DISCUSSIONE
E’ ben noto che i radicali liberi hanno una breve emivita e che i loro effetti biologici si esplicano probabilmente in stretta vicinanza al sito di generazione del radicale libero stesso. In condizioni fisiologiche, la maggior parte dei radicali liberi è subito neutralizzata dai sistemi di difesa delle cellule; quando invece si verifichi uno sbilanciamento tra la produzione e la capacità di neutralizzazione dei radicali liberi l’aumento dello stress ossidativo può causare vari processi degenerativi e diverse patologie.
Diversi sono i modelli di aggressione radicalica utili per studiare i meccanismi della perossidazione lipidica, gli effetti sulle difese antiossidanti e i danni a carico di molte componenti cellulari nel caso di un aumento dello stress ossidativo.
In questo lavoro di ricerca abbiamo utilizzato un sistema di aggressione radicalica costituito da ADP-Fe ed un sistema generante NADPH (Svingen et al., 1979). Da dati riportati in letteratura era noto che tale sistema determina un aumento della perossidazione lipidica in epatociti isolati dimostrabile in primo luogo, attraverso la valutazione del rilascio dei TBArs (Masuda et al., 1991). Tale sistema pro-ossidante, si rivela efficace non solo su epatociti isolati di ratto (Hogberg et al., 1975), ma anche su microsomi (Hirokata et al., 1978) ed in membrane isolate di corteccia cerebrale, cuore e reni di giovani ratti (Rauchova et al., 1993).
Nei nostri esperimenti abbiamo voluto valutare l’azione di questo sistema su tre probabili antiossidanti lipofili di membrana: dolicolo, vitamina E ed ubichinone.
Negli esperimenti da noi effettuati su epatociti di ratti di tre mesi d’età incubati con la soluzione perossidante contenente ADP-Fe e NADPH per 0’, 5’, 10’,20’, l’entità del danno perossidativo è stata valutata misurando la produzione di TBARs rilasciata dalle cellule epatiche nel mezzo di incubazione e valutata come nmoli equivalenti di MDA/g di cellule. Si è reso evidente che il danno perossidativo a carico delle citomembrane cresce in modo rilevante entro i primi minuti dall’incubazione e continua poi ad aumentare in funzione del tempo.
Il comportamento del dolicolo in epatociti esposti all’azione perossidante e la rispettiva cinetica temporale non sono mai stati studiati e non è possibile fare alcun riferimento a dati in letteratura. Il contenuto del dolicolo sembra mantenersi inalterato nei primi cinque minuti d’incubazione; il calo è significativo dopo dieci minuti e aumenta ulteriormente a venti. I nostri risultati indicano che anche il dolicolo si riduce per effetto di questo danno perossidativo e che la cinetica temporale è più lenta di tutti gli altri antiossidanti liposolubili precedentemente trattati.
I risultati ottenuti dimostrano che la concentrazione di vitamina E cala in modo evidente nei primi cinque minuti e continua poi a decrescere, nei successivi minuti d’incubazione. Si può fin da ora affermare che la cinetica temporale di questi cambiamenti è in linea con i dati riportati in letteratura su una scala temporale simile (Noack et al., 1994).
La soluzione perossidante ha avuto effetti anche sui livelli di CoQ9. Il calo della concentrazione del CoQ9 è significativo già entro i primi cinque minuti, ma risulta quantitativamente minore rispetto al calo osservato per la vitamina E. Successivamente i livelli di CoQ9 continuano a diminuire come funzione lineare della durata dell’incubazione. Anche in questo caso la cinetica temporale dei cambiamenti è in linea con quella riportata in letteratura. Sul piano quantitativo in letteratura sono riportate differenze tra i dati ottenuti su frazioni submitocondriali (Forsmark-Andrèe et al., 1997)
o su mitocondri (Noack et al., 1994). Infatti, il calo di α-tocoferolo e di CoQ9 da noi riscontrato con epatociti isolati risulta molto inferiore al calo riscontrato con gli organuli cellulari. A questo proposito, va però osservato, che gli epatociti isolati conservano meccanismi antiossidanti citosolici capaci di rigenerare l’α-tocoferolo a partire dal suo radicale tocoferile; le vitamine A e C e anche lo stesso CoQ, ed è possibile supporre che i meccanismi antiossidanti della vitamina E e dell’ubichinone possano agire in tandem (Stoyanovsky et al., 1995).
Il sistema perossidante determina inoltre un calo del CoQ10 che diventa evidente a partire dei dieci minuti d’incubazione; è opportuno ricordare che nel ratto la concentrazione di CoQ10 è minima rispetto a quella del CoQ9 ed in relazione a ciò si potrebbe ipotizzare che il suo contributo antiossidante sia ridotto in rapporto a quello apportato dall’isoforma più abbondante.
Va ricordato che in questo modello di aggressione radicalica l’insulto perossidativo giunge dall’ambiente extracellulare e che i tre antiossidanti lipofili occupano posizioni differenti all’interno delle membrane.
Attraverso l’uso dell’NMR (risonanza magnetica nucleare), si è dimostrato che solo l’α-tocoferolo si trova nell’interfaccia acqua-lipide della membrana e inoltre che la velocità di ossidazione della vitamina E dovuta ai radicali liberi, dipende molto dalla vicinanza di questa molecola alla zona di generazione dei radicali liberi stessi (Fukuzawa et al., 1997). Il dolicolo è un lipide di membrana che si trova localizzato nella porzione idrofobica del doppio strato lipidico delle citomembrane dove si collocherebbe anche l’ubichinone.
