nupilamas paliekant nuosėdas, sudarytas iš nusėdusių leukocitų. Kartojami dar 3 – 4 tokie plovimai.

4. Pilamas lizės buferis nr.2 (6 ml), kuris suardo ląstelių sieneles; 400μl paruošto 10% SDS, kuris ardo lipidines membranas; 30 μl proteinazės K, kuri hidrolizuoja baltymus; viskas yra išmaišoma. Per naktį inkubuojama (apie 16 val. 37̊ C, po to 1 val. 56̊ C).

5. Pasibaigus inkubacijai, pridedama 2 ml (6M) NaCl ir išmaišoma. Vyksta baltymų denatūracija, ištirpsta likę lipidai, cholesterolis.

6. Traukos spintoje pilamas chloroformas stabilizuotas su anilenu (Scharlau Chemie S.A., Ispanija) uţdengiama ir išmaišoma.

7. 20 min centrifuguojama 3200 aps. 16̊ C temp. Susidariusį dvifazį tirpalą skiria denatūruotų baltymų plėvė. Apačioje lieka organinė fazė – baltymai, o viršuje atsiskiria vandeninė fazė, kurioje ir yra DNR bei druskos.

8. Supernatantas nusiurbiamas į naujus mėgintuvėlius.

9. DNR išsodinimui naudojamas šaltas 96% etanolis ar izopropanolis, jis pilamas santykiu 1:1. Mėginelis pavartomas ir jame susidaro DNR nuosėdos, primenančios siūlus.

10. DNR nusiurbiama į ependorfinius mėgintuvėlius su 70 % etanoliu, centrifuguojama 1-2min., 14680 aps.

11. Kai etanolis nupilamas, lieka tik DNR. Mėgintuvėliai dedami į termomaišyklę, 37̊ C temp., kad DNR išdţiūtų.

12. Pilama 500 μl eliucijos buferio ir laikoma kambario temperatūroje, kad DNR ištirptų.

2.3.4. DNR koncentracijos matavimai naudojant spektrofotometrą

DNR koncentracijos matuojamos naudojant spektrofotometrą. Mėgintuvėliai su DNR yra dedami į -20̊ C temperatūrą, kur gali būti laikomi neribotą laiką.

DNR koncentracija išmatuota naudojant ,,Agilent Technologies, Cary 60 UV – Vis“spektrofotometrą. Vandeniniuose tirpaluose nustatinėjamas DNR, RNR, monoukleotidų ir oligonukleotidų kiekis, daţnai vietoj vandens naudojami buferinizuoti tirpalai. Kartu nustatinėjant DNR koncentraciją yra nustatomas ir jos švarumas. Tai atliekama matuojant tirpalo optinį tankį

23

atitinkamame ultravioletinių bangų lygyje. Nukleino rūgščių absorbuojamoji šviesa yra 260 nm bangos ilgio ultravioletinė šviesa, o baltymų – 280 nm bangos ilgio ultravioletinė šviesa. Santykis tarp DNR ir baltymų absorbcijos turėtų būti apie 1,8.

2.3.5. Vieno nukleotido polimorfizmo nustatymas TL – PGR (tikro laiko polimerazės grandinės reakcijos) metodu

PGR sudaro trys etapai, kurie kartojasi ciklu:

I etapas – DNR denatūracija. Vyksta 94 – 95 laipniu temperatūroje. Šio etapo metu nutrūksta vandenilinės jungtys esančios tarp azotinių bazių, taip leidţiančios atsiskirti DNR grandinėms. Etapo trukmė – 15 s.

II etapas – pradmenų hibridizacija. Vyksta 40 – 60 laipsnių temperatūroje. Šio etapo metu pradmenys komplementariai jungiasi prie dauginamosios DNR atkarpų. Etapo trukmė – 1 min.

III etapas – elongacija. Vyksta 72 laipsnių temperatūroje. Ši reakcija katalizuojama fermento Taq polimerazės. Taq polimerazė prijungia PGR mišinyje esančius mononukleotidus ir taip sintetinama komplementarioji DNR grandinė.

TL – PGR metodika

X mėginių buvo genotipuota TL – PGR gausintuvu ,StepOne Plus“ (,,Applied Biosystems“, JAV). Naudoti pradmenys su molekuliniais zondais, sukurti kompanijos ,,Applied Biosystems“. Kiekvienai iš reakcijų naudota 1,5 μltiriamųjų DNR ir 8,5 μl PGR reakcijos mišinio. PGR reakcijos mišinio sudėtis ir reakcijos sąlygos pateikiamos lentelėse nr. 1 ir nr. 2.

1 lentelė. TL – PGR mišinio sudedamosios dalys

Reagentai 1 mėg., µl 96 mėg., µl

TaqMan Universal Master Mix II, no UNG

5 480

Zondais žymėti pradmenys (Genotyping Assay)

0,5 48

24 2 lentelė. Optimalios TL – PGR genotipavimo sąlygos

VNP Rinkinys genotipavimui PGR sąlygos

rs56209061 „Applied Biosystem“ 95 laipsn C 10 min 45 ciklai: 1) 92 laipsn C 15 s 2) 60 laipsn C 60 s rs833068 rs10033900 rs1064583 rs8017904 rs3924612 rs1800795 Darbo eiga:

 PGR mišinys yra ruošiamas 96 (jei reikia, maţiau) mėginiams.

 Šis mišinys išpilstomas po 8,5 µl į visus šulinėlius plokštelėje.

 Į 95 šulinėlius (ar atitinkamai maţiau) įpilama po 1 µl tiriamųjų DNR. Į paskutinį šulinėlį pilamas sterilus H2O, kaip neigiama kontrolė.

 Ant plokštelės klijuojama optinė plėvelė. Oro burbuliukų pašalinimui, plokštelė centrifuguojama.

 Plokštelė dedama į tikro laiko termociklerį, jame nustatoma programa polimorfizno nustatymui

„Genotyping“.

 Įvykdţius programą, pateikiami genotipavimo rezultatai (1 paveikslas). Dėl skirtingo detektorių fluorescencijos intensyvumo santykio programa geba nustatyti tiriamųjų genotipus. X ašyje VIC fluorescuojančiais daţais paţymėtas zondas, o Y ašyje FAM daţais paţymėtas molekulinis zondas. Gautieji rezultatai vzėliau naudoti statistinių skaičiavimų metu.

8 paveikslas. Alelių nustatymo rezultatai Žalios spalvos taškai – heterozigotai, mėlyni ir raudoni – homozigotai pagal skirtingus alelius.

25 2.3.6. Statistinė analizė

Statistiškai duomenys apdoroti ir jų analizė atlikta naudojant programinį paketą IBM

SPSS Statistics 25. Surinkti duomenys, jų matuojamųjų reikšmių skirstiniai buvo matuojami

normalumo testais (Šapiro – Vilko ir Kolmogorovo – Smirnovo). Tuomet naudoti Stjudento T ir ANOVA testai tolimesnei duomenų analizei ir grupių lyginimui. Demografiniams rodikliams pasirinkti aprašomosios statistikos rodikliai: medianos ir kvartiliai [36].

Genų polimorfizmų pasiskirstymas tarp tiriamųjų grupių buvo vertintas pagal Hardţio – Vainbergo pusiausvyros dėsnį

.

χ²

skaičiuotas lyginant polimorfizmų pasiskirstymo homogeniškumą atsiţvelgiant į klinikinę ir morfologinę burnos dugno vėţio išraišką. Atliktos dvinarės regresinės logistinės analizės tiriamiesiems polimorfizmams [37]. Hipotezių tikrinimui buvo pasirinktas alpha reikšmingumo lygmuo 0,05. Skirtumas laikytas statistiškai reikšmingu, kai p<0,05.

26

3. REZULTATAI

Šiame tyrime dalyvavo 56 burnos dugno vėţiu sergantys ir 150 kontrolinės grupės asmenų. Tarpusavyje grupės buvo lyginamos pagal tiriamųjų amţių bei lytį. Demografinė charakteristika pateikta 1 lentelėje, kur matoma, jog grupėse nepastebėta statistiškai reikšmingų skirtumų (p>0,05). Net 91,1 % asmenų, sergančių burnos dugno vėţiu, rūko, o liga daugiau nei puse atvejų nustatoma 3-oje ar 4-3-oje stadij3-oje pagal TNM klasifikaciją. Taip pat matoma, kad dauguma (75%) navikų yra apibūdinami, kaip vidutiniškai diferencijuoti.

1 lentelė. Demografinė charakteristika

Burnos dugno vėžys (n=56) Kontrolinė grupė (n=150) P reikšmė Vyrai n (proc.) 39 (69,6) 105 (70,0) 0,716 Moterys n (proc.) 17 (30,4) 45 (30,0) Amžius: min, med,max 27/57/88 27/63/90 0,375 Rūkymas n (proc.) 51 (91,1) - - G n (proc.) 1 2 3 4 1 (1,8) 42 (75,0) 13 (23,2) - - - Stadija 1 2 3 4 - 15 (26,8) 19 (33,9) 22 (39,3) - -

G – morfologinis diferenciacijos laipsnis

6.1. Genų, dalyvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmų genotipų

daţnių analizė sergantiems burnos dugno vėţiu ir kontrolinės grupės

asmenims

Įvertinus polimorfizmų genotipų daţnius tiriamosiose grupėse stebima, jog genotipavimo rezultatus tiriamosiose grupėse stebima, jog genotipai pasiskirstę pagal Hardţio – Vainbergo

27

pusiausvyros dėsnį (1 priedas). Pagal HapMap genotipų pasiskirstymas atitinka HWE, kai p>0,001 [52]. Atlikus VNP genotipų daţnio palygynamąją analizę tarp burnos dugno vėţiu sergančiųjų ir kontrolinės grupės asmenų, nustatyti statistiškai reikšmingi skirtumai tiriant geno KCTD10 polimorfizmą rs56209061 ir geno VEGFA polimorfizmą rs833068. Abiejų šių VNP heterozigotiniai genotipai bei recesyvinio A alelio buvo daţnesni kontrolinėje grupėje (2 lentelė).

2 lentelė. Genotipų analizė tarp sergančiųjų burnosdugno vėžiu ir kontrolinės grupių

SNP Genotipas BDV N (%) Kontrolė N (%) P reikšmė rs56209061 GG 48 (85,7 %) 96 (64,0 %) 0,007 AG 8 (14,3 %) 47 (31,3 %) AA - 7 (4,7 %) Aleliai: A/G 8/104 61/239 0,001 rs833068 GG 30 (53,6%) 40 (26,7 %) 0,001 AG 20 (35,7%) 88 (58,7 %) AA 6 (10,7 %) 22 (14,6%) Aleliai: A/G 32/80 132/168 0,004 rs10033900 GG 15 (26,8 %) 31 (20,7%) 0,256 CG 23 (41,1%) 81(54,0%) CC 18 (32,1 %) 38 (25,3 %) Aleliai: C/G 59/53 157/143 0,949 rs1064583 GG 7 (12,5 %) 8 (5,3%) 0,169 AG 29 (51,8 %) 76 (50,1%) AA 20 (35,7 %) 66 (44,0 %) Aleliai: A/G 69/43 208/92 0,137 rs8017904 GG 5 (8,9 %) 10 (6,7 %) 0,725 AG 25 (44,6 %) 62 (41,3 %) AA 26 (46,4 %) 78 (52,0 %) Aleliai: A/G 77/35 218/82 0,433 rs3924612 GG 6 (10,7 %) 14(9,3%) 0,709 CG 26 (46,4 %) 62 (41,3%) CC 24 (42,9 %) 74 (49,3%) Aleliai: C/G 74/38 210/90 0,443