Dai risultati ottenuti si può ipotizzare che gli antiossidanti presi in esame rispondano all’aggressione radicalica seguendo un ordine che tiene conto non solo delle caratteristiche strutturali e funzionali di ciascuna molecola ma anche della localizzazione all’interno del doppio strato lipidico. La vitamina E più vicina alla sorgente radicalica si modifica già nei primi
cinque minuti e va incontro ad un calo più rilevante prima di giungere ad un plateau. Nel sistema da noi utilizzato l’aggressione ossidativa provienente dall’ambiente idrofilo, coinvolgerebbe in misura primaria la vitamina E, che per sua natura si dispone superficialmente al doppio strato lipidico e quindi diviene l’antiossidante maggiormente esposto all’attacco radicalico. Si può ipotizzare che il CoQ9 e il CoQ10, che giacerebbero con la propria coda polisoprenica tra i due foglietti lipidici e si insinuerebbero tra i fosfolipidi con la loro testa idrofila rivolta verso la superficie, rispondano all’agente perossidante più tardivamente ed in misura più contenuta, ma in modo più pronto del dolicolo che giace interamente nello spazio idrofobico. Questa ipotesi è in linea con quanto osservato in precedenti esperimenti. Infatti, Parentini et al. avevano già intrapreso in precedenza lo studio delle organizzazioni e delle interazioni tra antiossidanti lipofili utilizzando come modello di lipoperossidazione sia l’esposizione a raggi UV che genera ROS in maniera casualizzata nello spazio e il trattamento con tetracloruro di carbonio CCl4 che invece genera radicali a livello del sito attivo dell’enzima citocromo P450, in prossimità del reticolo endoplasmatico, in vicinanza della regione centrale del bilayer lipidico dove si colloca il dolicolo.
In epatociti isolati di ratto l’irraggiamento UV causa un aumento della produzione di TBArs ed un rapido declino dei livelli di vitamina E (pari a 65% dopo irraggiamento con 0,2 j/m 2), inoltre, il contenuto di dolicolo cala rapidamente (Parentini et al., 2003). Il declino di questa sostanza segue un decorso temporale molto simile a quello della vitamina E, anche se a prima vista potrebbe sembrare quantitativamente inferiore. Assumendo ciò si dovrebbe concludere che il potenziale antiossidante del dolicolo possa essere inferiore a quello della vitamina E. Va ricordato però che l’irraggiamento UV provoca attivazione dell’enzima HMG-CoA reduttasi, che rappresenta il principale fattore di regolazione nella via di biosintesi di dolicolo, ubichinone e colesterolo. Infatti, l’aggiunta al mezzo
d’incubazione di mevinolina, farmaco che blocca la sintesi di poliprenoidi, causa un chiaro aumento degli effetti degradativi dell’irraggiamento sul dolicolo; da queste considerazioni, si può ipotizzare che il dolicolo sia coinvolto nella protezione delle citomembrane dai raggi UV come la vitamina E. Il comportamento del dolicolo (Parentini et al., 2003) e della vitamina E è stato studiato anche utilizzando il modello di citotossicità epatocitaria da CCl4. I dati ottenuti in precedenza, hanno dimostrato che l’incubazione con questo agente xenobiotico ha un effetto repentino sul dolicolo, causando un calo che è più rapido di quello osservato dopo irraggiamento UV, che è significativo già entro i 5 minuti e che varia in relazione alla dose di CCl4 aggiunta. I risultati rilevano inoltre che l’incubazione causa un aumento praticamente immediato dei livelli di TBArs significativo già a cinque minuti dall’inizio del trattamento. Da tutte queste considerazioni è possibile concludere che anche nel caso del modello d’intossicazione da somministrazione di CCl4, i livelli epatocellulari di dolicolo si riducono contemporaneamente all’aumento dello stress ossidativo. L’entità del calo induce a credere che esso debba coinvolgere il dolicolo di tutte le citomembrane. Considerando l’efficienza della vitamina E nel rompere la catena lipoperossidativa, risulta sorprendente che nel modello di citotossicità da CCl4 i dati indicano chela vitamina E non venga degradata. A questo proposito va ricordatoche la vitamina E si posiziona nelle membrane vicino all’interfaccia con il mezzo acquoso e che nel caso della citotossicità da CCl4 , i radicali tossici si originerebbero in prossimità del citocromo P450 che si trova in profondità nella membrana e quindi in posizione vicina al dolicolo e lontana dell’α- tocoferolo. E’ possibile quindi che il dolicolo in questo modello di aggressione radicalica rappresenti la prima difesa contro agenti ossidanti metabolizzati dal citocromo P450, come ad esempio il CCl4, perchè si trova nella posizione più favorevole per neutralizzare i radicali liberi generati nella profondità delle membrane. Nel loro insieme i dati ottenuti da noi
con l’uso di un sistema perossidante contenente ADP-Fe ed un sistema generante NADPH, confrontati con i risultati di esperimenti precedenti in cui i modelli di aggressione radicalica utilizzati erano i raggi UV e il CCl4, dimostrano che il dolicolo è sempre coinvolto con degradazione, nei processi di difesa contro lo stress ossidativo; il calo registrato è immediato e rilevante nel trattamento con CCl4 è quantitativamente minore negli altri due modelli presi in considerazione, anche se anche in questi casi si dimostra suscettibile alla degradazione ossidativa. Il consumo di vitamina E sembra variare a seconda della natura dell’attacco; è notevole e repentino nel sistema in cui l’aggressione proviene dall’ambiente idrofilo, sembra irrilevante nel trattamento con CCl4, è moderato ma comunque presente nel caso dell’irraggiamento UV. Non esistono dati di confronto per il comportamento dell’ubichinone nel caso di irraggiamento UV e incubazione con CCL4.