28

Siekiant įvertinti tiriamų polimorfizmų įtaką burnos dugno vėţio vystymuisi buvo atlikta dvinarės logistinės regresijos analizė. Gauti rezultatai parodė, jog geno KCTD10 polimorfizmo

rs56209061 AG genotipas siejamas su apie 70% sumaţėjusia tikimybe sirgti burnos dugno vėţiu

kodominantiniame modelyje (GS=0,3404; 95% PI:0,1491–0,7775; p=0.011), (GS=0,2963; 95% PI:0,1306 – 0,6723; p=0,004) ir overdominiantiniame modelyje (GS=0,3652; 95% PI: 0,1602 – 0,8328; p=0.017). Tiriant geno VEGFA polimorfizmą rs833068 stebima, jog GA ir AA genotipas lyginant su GG genotipu kodominantiniame modelyje galimybę sirgti burnos dugno vėţiu maţino 0,3 karto (GS=0,3030; 95% PI: 0,1538 – 0,5970; p=0,001), (GS = 0,3636; 95% PI: 0,1312 – 1,0077; p=0,052), Dominantiniame modelyje AG ir AA genotipai lyginant su genotipu GG šią galimybę maţina 0,5 karto (GS=0,5208; 95% PI:0,2930 – 0,9258; p=0,026), overdominantiniame modelyje genotipas AG lyginant su genotipais GG ir AA maţina galimybę 0.3 karto (GS = 0,2652; 95% PI: 0,1372 – 0,5124; p=0,017). Taip pat dvinarė logistinė regresija parodė, jog kiekvienas A alelis yra statistiškai reikšmingai maţina galimybę išsivystyti burno dugno vėţiui (3 lentelė, 2 priedas).

3lentelė. Tiriamųjų polimorfizmų dvinarės logistinės regresijos analizė

Modelis Genotipas GS (95 % CI) P reikšmė

rs56209061 Kodominantinis AG vs. GG AA vs. GG 0,3404 (0,1491 – 0,7775) 0,1326 (0,0074 – 2,3712) 0,011 0,170 Dominantinis AG + AA vs. GG 0,2963 (0,1306 – 0,6723) 0,004 Recesyvinis AA vs. GG + AG 0,1693 (0,0095 – 3,0141) 0,227 Overdominantinis AG vs. GG + AA 0,3652 (0,1602 – 0,8328) 0,017 Adityvinis A 0,4898 (0,2230 – 1,0758) 0,075 rs833068 Kodominantinis AG vs. GG AA vs. GG 0,3030 (0,1538 – 0,5970) 0,3636 (0,1312 – 1,0077) 0,001 0,052 Dominantinis AG + AA vs. GG 0,5208 (0,2930 – 0,9258) 0,026 rs1800795 CC 48 (85,7 %) 129 (86%) 0,818 AC 8 (14,3 %) 20 (13,3%) AA - 1 (0,7%) Aleliai: A/C 8/104 22/278 0,950

29 Recesyvinis AA vs. GG + AG 0,6982 (0,2673 – 1,8236) 0,463

Overdominantinis AG vs. GG + AA 0,2652 (0,1372 – 0,5124) 0,001

Adityvinis A 0,5091 (0,3185 – 0,8138) 0,005

6.2. Genų, dalyvaujančių patologinėje angiogenezėje polimorfizmų genotipų

sąsajų su morfologiniu bei klinikiniu ligos pasireiškimu analizė

Genotipų analizė tarp sergančiųjų burnos dugno vėţiu buvo atlikta ir atsiţvelgiant į klinikinę ligos stadiją (4 lentelė) bei morfologinį diferenciacijos laipsnį G (5 lentelė). Statistiškai reikšmingų skirtumų tarp genotipų išsidėstymo nenustatyta.

4 lentelė. Genotipų analizė pagal klinikinę ligos stadiją

VNP Genotipas Ligos stadija pagal TNM χ2 P reikšmė

2 n (%) 3 n (%) 4 n (%) rs56209061 GG 14(29,2%) 17(35,4%) 17(35,4%) 2,211 0,697 AA - - - AG 1 (12,5%) 2 (25%) 5 (62,5%) rs833068 GG 8 (26,7%) 9 (30%) 13 (43,3%) 0,747 0,945 AA 2 (33,(3)%) 2 (33,(3)%) 2 (33,(3)%) AG 5 (25%) 8 (40%) 7 (35%) rs10033900 GG 5 (33,3%) 6 (40%) 4 (26,7%) 5,365 0,252 CC 3 (16,7%) 4 (22,2%) 11 (61,1%) CG 7 (30,4%) 9 (39,2%) 7 (30,4%) rs1064583 GG 3 (42,9%) - 4 (57,1%) 6,552 0,162 AA 3 (15%) 10 (50%) 7 (35%) AG 9 (31%) 9 (31%) 11 (38%) rs8017904 GG 1 (20%) 1 (20%) 3 (60%) 8,254 0,083 AA 9 (34,6%) 12 (46,2%) 5 (19,2%) AG 5 (20%) 6 (24%) 14 (56%) rs3924612 GG 1 (16,7%) 2 (33,3%) 3 (50%) 6,077 0,194 CC 6 (25%) 12 (50%) 6 (25%) CG 8 (30,8%) 5 (19,2%) 13 (50%) rs1800795 CC 13 (27,1%) 17 (35,4%) 18 (37,5%) 0,503 0,973

30

AA - - -

AC 2 (25%) 2 (25%) 4 (50%)

5 lentelė. Genotipų analizė pagal morfologinį diferenciacijos laipsnį G

VNP Genotipas Morfologija G χ2 P reikšmė 1 n (%) 2 n (%) 3 n (%) rs56209061 GG - 37 (77,1%) 11 (22,9%) 6,207 0,184 AA - - - AG 1 (12,5%) 5 (62,5%) 2 (25%) rs833068 GG - 22 (73,3%) 8 (26,7%) 9,974 0,051 AA 1 (16,7%) 5 (83,3%) - AG - 15 (75%) 5 (25%) rs10033900 GG 1 (6,7%) 12 (80%) 2 (13,3%) 4,429 0,351 CC - 12 (66,7%) 6 (33,3%) CG - 18 (78,3%) 5 (21,7%) rs1064583 GG - 5 (71,4%) 2 (28,6%) 2,01 0,734 AA - 14 (70%) 6 (30%) AG 1 (3,4%) 23 (79,3%) 5 (17,3%) rs8017904 GG - 4 (80%) 1 (20%) 1,216 0,876 AA 1 (3,8%) 19 (73,1%) 6 (23,1%) AG - 19 (76%) 6 (24%) rs3924612 GG - 5 (83,3%) 1 (16,7%) 1,366 0,850 CC - 18 (75%) 6 (25%) CG 1 (3,8%) 19 (73,1%) 6 (23,1%) rs1800795 CC - 37 (77,1%) 11 (22,9%) 6,207 0,184 AA - - - AC 1 (12,5%) 5 (62,5%) 2 (25%)

6.3. Genų, dayvaujančių patologinėje agiogenezėje polimorfizmų genotipų

daţnių analizė atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį ir amţių

31

Trečiasis tyrimo uţdavinys – įvertinti genų dayvaujančių patologinėje agiogenezėje polimorfizmus sergantiems burnos dugno vėţiu atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį ir amţių. Analizuojant geno KCTD10 polimorfizmo rs56209061 genotipų pasiskirstymą tiek tarp vyrų, tiek tarp moterų stebimas skirtumas lyginant sveikus asmenis su sergančiais burnos dugno vėţiu. A alelis reikšmingai daţnesnis abiejų lyčių kontrolinės grupės asmenims (p=0,017 vyrams ir p=0,032 moterims). Taip pat matoma, jog geno VEGFA polimorfizmo rs833068 genotipų daţniai reikšmingai skiriasi tarp sergančių ir sveikų vyrų (p=0,001). Sergantys burnos dugno vėţiu vyrai statistiškai daţniau turi homozigotinį dominantinį genotipą GG, o kontrolinės grupės vyrai - heterozigotinį AG, taip pat tarp kontrolinės grupės vyrų statistiškai daţnesnis A alelis (6 lentelė).

6 lentelė. Genotipų analizė pagal lytį tarp tiriamųjų grupių

S NP Genotipas Vyrai P reikšmė Moterys P reikšmė BDV N (%) Kontrolė N (%) BDV N (%) Kontrolė N(%) rs56209061 GG 34 (87,2%) 70 (66,7%) 0,108 14 (82,4%) 26 (57.8%) 0,145 AG 5 (12,8%) 33 (31,4%) 3 (17,6%) 14(31,1%) AA - 2 (1,9%) - 5 (11,1%) Aleliai: A/G 5/73 37/173 0,017 3/31 24/66 0,032 rs833068 GG 24 (61,5%) 28 (26,7%) 0,001 6 (35,3%) 12 (26,7%) 0,674 AG 11 (28,2%) 64 (61%) 9 (52,9%) 24 (53,3%) AA 4 (10,3%) 13 (12,4%) 2 (11,8%) 9 (20%) Aleliai: A/G 19/59 90/120 0,004 13/21 42/48 0,399 rs10033900 GG 9 (23,1%) 23 (21,9%) 0,179 6 (35,3%) 8 (17,8%) 0,330 CG 16 (41%) 59(56,2%) 7(41,2%) 22 (48,9%) CC 14 (35,9%) 23 (21.9%) 4 (23,5%) 15 (33,3%) Aleliai: C/G 44/34 105/105 0,333 15/19 52/38 0,173 rs1064583 GG 5 (12,8%) 5 (4,8%) 0,108 2 (11,8%) 3 (6,7%) 0,635 AG 22 (56,4%) 52 (49,5%) 7 (41,2%) 24 (53,3%) AA 12 (30,8%) 48 (45,7%) 8 (47%) 18 (40%) Aleliai: A/G 46/32 148/62 0,064 23/11 60/30 0,916 rs801 7904 GG 3 (7,7%) 7 (6,7%) 0,705 2 (11,8%) 3 (6,7%) 0,791 AG 19 (48,7%) 44 (41,9%) 6 (35,3%) 18 (40%)

32

Atsiţvelgus į gautus rezultatus, nuspręsta atlikti dvinarę logistinę regresiją ir išnagrinėti polimorfizmų rs56209061 bei rs833068 įtaką galimybei sirgti burnos dugno vėţiu atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį (6 lentelė). Gauti rezultatai parodė, jog moterų tarpe jokių statistiškai reikšmingų skirtumų nestebima (3 priedas). Tačiau tarp vyrų geno KCTD10 polimorfizmo rs56209061 genotipas AG lyginant su GG buvo statistiškai reikšmingas maţinant minėtąją galimybę apie 0,3 karto (GS=0,3119 ; 95% PI: 0,1118 – 0,8703; p=0,026), taip pat ir genotipai AG ir AA lyginant su GG (GS=0,2941; 95% PI: 0,1058 - 0.8179; p=0,019) bei overdominantinis genotipas (GS=0,3209; 95% PI: 0,1151 – 0,8945; p= 0,030). Šiuo metodu įrodyta ir A alelio statistinė vertė maţinant galimybę sirgti burnos duno vėţiu (GS= 0,3203; 95% PI: 0,1210 – 0,8475; p=0,022). Nagrinėjant geno VEGFA polimorfizmą rs833068, stebima, jog genotipas AG lyginant su genotipu GG taip pat nurodo maţesnę burnos dugno vėţio riziką (GS= 0,3119; 95% PI: 0,1118–0,8703; p=0,001), kaip ir genotipai AG ir AA lyginant su GG (GS=0,2273; 95% PI: 0,1045 – 0,4942; p=0,001) bei overdominantinis genotipas (GS=0,2517; 95% PI: 0,1131 – 0,5602; p=0,001). Kiekvienas A alelis vyrams taip pat maţina galimybę vystytis burnos dugno vėţiui apie 0,4 karto (GS=0,4294; 95% PI:0,2393 – 0,7706; p=0,005). (7 lentelė).

7 lentelė. Tiriamųjų polimorfizmų dvinarės logistinės regresijos analizė tarp vyrų

Modelis Genotipas GS (95 % CI) P reikšmė

rs56209061 Kodominantinis AG vs. GG AA vs. GG 0,3119 (0,1118 - 0,8703) 0,4087 (0,0191 - 8,7480) 0,026 0,567 AA 17 (43,6%) 54 (51,4%) 9 (52,9%) 24 (53,3%) Aleliai: A/G 53/25 152/58 0,460 24/10 66/24 0,760 rs3924612 GG 4(10,3%) 9(8,6%) 0,540 2 (11,8%) 5 (11,1%) 0,973 CG 19 (48,7%) 42 (40%) 7 (41,2%) 20 (44,4%) CC 16 (41%) 54 (51,4%) 8 (47%) 20 (44,4%) Aleliai: C/G 51/27 150/60 0,321 23/11 60/30 0,917 rs1800795 CC 34 (87,2%) 91 (86,7%) 0,997 14 (82,4%) 38 (84,4%) 0,763 AC 5 (12,8%) 14 (13,3%) 3 (17,6%) 6 (13,3%) AA - - - 1 (2,2%) Aleliai: A/C 5/73 14/194 0,924 3/31 8/82 1

33 Dominantinis AG + AA vs. GG 0,2941 (0,1058 - 0,8179) 0,019 Recesyvinis AA vs. GG + AG 0,5241 (0,0246 - 11,1596) 0,679 Overdominantinis AG vs. GG + AA 0,3209 (0,1151 - 0,8945) 0,030 Adityvinis A 0,3203 (0,1210 - 0,8475) 0,022 rs833068 Kodominantinis AG vs. GG AA vs. GG 0,2005 (0,0865 - 0,4647) 0,3590 (0,1032 - 1,2483) 0,001 0,107 Dominantinis AG + AA vs. GG 0,2273 (0,1045 - 0,4942) 0,001 Recesyvinis AA vs. GG + AG 0,8088 (0,2470 - 2,6489) 0,726 Overdominantinis AG vs. GG + AA 0,2517 (0,1131 - 0,5602) 0,001 Adityvinis A 0,4294 (0,2393 - 0,7706) 0,005

Tiriamieji buvo suskirstyti į 4 amţiaus grupes pagal išskaičiuotus kvartilius: I kvartilis 27 - 51 m., II kvartilis 52 – 57 m., III kvartilis 58 – 65 m., IV kvartilis 66 – 88 m. Statistinė analizė atlikta siekiant skirtingose amţiaus grupėse palyginti genotipų ir alelių daţnius tarp pacientų sergančių burnos dugno vėţiu, tačiau jokių statistiškai reikšmingų skirtumų nenustatyta (8 lentelė).

8 lentelė. Genotipų analizė pagal amžių tarp sergančiųjų burnos dugno vėžiu.

VNP Genotipas I grupė N (%) II grupė N (%) III grupė N (%) IV grupė N (%) P reikšmė rs56209061 GG 16 (88,9%) 16 (33,3%) 10 (83,3%) 6(75%) 0,981 AG 2 (11,1%) 2 (11,1%) 2 (16,7%) 2 (25%) AA - - - - Aleliai: A/G 2/34 2/34 2/22 2/14 0,797 rs833068 GG 11 (61,1%) 10 (55,6%) 6 (50%) 3 (37,5%) 0,351 AG 6 (33,3%) 4 (22,2%) 6 (50%) 4 (50%) AA 1 (5,6%) 4 (22,2%) - 1 (12,5%) Aleliai: A/G 8/28 12/24 6/18 6/10 0,596 rs10033900 GG 6 (33,3%) 2(11,1%) 5 (41,7%) 2 (25%) 0,157 CG 7 (38,9%) 7 (38,9%) 3 (25%) - CC 5 (27,8%) 9 (50%) 4 (33,3%) Aleliai: C/G 17/19 25/11 11/13 6/10 0,093 rs 1 0 6 4 5 8 GG 3 2 (11,1%) 3 (16,7%) 1 (8,3%) 1 (12,5%) 0,995

34 AG 9 (50%) 9 (50%) 7 (58,3%) 4 (50%) AA 7 (38,9%) 6 (33,3%) 4 (33,3%) 3 37,5%) Aleliai: A/G 23/13 21/15 15/9 10/6 0,968 rs8017904 GG 2 (11,1%) 3 (16,7%) - - 0,597 AG 7 (38,9%) 8 (44,4%) 7(58,3%) 3 (37,5%) AA 9 (50%) 7 (38,9%) 5 (41,7%) 5 (62,5%) Aleliai: A/G 25/11 22/14 17/7 13/3 0,532 rs3924612 GG 2 (11,1%) - 3 (25%) 1 (12,5%) 0,111 CG 7 (38,9%) 7 (38,9%) 6 (50%) 6 (75%) CC 9 (50%) 11 (61,1%) 3 (25%) 1 (12,5%) Aleliai: C/G 25/11 27/7 9/9 5/5 0,104 rs1800795 CC 16 (88,9%) 16 (88,9%) 9 (75%) 7 (87,5%) 0,963 AC 2 (11,1%) 2 (11,1%) 3 (25%) 1 (12,5%) AA - - - - Aleliai: A/C 2/34 2/34 3/21 1/15 0,722

35

4. REZULTATŲ APTARIMAS

Angiogenezė atlieka itin svarbų vaidmenį naviko augime – tai nustatyta įvairių mokslinių tyrimų duomenimis [39, 40]. Mūsų darbe, tyrėme genų, dalyvaujančių angiogenezėje polimorfizmus, sergantiems burnos dugno vėţiu.

Nustatėme, jog genų polimorfizmų KCTD10 rs5620906 ir VEGFA rs833068 genotipų skirtumai buvo statistiškai reikšmingi tarp sergančiųjų burnos dugno vėţiu bei kontrolinės grupės asmenų. Abiejų šių polimorfizmų AG genotipas yra statistiškai reikšmingai daţnesnis kontrolinėje grupėje (p=0,0214 ir p=0,013). Atlikus dvinarę logistinę regresiją nustatyta, kad geno KCTD10 polimorfizmo rs56209061 AG genotipas siejamas su apie 70% sumaţėjusia tikimybe sirgti burnos dugno vėţiu kodominantiniame modelyje (p=0,011) ir overdominiantiniame modelyje (p=0,017). Tiriant geno VEGFA polimorfizmą rs833068 nustatėme, jog AG ir AA genotipai lyginant su GG genotipu kodominantiniame modelyje, galimybę sirgti burnos dugno vėţiu maţino 0,3 karto (p=0,001; p=0,052). Dominantiniame modelyje AG ir AA genotipai lyginant su genotipu GG šią galimybę maţina 0,5 karto (p=0,026), overdominantiniame modelyje – 0,3 karto (p=0,017). Taip pat nustatyti ir statistiškai reikšmingi skirtumai atsiţvelgiant į vyrišką lytį – nustatyta, jog kiekvienas A alelis maţina galimybę vystytis bunos dugno vėţiui apie 0,4 karto (p=0,005).

Genas KCTD10 nėra plačiai ištirtas ir mokslininkai ieško jo sąsajų su įvairiomis ligomis, tačiau jau yra duomenų apie sutrikusią šio geno reguliaciją ar mutacijas sergant krūtų karcinoma, nutukimu, meduloblastoma ir tam tikromis uţdegiminėmis plaučių ligomis, virškinamojo trakto navikais [25]. Nustatytas KCTD10 ryšys su ląstelių (taip pat ir endotelio) proliferacija bei įtarta, jog galimai šio geno koduojamas baltymas gali veikti kaip tumorsupresorius [41]. Mokslinių tyrimų su mūsų pasirinktuoju VNP KCTD10 rs5620906 tiriant burnos dugno vėţiu sergančiuosius nepavyko rasti.

Yra ţinoma, jog VEGFA geno koduojamas baltymas dalyvauja angiogenezės suţadinime ir yra svarbuspatologinei ir normaliai šio proceso eigai [27]. Atlikti klinikiniai tyrimai patvirtino sąsajas tarp VEGFA koduojamo baltymo koncentracijos ir prognozės tiriant įvairius navikinius susirgimus [42]. Nustatyta, jog didesnė šio geno koduojamo baltymo koncentracija siejama su maţesniu pacientų išgyvenamumu ir didesne metastazių atsiradimo galimybe. Publikacijų, kuriose būtų tiriamos sąsajos tarp mūsų tiriamo VEGFA VNP ir burnos dugno vėţio išsivystymo nebuvo rasta, tad duomenis palyginome su kitų mokslininkų kontrolinių grupių imtimis (9 lentelė).

36 9 lentelė. VEGFA rs833068 genotipų palyginimas įvairiuose tyrimuose, kontrolinėse grupėse

Mūsų atlikto tyrimo duomenys statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kitų mokslininkų atliktų tyrimų rodmenų, tačiau matome, kad polimorfizmų pasiskirstymas skiriasi, galimai dėl etninių, rasių skirtumų, imties dydţių ar kitų prieţasčių.

CFI rs10033900 geno polimorfizmas yra siejamas su imlumu piogeninėms infekcijoms,

predispozicija atipiniam hemolitiniam ureminiam sindromui, mikroangiopatinei hemolizinei anemijai bei su imunokompleksais susijusiu glomerulonefritu. Tai grindţiama komplemento faktoriaus 1 trūkumu [45]. Publikacijų, kuriose nagrinėtas sąsajos tarp mūsų tiriamų VNP ir burnos dugno vėţio išsivystymo nerasta, todėl duomenis palyginome su kontrolinės grupės asmenimis (10 lentelė).

10 lentelė. CFIrs10033900genotipų palyginimas su kitų tyrėjų duomenimis, kontrolinėse grupėse

Duomenys, gauti mūsų atlikto tyrimo metu statistiškai reikšmingai skyrėsi nuo kitų nagrinėtų tyrimų, su kuriais lyginome CFI rs10033900 genotipų pasiskirstymo daţnius. Galimai dėl etninių, rasių skirtumų, imties dydţių ar kitų prieţasčių.

Tyrimas Šalis GG

N (proc.) AG N (proc.)

AA

N (proc.) Viso P reikšmė

1. Mūsų tyrimas Lietuva 40 (26,7) 88 (58,7) 22 ( 14,6) 150

0,001 2. Hussam Al-Kateb ir kiti [43] Indija 85 (45,0) 72 (38,1) 32 (16,9) 189

3. Chen – Huang ir kiti [44] Kinija 81 (57,9) 50 (35,7) 9(6,4) 140

Tyrimas Šalis CC N (proc.) CT N (proc.) TT N (proc.) Viso P reikšmė 1. Mūsų tyrimas Lietuva 31 (20,7) 81 (54,0) 38 ( 25,3) 150 <0,001 2. Cipriani ir kiti [46] Didţioji

Britanija

179 (24,1) 384 (51,6) 181 (24,3) 744

3. Dingguo Qian ir kiti [47]

37

Ţinoma, jog COL10A1 geno mutacijos susijusios su metafizine chondrodisplazija bei su amţiumi susijusia amţine geltonosios dėmės degeneracija [48]. Vykdant išsamią panašių tyrimų paiešką, geno COL10A1 rs106458 polimorfizmo rezultatų nerasta, sergantiems burnos dugno vėţiu asmenims.

RAD51B geno moksliniais tyrimais įrodyta, jog šio geno trūkumas trikdo homologinei

rekombinantinei reparacijai ir tuo pačiu maţina galimybę pataisyti DNR paţeidimus ir išlaikyti chromosomos vientisumą. Šio geno mutacijos imtos sieti su šeiminiu krūtų vėţiu [49]. Duomenų apie polimorfizmo rs801790 genotipavimą nebuvo rasta, sergantiems burnos dugno vėţiu.

Genas RP1L1 yra itin panašus į geną RP1, kurio mutacijos sukelia apie 5-10 % autosominiu dominantiniu būdu paveldimo pigmentinio retinito atvejų. Atlikti tyrimai įrodė, kad RP1L1 dėl savo sekos tapatumo su RP1 taip pat yra predisponuojantis veiksnys paveldimoms tinklainės distrofijoms [33]. Polimorfizmo rs3924612 genotipo tyrimų, sergantiems burnos dugno vėţiu, mūsų duomenimis, nėra atlikta. Lyginamas alelių pasiskirstymo daţnis tarp 5 kontrolinių grupių skirtingose populiacijose [49] (11 lentelė).

11 lentelė. RP1L1 rs3924612alelių dažnio palyginimas įvairių populiacijų kontrolinėse grupėse

Statistiškai reikšmingas skirtumas tarp alelių pasiskirstymo lygintose populiacijose galimas dėl etninių, rasės skirtumų, imties dydţių netolygumo ar kitų prieţasčių.

Genas TIMP3 koduoja svarbų angiogenezės inhibitorių, kurio mutacijos siejamos su Sorsby dugno distrofija. Atlikti tyrimai parodė, kad TIMP3 galimai slopina nuo VEGF priklausančią

Šalis / etninė grupė C N (proc.) G N (proc.) Visotiriamųjų (alelių) P reikšmė 1. Lietuva 210 (70) 90 (30) 150 (300) <0,001 2. Didţioji Britanija 2718 (73,6) 979 (26,4) 1854 (3708) 3. Estija 3100 (69,2) 1380 (30,8) 2240 (4480) 4. Ashkenazi ţydai 245 (81) 57 (19) 151 (302) 5. JAV 737 (88) 101 (12) 419 (838)

38

angiogenezę [35]. Taip pat nustatytas ryšys tarp TIMP3 geno defektų ir kasos endokrininių navikų išsivystymo[50]. Polimorfizmas rs1800795 nebuvo tirtas ţmonėms, sergantiems burnos dugno vėţiu, todėl lyginome jo genotipų pasiskirstymą tarp skirtingų kontrolinių grupių [51] (12 lentelė).

12 lentelė. TIMP3rs1800795genotipų palyginimas įvairių tyrimų kontrolinėse grupėse

Duomenys apie rs1800795genotipo pasiskirstymą statistiškai reikšmingai skiriasi. Galimai dėl etninių skirtumų, imčių netolygumo ar kitų prieţasčių.

Reikalinga atlikti tolimesnius tyrimus su didesne tiriamųjų imtimi.

Tyrimas Šalis GG N (proc.) CG N (proc.) CC N (proc.) Viso P reikšmė 1. Mūsų tyrimas Lietuva 129 (86) 20 (13,3) 1 (0,7) 150 <0,001 2. Moore ir kiti Suomija 196 (23,1) 401 (47,3) 250 (29,6) 847

3. Winchester ir kiti JAV 257 (30,8) 406 (46,7) 141 (22,5) 834

39

5. IŠVADOS

1. Nustatytėme, jog KCTD10 rs5620906 ir VEGFA rs83306 AG genotipas statistiškai reikšmingai daţnesnis kontrolinės grupės asmens lyginant su burnos dugno vėţiu sergančiaisiais.

2. Pasirinktų polimorfizmų, dayvaujančių patologinėje agiogenezėje genotipų pasiskirstimas nebuvo statistiškai reikšmingas lyginantmorfologines bei klinikines burnos dugno vėţio išraiškas.

3. Atsiţvelgiant į tiriamųjų lytį nustayta, jog genų polimorfizmų KCTD10 rs5620906 ir VEGFA rs833068 genotipų A alelis statistiškai reikšmingai daţnesnis tiek vyrams, tiek moterims; su amţiumi susijusių skirtumų nustatyta nebuvo.

40

6. LITERATŪROS SĄRAŠAS

1. Rahman SS, Sarker MK. Clinical profile of oral squamous cell carcinoma patientsattending a tertiary care hospital. Bang Med J Khulna. 2014; 47 : 3-6.

2. Kauppila HJ et al. Toll-like receptor 5 (TLR5) expression is a novel predictive markerfor recurrence and survival in squamous cell carcinoma of the tongue. British Journal of Cancer. 2013; 108, 638– 643.

3. Rafael Lozano, Mohsen Naghavi, Kyle Foreman,Stephen Lim, Kenji Shibuya,VictorAboyans. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analys is for the Global Burden of Disease Study 2010. The Lancet. Volume 380, No. 9859, p2095–2128.

4. Park JH et al. Toll-like receptor 5 activation promotes migration and invasion of salivary gland adenocarcinoma. J Oral Pathol Med . 2011; 40: 187–193.

5. Ram H, Sarkar J, Kumar H, Konwar R, Bhatt ML, Mohammad S. Oral cancer: risk factors and molecular pathogenesis. J Maxillofac Oral Surg. 2011;10(2):132–137.

6. Liutkevičius, V. Matrikso metaloproteinazių raiškos ir jų genų polimorfizmo charakteristika

nepiktybinių gerklų darinių, ikivėžinių būklių bei gerklų vėžio atvejais. Daktaro disertacija, Lietuvos

sveikato mokslų universitetas, 2011 [Elektroninis išteklius] [Tikrinta: 2019-02-14]. Repository.lsmuni.lt. Prieiga internetu: https://repository.lsmuni.lt/handle/1/60204

7. Piagkou, Maria & Demesticha, Theano & Chrissanthou, I & Lappas, D & Piagkos, Giannoulis & Mazarakis, A & Skandalakis, P. (2012). Tongue anatomy and oral cancer: The route of metastasis. Tongue: Anatomy, Kinematics and Diseases. 209-220

8. Guneren, E. Malignant Tumors of the Floor of the Mouth, 2018; [Elektroninis išteklius] [Tikrinta: 2019-01-21] Prieiga internetu: https://emedicine.medscape.com/article/847678-overview

9. La'Porte S, Juttla J, Lingam R. Imaging the Floor of the Mouth and the Sublingual Space. RadioGraphics. 2011;31(5):1215-1230.

10. Irani S. Distant metastasis from oral cancer: A review and molecular biologic aspects. J Int Soc Prev Community Dent. 2016;6(4):265–271.

41

11. Wolff KD, Follmann M, Nast A. The diagnosis and treatment of oral cavity cancer. Dtsch Arztebl Int. 2012;109(48):829–835.

12. Kolokythas A. Long-term surgical complications in the oral cancer patient: a comprehensive review. Part I. J Oral Maxillofac Res. 2010;1(3).

13. X.D.R. Brouha, D.M. Tromp, R. Koole, G.J. Hordijk, J.A.M. Winnubst, J.R.J. de Leeuw, Professional delay in head and neck cancer patients: Analysis of the diagnostic pathway, Oral Oncology, Volume 43, Issue 6, 2007, 551-556.

14. Arya S, Chaukar D, Pai P. Imaging in oral cancers. Indian J Radiol Imaging. 2012;22(3):195–208. 15. MACFEE WF. Carcinoma of the floor of the mouth: clinical observations and surgical treatment.

Ann Surg. 1959;149(2):172–187.

16. Shah JP, Gil Z. Current concepts in management of oral cancer--surgery. Oral Oncol. 2008;45(4-5):394–401.

17. Deleyiannis F, Dunklebarger J, Lee E, Gastman B, Lai S, Ferris R, Myers EN, Johnson J. Reconstruction of the marginal mandibulectomy defect: an update. Am J Otolaryngol Head Neck Med Surg. 2007; 28 (6): 363-6.

18. Huang SH, O'Sullivan B. Oral cancer: Current role of radiotherapy and chemotherapy. Med Oral Patol Oral Cir Bucal. 2013;18(2):e233–e240. Published 2013 Feb 5.

19. Minhas S, Kashif M, Altaf W, Afzal N, Nagi AH. Concomitant-chemoradiotherapy-associated oral lesions in patients with oral squamous-cell carcinoma. Cancer Biol Med. 2017;14(2):176–182. doi:10.20892/j.issn.2095-3941.2016.0096

20. Pace-balzan, Adrian & Rogers, Simon. (2012). Dental rehabilitation after surgery for oral cancer. Current opinion in otolaryngology & head and neck surgery. 20. 109-13. 10.1097/MOO.0b013e32834f5fef.

21. Rogers MS, D'amato RJ. The effect of genetic diversity on angiogenesis. Exp Cell Res. 2006;312(5):561-74.

22. Seaman S, Stevens J, Yang MY, Logsdon D, Graff-Cherry C, St Croix B. Genes that distinguish physiological and pathological angiogenesis. Cancer Cell. 2007;11(6):539–554.

23. Adair TH, Montani JP. Angiogenesis. San Rafael (CA): Morgan & Claypool Life Sciences; 2010. Chapter 1, Overview of Angiogenesis. [online] [Tikrinta: 2019-03-06] Prieiga internetu: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK53238/